一种基于DNA模板的长链TNA合成方法

一种基于dna模板的长链tna合成方法
技术领域
1.本发明属于非天然核酸tna合成技术领域，涉及一种基于dna模板的长链tna合成方法，更具体的是；涉及一种通过工程化改造的聚合酶以dna模板合成长单链苏糖核酸(tna)的方法。


背景技术：

2.苏糖核酸(tna)是一种非天然核酸，它可与dna或rna形成稳定的双螺旋结构，同时能够储存和传递遗传信息。由于tna化学结构简单，结构与天然核酸不同，因此tna更耐受核酸酶的降解，在苛刻条件下更加稳定，在细胞环境中能更稳定地发挥作用。基于此，tna在生物学、医学领域中有巨大的应用潜力。目前，已有研究筛选得到tna酶和tna适体。
3.固相合成受限于长度，目标tna链越长，合成产率边际递减，成本边际提高。因此，固相合成不适用于长链tna的合成，限制了tna在不同领域的研究。
4.针对以上问题，开发一种成本更低，产率更高，且可以大规模合成tna长链的合成技术是研发重点。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供了一种基于dna模板的长链tna合成方法，具体是一种基于dna模板、通过聚合酶催化的长链tna分子合成方法，该发明可以实现较长的tna链合成，相比于固相合成成本更低、产率更高。
6.技术方案：本发明所述的一种基于dna模板的长链tna合成方法，其具体操作步骤如下：
7.(1)、选择特定的tna的序列；
8.(2)、通过固相合成等方法获得tna对应的dna模板；
9.(3)、配置tna延伸的反应体系，进行tna延伸；
10.(4)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验所获得的tna；
11.(5)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收tna。
12.进一步的，在所述步骤(1)中，选择特定的tna的序列是tna酶、tna适体或是和体内rna形成互补配对可进行基因沉默的tna中的一种；
13.包括核酸酶、干扰序列及适体。
14.进一步的，在所述步骤(2)中，通过固相合成等方法获得tna对应的dna模板具体是通过固相合成获取所需的dna模板，或使用聚合酶合成、酶切等方法获得所需的单链dna片段作为模板。
15.进一步的，在所述步骤(3)中，进行tna延伸的具体操作方法是：
16.首先，利用获得的dna模板和引物，与水和反应缓冲液混合，后在90℃下退火至4℃，置于冰上；
17.然后，加入mn
2
离子和kod-ri dna聚合酶；
mgso4，1％triton，ph＝8.8；
36.加入终浓度为0.25mg/ml的kod-ri dna聚合酶，和终浓度为0.2mm的mncl2，最后加入终浓度为10μm的tntps，在55℃条件下，反应12小时；
37.其中，引物5’端带有荧光基团cy5.5；
38.然后，加入mn
2
离子和kod-ri dna聚合酶；
39.最后，加入苏糖核苷三磷酸(tntps)，在55℃下进行引物延伸反应，即tna转录；
40.(4)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验所获得的tna；具体操作方法是：
41.进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，通过红外荧光扫描成像仪观察dna引物部分有cy5.5荧光基团的tna链延伸情况，检验转录是否成功；
42.具体的是：取0.1pmol得到的tna延伸反应体系，进行20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析延伸反应是否成功进行；
43.(5)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收tna；具体操作方法是：
44.通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，分离dna模板和tna，在紫外光照射下，观察并切下全长tna部分所对应的条带，通过浸泡凝胶回收得到tna分子；
45.具体的是：
46.首先，将所得tna延伸产物，进行20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，在紫外光照下切胶回收对应的tna条带；
47.然后，将凝胶泡在水中，在60℃下，摇晃震动12小时，分离回收水相；
48.最后，将回收的水相进行除盐和冻干，得到tna分子。
49.实施例
50.随机选取质粒pet26b来制备长度为200nt、300nt的dna模板；通过不对称pcr获取单链，然后通过制备的dna模板进行tna的引物延伸，结果显示可通过本方法，可利用kod-ri聚合酶合成长度为300nt的长链tna；整个反应过程如图1所示；
51.1、合成不对成pcr所需的引物
52.表1合成的引物名称及序列
[0053][0054]
其中，t7为质粒pet26b的通用引物，r200、r300分别为下游200bp、300bp位置对应的下游引物；通过调整引物长度，可将其调整为接近的tm值，约为49℃；100tem为通过固相合成直接获得的100nt dna模板；通过固相合成可获得大量上述引物；
[0055]
2、进行不对称pcr：
[0056]
由于较长的dna模板无法固相合成，因此使用不对称pcr的方法制备固定长度的dna单链作为tna引物延伸的模板；
[0057]
按照表2配置不对称pcr的反应体系，随后在pcr仪进行不对称pcr，反应条件为：95℃4min，30
×
【95℃30sec，44℃30sec，72℃30sec】，72℃5min；
[0058]
表2质粒的不对称pcr反应体系
[0059][0060][0061]
3、琼脂糖凝胶电泳切胶回收单链dna：
[0062]
在不对称pcr结束后，进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图2所示；琼脂糖凝胶电泳与marker条带对应的深色条带为双链pcr产物，下方较浅色的为制备所得的单链dna；
[0063]
其中，使用tbe缓冲液配置成的1.5％的琼脂糖凝胶，电泳条件为100v，45min，或延长时间，直至单链与双链分离；
[0064]
借助凝胶成像系统的紫外光照射，利用dna凝胶回收试剂盒，切胶回收单链dna；
[0065]
4、基于dna模板的tna引物延伸：
[0066]
在成功制备模板链后，使用tntp进行引物延伸反应；引物延伸反应体系如表3；
[0067]
其中，10
×
反应缓冲液(thermopol buffer)的配方为:200mm tris-hcl，100mm(nh4)2so4，100mm kcl，20mm mgso4，1％triton x-100，ph 8.8；
[0068]
如需制备多的tna产物，可按比例扩大表3的反应体系；
[0069]
表3引物延伸的反应体系
[0070][0071]
具体操作如下：
[0072]
(1)、混合引物、模板、反应缓冲液和水，加热至90℃5min，然后在10分钟内以10℃/min，退火至4℃，然后置于冰上3min；
[0073]
(2)、退火时，将聚合酶和mncl2预先混合，然后加入至反应体系中；
[0074]
(3)、加苏糖核苷三磷酸(tntp)开始反应；在55℃孵育12h；
[0075]
(4)、反应结束后，取3μl反应体系溶液与20μl终止缓冲液混合，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，检验反应是否成功，电泳功率为60w，时间为1h，通过红外荧光扫描成像仪观察dna引物部分有cy5.5荧光基团的tna链延伸情况，结果如图3；从图中可知，成功制备长度为300nt的tna。由于凝胶较长，因此分为两次拍摄，主要产物在图的上半部分；
[0076]
其中，终止缓冲液(stop buffer)：1
×
tbe，20mm edta，7m urea，ph 8；
[0077]
(5)、再次进行大体系变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0078]
在紫外线照射下，切下300nt tna所在的条带(因为tna的分子量小于对应长度dna，因此在300nt dna条带对应位置下方)。将凝胶泡在水中，在60℃下，摇晃震动12小时，分离回收水相；
[0079]
最后，将回收的水相进行除盐和冻干，得到tna分子。
[0080]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。