含有用具有Fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的定量法的制作方法

含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的定量法
技术领域
1.本发明涉及含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的定量法。


背景技术：

2.近年来，创新药技术开发受到关注，使用分子肽化合物(分子量500～2000)，创新药能够抑制蛋白-蛋白相互作用、针对激动剂、分子伴侣所代表的棘手靶标。这些化合物通常在固相上通过延伸n末端用fmoc基团保护的氨基酸来合成。在药物制备中，从质量管理的角度来看，评价原材料的含量是非常重要的；ichq11要求对gmp下设定为起始物质的原材料制定合适的质量管理項目。以fmoc-氨基酸为起始物质时，其含量通常通过滴定来评价；除此之外，还使用定量nmr。由于测试的简便性，滴定法是最常用的；但是，当其测定物包含羧酸等的酸作为杂质时，则存在失去含量测定准确性的缺点。另外，虽然定量nmr具有能够在官能团水平上直接且准确地测量氢原子核数的优点，但与称为hplc或gc的色谱法不同，它不能分离多个成分。
3.fmoc基团经常用作含有氨基的化合物的保护基。由于该fmoc基团有紫外(uv)吸收，因此可以通过色谱法定量。另外，已知利用除去fmoc基团时产生的二苯并富烯(dibenzofulvene,dbf)来定量聚合物珠上的fmoc基团的负载量的方法(非专利文献1、2、3)。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1.william s.n.等人，biotechnol.bioeng.1998,61,55-60.
7.非专利文献2.laszlo v.等人，j.chromatogr.a 2000,869,171-179.
8.非专利文献3.freeman c.e.等人，talanta 2005,65,574-577.
9.发明概述
10.发明要解决的课题
11.如上所述，fmoc基团可以通过色谱法定量，因为它具有紫外(uv)吸收。但是，同一波长下的摩尔吸光系数因化合物而异，另外，即使在某些条件下摩尔吸光系数相同的化合物，当色谱法中洗脱时的溶剂组成发生变化时，也存在摩尔吸光系数不同的情形，因此，对于要定量的每种化合物，需要准备该化合物的已确认了含量的可信样品(authentic sample)。例如，在通过色谱法对由天然氨基酸组成的fmoc-氨基酸实施定量的情形，由于其fmoc-氨基酸的可信样品已由许多制造商出售，因此可以通过色谱法将可信样品与fmoc-氨基酸比较来进行定量。另一方面，近年正在使用的非天然氨基酸和用fmoc基团保护的肽的情形，由于难以获得其氨基酸或肽的可信样品，因此，在用色谱法测定时，需要逐一合成这些可信样品并确认含量。
12.另外，上述现有技术文献评价了聚合物珠上的fmoc基团的负载量，但是，它是包含具有fmoc基团的其他杂质的定量评估，进一步地，除去fmoc基团而生成的二苯并富烯是不稳定分子，随着时间的推移而降解，因此成为含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的
化合物的定量精度降低的原因。
13.本发明是鉴于这样的情况而完成的，本发明的一个课题在于提供只要存在一个含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的可信样品即可以将含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物定量至制备药物上所需的小数点后第1位的方法。
14.用于解决课题的手段
15.作为上述课题的解决手段，本发明人们发现了以下内容，从而完成了本发明。
16.1)发现了定量含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的新方法，其不是通过定量含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物本身，而是通过定量自该化合物除去具有fmoc骨架的保护基后由此产生的二苯并富烯或其衍生物的含量的间接方法。
17.2)发现了基于粗产物中含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的纯度、以及除去具有fmoc骨架的保护基后产生的二苯并富烯或其衍生物的含量，含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的含量可以计算至药物原料质量管理所要求的小数点后第1位。
18.3)通过使纯度的测定条件与二苯并富烯或其衍生物的测定条件相同，能够误差小地计算出准确的含量。
19.4)发现了具有fmoc骨架的保护基的脱保护反应的反应率为100％；副反应几乎为0％的反应条件，能够更准确地定量。
20.5)发现了通过将具有fmoc骨架的保护基除去后所产生的二苯并富烯或其衍生物与酸混合，提高了二苯并富烯或其衍生物的稳定性，从而可以计算出更接近真实值的值。
21.即，本发明包括以下内容。
22.本发明涉及以下含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的定量法。
23.(a1)定量粗产物中包含的、含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物(以下有时称为第一fmoc化合物)的含量的方法，该方法包括：
24.用碱将保护基自溶液(以下有时称为第一溶液)中第一fmoc化合物脱保护，和定量由此产生的二苯并富烯或其衍生物的含量。
25.(a2)(a1)所述的方法，其进一步包括用碱将保护基自溶液(以下有时称为第二溶液)中作为可信样品使用的含有具有fmoc骨架的保护基的氨基的化合物(以下有时称为第二fmoc化合物)脱保护，和定量由此产生的二苯并富烯或其衍生物的含量，
26.其中，通过比较第一溶液中二苯并富烯或其衍生物的含量和第二溶液中二苯并富烯或其衍生物的含量，计算相对于第二fmoc化合物，第一fmoc化合物的含有率(重量％)。
27.(a3)(a2)所述的方法，其中，脱保护反应在第一溶液和第二溶液中定量地进行。
28.(a4)(a1)至(a3)中任一项所述的方法，其中，通过测定二苯并富烯或其衍生物的峰面积，定量二苯并富烯或其衍生物的含量。
29.(a5)(a2)至(a4)中任一项所述的方法，其进一步包括用粗产物的fmoc纯度校正含有率，其中，“fmoc纯度”是第一fmoc化合物的含量与粗产物中所含的所有种类的用具有fmoc骨架的保护基保护的化合物的含量之和的比值。
30.(a6)(a5)所述的方法，其中基于(i)第一fmoc化合物的峰面积和(ii)粗产物中第一fmoc化合物以外的用具有fmoc骨架的保护基保护的化合物的各峰面积，计算fmoc纯度。
31.(a7)(a2)至(a6)中任一项所述的方法，其进一步包括用内标准物质校正含有率。
32.(a8)(a7)所述的方法，其包括比较第一溶液中包含的内标准物质(以下有时称为第一内标准物质)的含量和第二溶液中包含的内标准物质(以下有时称为第二内标准物质)的含量。
33.(a9)(a8)所述的方法，其中，通过测定第一内标准物质的峰面积和第二内标准物质的峰面积，分别定量第一和第二内标准物质的含量。
34.(a10)(a8)～(a9)中任一项所述的方法，其中，第一和第二内标准物质独立地选自蒽、菲、萘、苯、甲苯、三亚苯和并四苯。
35.(a11)(a8)～(a10)中任一项所述的方法，其中，第一和第二内标准物质是蒽。
36.(a12)(a4)、(a6)、(a9)中任一项所述的方法，其中，通过色谱法测定各峰面积。
37.(a13)(a12)所述的方法，其中，色谱法是液相色谱法或气相色谱法。
38.(a14)(a12)或(a13)所述的方法，其中，用相同的测定条件测定各峰面积。
39.(a15)(a1)至(a14)中任一项所述的方法，其中，具有fmoc骨架的保护基由下式(1)表示：
[0040][0041]
(式中，
[0042]
r1～r8独立地选自氢、c
1-c8烷基、c
1-c8氟烷基、卤素、磺基和三甲基甲硅烷基，
[0043]
r9～r
10
独立地是氢或甲基)。
[0044]
(a16)(a1)至(a15)中任一项所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基是fmoc基团、fmoc(2,7tb)基、fmoc(1me)基、fmoc(2f)基、fmoc(2,7br)基、mio-fmoc基团、dio-fmoc基团、tdf-fmoc基团、fmoc(2tms)基、fmoc(2so3h)基、sm-fmoc基团、或rm-fmoc基团。
[0045]
(a17)(a1)至(a16)中任一项所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基是fmoc基团。
[0046]
(a18)(a1)至(a17)中任一项所述的方法，其中，第一fmoc化合物和/或第二fmoc化合物不负载于固相。
[0047]
(a19)(a1)至(a18)中任一项所述的方法，其中，第一fmoc化合物和/或第二fmoc化合物是用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸、肽或低分子有机化合物。
[0048]
(a20)(a1)至(a19)中任一项所述的方法，其中，第一fmoc化合物和/或第二fmoc化合物是用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸或肽。
[0049]
(a21)(a19)或(a20)所述的方法，其中，上述氨基酸是α-氨基酸或β-氨基酸。
[0050]
(a22)(a19)至(a21)中任一项所述的方法，其中，上述氨基酸主链羧基是游离羧基。
[0051]
(a23)(a19)或(a20)所述的方法，其中，上述肽包含α-氨基酸和/或β-氨基酸、或由α-氨基酸和/或β-氨基酸组成。
[0052]
(a24)(a1)至(a23)中任一项所述的方法，其中，上述碱是有机碱。
[0053]
(a25)(a1)至(a24)中任一项所述的方法，其中，上述碱是选自由胺、具有脒骨架的碱和具有胍骨架的碱组成的组中的至少一种碱。
[0054]
(a26)(a24)所述的方法，其中，上述有机碱选自由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、2,3,6,7-四氢-1h,5h-9-氮杂苯并[ij]喹啉、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、1,8-双(四甲基胍基)萘、三乙胺、三甲胺、1-甲基哌啶、n,n'-二甲基哌嗪、n-甲基吗啉、n-乙基吗啉、对二甲基氨基吡啶、哌啶、吗啉、二环己胺、对二甲氨基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、哌嗪和四丁基氟化铵组成的组。
[0055]
(a27)(a1)至(a26)中任一项所述的方法，其中，上述碱是包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱。
[0056]
(a28)(a27)所述的方法，其中，上述包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱选自由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、2,3,6,7-四氢-1h,5h-9-氮杂苯并[ij]喹啉、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、1,8-双(四甲基胍基)萘、三乙胺、三甲胺、1-甲基哌啶、n,n'-二甲基哌嗪、n-甲基吗啉、n-乙基吗啉和对二甲基氨基吡啶组成的组。
[0057]
(a29)(a27)所述的方法，其中，上述包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。
[0058]
(a30)(a1)至(a29)中任一项所述的方法，其进一步包括在除去具有fmoc骨架的保护基后，向第一和/或第二溶液添加酸。
[0059]
(a31)(a30)所述的方法，其中，上述酸是有机酸和/或无机酸。
[0060]
(a32)(a31)所述的方法，其中，上述有机酸选自由柠檬酸、草酸、马来酸、四甲基硫酸氢铵、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、一氟乙酸、二氟乙酸、三氯乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸或它们的组合组成的组。
[0061]
(a33)(a31)或(a32)所述的方法，其中，上述无机酸选自由磷酸、硼酸、盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、膦酸或它们的组合组成的组。
[0062]
(a34)(a1)～(a33)中任一项所述的方法，其中，第一和/或第二溶液的溶剂是非质子性极性溶剂。
[0063]
(a35)(a34)所述的方法，其中，上述非质子性极性溶剂是dmf、dma、nmp、dmso或乙腈。
[0064]
(a36)(a1)至(a35)中任一项所述的方法，其中，在0℃～50℃的反应温度脱保护保护基。
[0065]
(a37)(a2)至(a36)中任一项所述的方法，其中，含有率(重量％)通过下式计算：
[0066][0067]
(式中，
[0068]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0069]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0070]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0071]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积)；
[0072]
或通过下式计算：
[0073][0074]
(式中，
[0075]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0076]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0077]
iss是第二溶液的内标准物质的峰面积；
[0078]
is
t
是第一溶液的内标准物质的峰面积；
[0079]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0080]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积)；
[0081]
或通过下式计算：
[0082][0083]
(式中，
[0084]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0085]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0086]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0087]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0088]
ps是fmoc纯度)；
[0089]
或通过下式计算：
[0090][0091]
(式中，
[0092]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0093]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0094]
iss是第二溶液的内标准物质的峰面积；
[0095]
is
t
是第一溶液的内标准物质的峰面积；
[0096]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0097]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0098]
ps是fmoc纯度)。
[0099]
另外，本发明还涉及以下稳定二苯并富烯或其衍生物的方法。
[0100]
(b1)稳定粗产物中包含的二苯并富烯或其衍生物的方法，所述方法包括混合二苯并富烯或其衍生物和酸。
[0101]
(b2)(b1)所述的方法，所述方法包括混合自含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物(以下有时称为fmoc化合物)除去该具有fmoc骨架的保护基而产生的二苯并富烯或其衍生物和酸。
[0102]
(b3)(b2)所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基由下式(1)表示：
[0103]
(式中，
[0104]
r1～r8独立地选自氢、c
1-c8烷基、c
1-c8氟烷基、卤素、磺基和三甲基甲硅烷基，
[0105]
r9～r
10
独立地是氢或甲基)。
[0106]
(b4)(b2)或(b3)所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基是fmoc基团、fmoc(2,7tb)基、fmoc(1me)基、fmoc(2f)基、fmoc(2,7br)基、mio-fmoc基团、dio-fmoc基团、tdf-fmoc基团、fmoc(2tms)基、fmoc(2so3h)基、sm-fmoc基团、或rm-fmoc基团。
[0107]
(b5)(b2)至(b4)中任一项所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基是fmoc基团。
[0108]
(b6)(b2)至(b5)中任一项所述的方法，其中，上述fmoc化合物是不负载于固相的用具有fmoc骨架的保护基保护的低分子有机化合物。
[0109]
(b7)(b2)至(b6)中任一项所述的方法，其中，上述fmoc化合物是用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸、肽或低分子有机化合物。
[0110]
(b8)(b2)至(b7)中任一项所述的方法，其中，上述fmoc化合物是用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸或肽。
[0111]
(b9)(b7)或(b8)所述的方法，其中，上述氨基酸是α-氨基酸或β-氨基酸。
[0112]
(b10)(b7)或(b8)所述的方法，其中，上述肽包含α-氨基酸和/或β-氨基酸、或由α-氨基酸和/或β-氨基酸组成。
[0113]
(b11)(b2)所述的方法，其中，上述酸是有机酸和/或无机酸。
[0114]
(b12)(b11)所述的方法，其中，上述有机酸选自由柠檬酸、草酸、马来酸、四甲基硫酸氢铵、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、一氟乙酸、二氟乙酸、三氯乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸或它们的组合组成的组。
[0115]
(b13)(b11)所述的方法，其中，上述无机酸选自由磷酸、硼酸、盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、膦酸或它们的组合组成的组。
[0116]
另外，本公开涉及以下稳定剂。
[0117]
(c1)用于稳定二苯并富烯或其衍生物的稳定剂。
[0118]
(c2)(c1)所述的稳定化剂，其是酸。
[0119]
(c3)(c2)所述的稳定化剂，其中，上述酸是有机酸和/或无机酸。
[0120]
(c4)(c3)所述的稳定化剂，其中，上述有机酸选自由柠檬酸、草酸、马来酸、四甲基硫酸氢铵、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、一氟乙酸、二氟乙酸、三氯乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸或它们的组合组成的组。
[0121]
(c5)(c3)所述的稳定化剂，其中，上述无机酸选自由磷酸、硼酸、盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、膦酸或它们的组合组成的组。
[0122]
或者，本公开涉及以下的含有氨基的化合物的定量法。
[0123]
(d1)定量自粗产物中包含的、含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物(以下有时称为fmoc化合物)产生的含有氨基的化合物的含量的方法，该方法包括：定量通过自fmoc化合物除去具有fmoc骨架的保护基而产生的含有氨基的化合物的含量。
[0124]
(d2)(d1)所述的方法，其中，通过色谱法测定上述含有氨基的化合物的含量。
[0125]
(d3)(d2)所述的方法，其中，上述色谱法是亲水性相互作用色谱法(hilic)。
[0126]
(d4)(d2)至(d3)中任一项所述的方法，其中，上述色谱法的检测器是带电粒子检测器(cad)和/或质谱仪。
[0127]
(d5)(d1)至(d4)中任一项所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基由下式(1)表示：
[0128][0129]
(式中，
[0130]
r1～r8独立地选自氢、c
1-c8烷基、c
1-c8氟烷基、卤素、磺基和三甲基甲硅烷基，
[0131]
r9～r
10
独立地是氢或甲基)。
[0132]
(d6)(d1)至(d5)中任一项所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基是fmoc基团、fmoc(2,7tb)基、fmoc(1me)基、fmoc(2f)基、fmoc(2,7br)基、mio-fmoc基团、dio-fmoc基团、tdf-fmoc基团、fmoc(2tms)基、fmoc(2so3h)基、sm-fmoc基团、或rm-fmoc基团。
[0133]
(d7)(d1)至(d6)中任一项所述的方法，其中，上述具有fmoc骨架的保护基是fmoc基团。
[0134]
(d8)(d1)至(d7)中任一项所述的方法，其中，上述fmoc化合物不负载于固相。
[0135]
(d9)(d1)至(d8)中任一项所述的方法，其中，上述fmoc化合物是用具有fmoc骨架的保护基保护的、氨基酸、肽或低分子有机化合物。
[0136]
(d10)(d1)至(d9)中任一项所述的方法，其中，上述fmoc化合物是用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸或肽。
[0137]
(d11)(d9)或(d10)所述的方法，其中，上述氨基酸是α-氨基酸或β-氨基酸。
[0138]
(d12)(d9)或(d10)所述的方法，其中，上述肽包含α-氨基酸和/或β-氨基酸、或由α-氨基酸和/或β-氨基酸组成。
[0139]
(d13)(d9)至(d12)中任一项所述的方法，其中，上述氨基酸主链羧基是游离羧基。
[0140]
(d14)(d1)至(d13)中任一项所述的方法，其中，用碱除去上述具有fmoc骨架的保护基。
[0141]
(d15)(d14)所述的方法，其中，上述碱是有机碱。
[0142]
(d16)(d14)或(d15)所述的方法，其中，上述碱是选自由胺、具有脒骨架的碱和具有胍骨架的碱组成的组中的至少一种碱。
[0143]
(d17)(d15)所述的方法，其中，上述有机碱选自由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、2,3,6,7-四氢-1h,5h-9-氮杂苯并[ij]喹啉、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷
(dabco)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、1,8-双(四甲基胍基)萘、三乙胺、三甲胺、1-甲基哌啶、n,n'-二甲基哌嗪、n-甲基吗啉、n-乙基吗啉、对二甲基氨基吡啶、哌啶、吗啉、二环己胺、对二甲氨基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、哌嗪和四丁基氟化铵组成的组。
[0144]
(d18)(d14)至(d17)中任一项所述的方法，其中，上述碱是包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱。
[0145]
(d19)(d18)所述的方法，其中，上述包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱选自由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、2,3,6,7-四氢-1h,5h-9-氮杂苯并[ij]喹啉、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、1,8-双(四甲基胍基)萘、三乙胺、三甲胺、1-甲基哌啶、n,n'-二甲基哌嗪、n-甲基吗啉、n-乙基吗啉和对二甲基氨基吡啶组成的组。
[0146]
(d20)(d18)或(d19)所述的方法，其中，上述包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。
[0147]
发明效果
[0148]
根据本发明的方法，可以以高精度且容易地定量分析样品中包含的、含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的含量。因此，本发明可以是一种非常有用的技术，用于以制造药物所需的质量水平定量上述化合物。
[0149]
附图简述
[0150]
[图1]图1是显示实施例1中的标准溶液(fmoc-gly-oh经dbu处理的溶液)的色谱图。
[0151]
[图2]图2是显示实施例1中包含粗fmoc-nme-val-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0152]
[图3]图3是显示实施例1中包含粗fmoc-pro-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0153]
[图4]图4是显示实施例1中包含粗fmoc-nme-ala-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0154]
[图5]图5是显示实施例1中包含粗fmoc-ile-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0155]
[图6]图6是显示实施例1中包含粗fmoc-nme-leu-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0156]
[图7]图7是显示实施例1中包含粗fmoc-nme-gly-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0157]
[图8]图8是显示实施例2中的标准溶液(fmoc-gly-oh经dbu处理的溶液)的色谱图。
[0158]
[图9]图9是显示实施例2中包含粗fmoc-val-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0159]
[图10]图10是显示实施例2中包含粗fmoc-phe-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0160]
[图11]图11是显示实施例2中包含粗fmoc-nme-val-oh的样品溶液经dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0161]
[图12-1]图12-1是对实施例3中包含粗fmoc-val-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。
[0162]
[图12-2]图12-2是图12-1的一部分区间的放大图。
[0163]
[图13]图13是显示对实施例3中包含粗fmoc-val-oh的样品溶液，在dbu处理前的该样品溶液的色谱图。
[0164]
[图14]图14是显示对实施例3中包含粗fmoc-val-oh的样品溶液，在dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0165]
[图15-1]图15-1是对实施例3中包含粗fmoc-phe-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。
[0166]
[图15-2]图15-2是图15-1的一部分区间的放大图。
[0167]
[图16]图16是显示对实施例3中包含粗fmoc-phe-oh的样品溶液，在dbu处理前的该样品溶液的色谱图。
[0168]
[图17]图17是显示对实施例3中包含粗fmoc-phe-oh的样品溶液，在dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0169]
[图18-1]图18-1是对实施例3中包含粗fmoc-nme-val-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。。
[0170]
[图18-2]图18-2是图18-1的一部分区间的放大图。
[0171]
[图19]图19是显示对实施例3中包含粗fmoc-nme-val-oh的样品溶液，在dbu处理前的该样品溶液的色谱图。
[0172]
[图20]图20是显示对实施例3中包含粗fmoc-nme-val-oh的样品溶液，在dbu处理后的该样品溶液的色谱图。
[0173]
[图21]图21是显示比较实施例5中使用通过本发明的dbf的定量法计算出的各fmoc-氨基酸的含有率和通过定量nmr计算出的各fmoc-氨基酸的含有率的图。
[0174]
[图22]图22是显示实施例6中h-nme-gly-oh的标准溶液的色谱图。
[0175]
[图23]图23是显示实施例6中包含粗fmoc-nme-gly-oh的样品溶液经dbu处理后，该样品溶液的色谱图。
[0176]
[图24]图24是比较实施例6中h-nme-gly-oh的标准溶液的色谱图和dbu处理后的包含粗fmoc-nme-gly-oh的样品溶液的色谱图的图。
[0177]
[图25]图25是显示实施例7中的标准溶液(fmoc-gly-oh经dbu处理的溶液)的色谱图。
[0178]
[图26]图26是显示实施例7中包含粗fmoc-phe-phe-oh的样品溶液经dbu处理的溶液的色谱图。
[0179]
[图27]图27是显示实施例7中包含粗fmoc-gly-gly-oh的样品溶液经dbu处理的溶液的色谱图。
[0180]
[图28]图28是显示实施例7中包含粗fmoc-gly-leu-oh的样品溶液经dbu处理的溶液的色谱图。
[0181]
[图29]图29是显示实施例7中包含粗fmoc-gly-bala-oh的样品溶液经dbu处理的
溶液的色谱图。
[0182]
[图30]图30是对实施例7中包含粗fmoc-phe-phe-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。
[0183]
[图31]图31是对实施例7中包含粗fmoc-gly-gly-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。
[0184]
[图32]图32是对实施例7中包含粗fmoc-gly-leu-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。
[0185]
[图33]图33是对实施例7中包含粗fmoc-gly-bala-oh的样品溶液，比较dbu处理前和处理后的各样品溶液的色谱图。
具体实施方式
[0186]
(缩写)
[0187]
本说明书中使用的符号、缩写的意思如下所示。
[0188]
fmoc：9-芴基甲氧羰基
[0189]
dbf：二苯并富烯
[0190]
dbu：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
[0191]
dmf：n,n-二甲基甲酰胺
[0192]
dma：n,n-二甲基乙酰胺
[0193]
nmp：n-甲基吡咯烷酮
[0194]
dmso：二甲基亚砜
[0195]
tfa：三氟乙酸
[0196]
tfe：2,2,2-三氟乙醇
[0197]
tms：三甲基甲硅烷基
[0198]
ch3cn：乙腈
[0199]
na2so4：硫酸钠
[0200]
pip：哌啶
[0201]
hilic：亲水性相互作用色谱
[0202]
cad：带电气溶胶检测器(charged aerosol detector)
[0203]
hplc：高效液相色谱
[0204]
gc:气相色谱
[0205]
pda：光电二极管阵列(photodiode array)
[0206]
gly：甘氨酸
[0207]
ala：丙氨酸
[0208]
val：缬氨酸
[0209]
leu：亮氨酸
[0210]
ile：异亮氨酸
[0211]
met：蛋氨酸
[0212]
phe：苯丙氨酸
[0213]
tyr：酪氨酸
[0214]
trp：色氨酸
[0215]
his：组氨酸
[0216]
lys：赖氨酸
[0217]
arg：精氨酸
[0218]
ser：丝氨酸
[0219]
thr：苏氨酸
[0220]
asp：天冬氨酸
[0221]
glu：谷氨酸
[0222]
asn：天冬酰胺
[0223]
gln：谷氨酰胺
[0224]
cys：半胱氨酸
[0225]
pro：脯氨酸
[0226]
cha：环己基丙氨酸
[0227]
cleu：环亮氨酸
[0228]
nme：n-甲基
[0229]
bala：β-丙氨酸
[0230]
在某个实施方案中，本发明涉及定量粗产物中或分析样品中的含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物(以下有时称为第一fmoc化合物)含量的方法。
[0231]
在某个实施方案中，上述方法包括：用碱将保护基自溶液(以下有时称为第一溶液)中第一fmoc化合物脱保护，和定量由此产生的二苯并富烯或其衍生物的含量。
[0232]
在某个实施方案中，上述方法进一步包括：用碱将保护基自与第一溶液不同的溶液(以下有时称为第二溶液)中作为可信样品使用的含有具有fmoc骨架的保护基的氨基的化合物(以下称为第二fmoc化合物)脱保护，和定量由此产生的二苯并富烯或其衍生物的含量。在这种情况下，可以通过比较第一溶液中二苯并富烯或其衍生物的含量和第二溶液中二苯并富烯或其衍生物的含量，计算相对于第二fmoc化合物，第一fmoc化合物的含有率(重量％)。
[0233]
本发明中的“分析样品”是指包含含有这样的氨基的化合物的样品，所述氨基是用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基。作为分析样品，优选使用通过利用过滤或吸附、重结晶、蒸馏、提取、色谱法等除去了来自分析样品的杂质和水分、有机盐、无机盐、残留溶剂等杂质的粗产物。
[0234]
本发明中的“含量”是指分析样品(粗产物)中或溶液中所含的任意物质的量，例如，含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物、含有氨基的化合物(脱保护体)、二苯并富烯或其衍生物、内标准物质等的量。
[0235]
本发明中的“含有氨基的化合物”是指具有伯氨基和/或仲氨基的任意化合物。对含有氨基的化合物中含有的氨基的个数没有特别限制，优选地为1个～2个，更优选地为1个氨基。作为含有氨基的化合物，可以例举例如氨基酸、肽、低分子有机化合物等。含有氨基的化合物可以负载于、也可以不负载于固相(例如，固相合成用树脂)。
[0236]
在本说明书中，对“固相合成用树脂”没有特别限制，只要它能够用于通过固相法合成肽化合物。作为这样的固相合成用树脂，具体地能够例举例如ctc树脂、wang树脂、
sasrin树脂、三苯甲基氯树脂(trt树脂)、4-甲基三苯甲基氯树脂(mtt树脂)、4-甲氧基三苯甲基氯树脂(mmt)等在酸性条件可以除去的树脂。可以根据使用的氨基酸侧的官能团合适地选择树脂。例如，当使用羧酸(主链羧酸或由asp或glu表示的侧链羧酸)或芳环上的羟基(由tyr表示的酚基)作为氨基酸侧的官能团时，优选使用三苯甲基氯树脂(trt树脂)或2-氯三苯甲基氯树脂(ctc树脂)作为树脂。当使用脂肪族羟基(由ser或thr表示的脂肪族醇基)作为氨基酸侧的官能团时，优选使用三苯甲基氯树脂(trt树脂)、2-氯三苯甲基氯树脂(ctc树脂)或4-甲基三苯甲基氯树脂(mtt树脂)作为树脂。另外，本说明书中存在将树脂记载为“resin”的情形。
[0237]
对构成树脂的聚合物的种类也没有特别限制。对于由聚苯乙烯构成的树脂的情形，可以使用100-200目或200-400目中的任一者。另外，对交联率也没有特别限制，但优选1％dvb(二乙烯基苯)交联的那些。另外，构成树脂的聚合物的种类可以例举tentagel或chemmatrix。
[0238]
本说明书中的“氨基酸”可以是“天然氨基酸”或“氨基酸类似物”。在本说明书中，“氨基酸”、“天然氨基酸”、“氨基酸类似物”有时也分别称为“氨基酸残基”、“天然氨基酸残基”、“氨基酸类似物残基”。
[0239]“天然氨基酸”是指蛋白质中所含的20种氨基酸，为α-氨基羧酸(α-氨基酸)。具体地，是指gly、ala、ser、thr、val、leu、ile、phe、tyr、trp、his、glu、asp、gln、asn、cys、met、lys、arg、pro。
[0240]
对“氨基酸类似物”没有特别限制，包含β-氨基酸、γ-氨基酸、d型氨基酸、n-取代氨基酸、α,α-二取代氨基酸、羟基羧酸和非天然型氨基酸(侧链与天然不同的氨基酸：例如，非天然型的α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸)。在α-氨基酸的情形，可以是d型氨基酸，也可以是α,α-二烷基氨基酸。在β-氨基酸或γ-氨基酸的情形，与α-氨基酸同样地，也允许任意立体构型。对氨基酸侧链的选择没有特别限制，除了氢原子之外，它们还自由地选自例如烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基。它们也可以分别具有取代基，这些取代基还可以自由地选自任意官能团，包含例如n原子、o原子、s原子、b原子、si原子、p原子(即，任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等)。
[0241]
氨基酸的主链氨基可以是未取代的(nh2基)，也可以是取代的(即，-nhr基：r是例如任选地具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基或环烷基；另外，也可以如脯氨酸那样地与n原子键合的碳链和在α位的碳原子形成环)。这样的主链氨基被取代的氨基酸在本说明书中称为“n-取代氨基酸”。作为本说明书中的“n-取代氨基酸”，优选地可以例示n-烷基氨基酸(例如，n-c
1-c6烷基氨基酸、n-c
1-c4烷基氨基酸、n-甲基氨基酸等)、n-环烷基氨基酸、n-环烷基烷基氨基酸、n-芳基氨基酸、n-芳烷基氨基酸等，但不限于此。
[0242]
氨基酸的主链羧基可以是未取代的(羧基：cooh基)，或者也可以形成酯基(即，-coor基：r是例如任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基或环烷基)。这样的主链羧基形成酯基的氨基酸在本说明书中称为“氨基酸酯”。作为本说明书中的“氨基酸酯”，可以例示氨基酸c
1-10
烷基酯、氨基酸苄基酯、氨基酸[2,4-二(c
1-c
25
烷氧基)苯基]甲酯、氨基酸(3,4,5-三c
1-c
25
烷氧基苯基)甲酯、氨基酸甲酯、氨基酸乙酯、氨基酸叔丁酯、氨基酸三苯甲基酯、氨基酸(3,4,5-三-十八氧基苯基)甲酯、氨基酸[2-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)-9-(3-氟苯基)芴-9-基]酯、[2,4-二(二十二烷氧基)苯基]甲酯等，但不限于此。
[0243]
氨基酸的主链羧基也可以形成酰胺基(即，-conr1r2基：r1和r2独立地选自例如氢、任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基和环烷基)。这样的主链羧基被酰胺基取代的氨基酸在本说明书中称为“氨基酸酰胺”。作为本说明书中的“氨基酸酰胺”，可以例示氨基酸c
1-c
10
烷基酰胺、氨基酸苄基酰胺、氨基酸双[4-(二十二烷氧基)苯基]甲基酰胺(ajiphase(注册商标))等，但不限于此。
[0244]
在本说明书中，“侧链”在氨基酸的侧链或环状肽的环状部分的侧链等的上下文中使用，是指不包含在各主链结构中的部分。
[0245]
在本说明书中，“肽”包含连接两个以上氨基酸的直链状或环状的肽，且氨基酸可以是“天然氨基酸”，也可以是“氨基酸类似物”。
[0246]
构成肽的“天然氨基酸”、“氨基酸类似物”包含分别对应于它们的所有同位素。“天然氨基酸”、“氨基酸类似物”的同位素是其中至少一个原子被原子序数(质子数)相同但质量数不同(质子数和中子数的和)的原子取代。作为构成本发明的肽的“天然氨基酸”和“氨基酸类似物”中所含的同位素的例子，有氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分别包含2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、
18
o、
32
p、
35
s、
18
f、
36
cl等。
[0247]
在本发明中，“有机化合物”是指包含碳的化合物。
[0248]
在本发明中，“低分子有机化合物”是指分子量小的包含碳的化合物，其分子量优选为1500道尔顿以下。
[0249]
在本发明中，“具有fmoc骨架的保护基”是指fmoc基团或在fmoc基团的构成骨架的任意位置引入了任意取代基的基团。作为这样的具有fmoc骨架的保护基，具体地可以例举下式(1)所示的保护基：
[0250][0251]
(式中，
[0252]
r1～r8独立地选自氢、c
1-c8烷基、c
1-c8氟烷基、卤素、磺基和三甲基甲硅烷基；
[0253]
r9～r
10
独立地是氢或甲基)。
[0254]
作为具有fmoc骨架的保护基，更具体地可以例举例如9-芴基甲氧羰基(fmoc)、2,7-二叔丁基-fmoc(fmoc(2,7tb))基、1-甲基-fmoc(fmoc(1me))基、2-氟-fmoc(fmoc(2f))基、2,7-二溴-fmoc(fmoc(2,7br))基、2-单异辛基-fmoc(mio-fmoc)基、2,7-二异辛基-fmoc(dio-fmoc)基、2,7-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)-fmoc(tdf-fmoc)基、2,7-双(三甲基甲硅烷基)-fmoc(fmoc(2tms))基、(2-磺基-9h-芴-9-基)甲氧羰基(fmoc(2so3h))、[(1s)-1-(9h-芴-9-基)乙氧基]羰基(sm-fmoc)、[(1r)-1-(9h-芴-9-基)乙氧基]羰基(rm-fmoc)等。用于引入这些具有fmoc骨架的保护基的试剂可以购买或通过已知方法合成。
[0255]
在本发明中，“含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物”是指含有氨基的化合物所具有的伯氨基和/或仲氨基中的至少一个氨基用具有fmoc骨架的保护基保护的
化合物。
[0256]
在本发明中，“用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸”是指主链和/或侧链的氨基中的至少一个氨基用具有fmoc骨架的保护基保护的天然氨基酸或氨基酸类似物。
[0257]
在本发明中，“含有用fmoc基团保护的氨基的化合物”是指含有氨基的化合物所具有的伯氨基和/或仲氨基中的至少一个氨基用fmoc基团保护的化合物。
[0258]
在本发明中，“用fmoc基团保护的氨基酸”是指主链和/或侧链的氨基中的至少一个氨基用fmoc基团保护的天然氨基酸或氨基酸类似物。存在将用fmoc基团保护的氨基酸、用fmoc基团保护的天然氨基酸、用fmoc基团保护的氨基酸类似物分别称为“fmoc-氨基酸”、“fmoc-天然氨基酸”、“fmoc-氨基酸类似物”的情形。
[0259]
以下例示了本发明可利用的用fmoc基团保护的氨基酸，但不限于此。许多这些用fmoc基团保护的氨基酸可以侧链被保护或未保护、胺部位被保护或未保护的状态购买。无法购买的用fmoc基团保护的氨基酸可以通过已知方法合成。
[0260][0261]
在本发明中，“用具有fmoc骨架的保护基保护的肽”是指包含上述“用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸”的肽。作为这样的肽，可以例举例如包含上述用具有fmoc骨架的保护基保护的天然氨基酸和用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基酸类似物中的任一者或两者的、具有两个以上氨基酸的二肽或寡肽。
[0262]
在本发明中，“用fmoc基团保护的肽”是指包含上述“用fmoc基团保护的氨基酸”的肽。作为这样的肽，可以例举例如包含上述用fmoc基团保护的天然氨基酸和用fmoc基团保护的氨基酸类似物中的任一者或两者的、具有两个以上氨基酸的二肽或寡肽。
[0263]
在本说明书中，“烷基”是指从脂肪烃中去除任意一个氢原子而衍生的一价基团，涵盖骨架中不含有杂原子(是指除碳和氢原子以外的原子)或不饱和碳-碳键的、含有氢和碳原子的烃基或烃基结构的子集。该烷基包含直链或支链烷基。烷基是1～20个碳原子数(c
1-c
20
，下文中，“c
p-c
q”是指p～q个碳原子数)的烷基，优选地可以例举c
1-c
10
烷基、c
1-c8烷基、c
1-c6烷基、c
1-c4烷基等。具体地，烷基可以例举甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、仲丁基、1-甲基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1,1,
2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、异戊基、新戊基等。
[0264]
本说明书中的“氟烷基”是指上述“烷基”的一个或多个氢原子用氟原子取代了的基团，优选地可以例举c
1-c8氟烷基、c
1-c6氟烷基、c
1-c4氟烷基、c
1-c2氟烷基等。具体地，氟烷基可以例举三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、五氟乙基、2,2,3,3-四氟丙基、七氟丙基、三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、五氟乙氧基、2,2,3,3-四氟丙氧基、七氟丙氧基、3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基等。
[0265]
本说明书中的“环烷基”是指饱和或部分饱和的环状单价脂肪族烃基，包含单环、双环、螺环。优选地可以例举c
3-c8环烷基。环烷基可以是部分不饱和的。具体地，环烷基可以例举例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
[0266]
本说明书中的“环烷基烷基”是指上述定义的“烷基”中的任意氢原子被上述定义的“环烷基”取代的基团。优选地，环烷基烷基可以例举c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、c
3-c6环烷基c
1-c4烷基等。具体地，可以例举例如环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。
[0267]
本说明书中的“芳基”是指单价芳烃环，优选地可以例举c
6-c
10
芳基。具体地，芳基可以例举例如苯基、萘基(例如，1-萘基、2-萘基)等。
[0268]
本说明书中的“杂芳基”是指在构成环的原子中(在本说明书中也称为“环内”)优选地含有1～4个杂原子的芳香族性环的一价基团，其可以是部分饱和的。环可以是单环或两个单环的稠合环(例如，与苯或单环杂芳基稠合的双环杂芳基)。构成环的原子数优选地为5～10(5～10元环杂芳基)。具体地，杂芳基可以例举例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基等。
[0269]
本说明书中的“芳烷基(芳基烷基)”是指同时包含芳基和烷基的基团，例如，上述烷基的至少一个氢原子被芳基取代的基团，优选地，可以例举“c
6-c
10
芳基c
1-c6烷基”。例如，可以例举苄基、苯乙基等。
[0270]
本说明书中的“烯基”是具有至少一个双键(两个相邻的sp2碳原子)的一价基团。根据双键和取代基(存在的情形)的排列，双键的几何学形式可以是entgegen(e)或zusammen(z)、顺式或反式排列。作为烯基，可以例举直链状或支链状烯基，包含含有内部烯烃的直链等。优选地可以例举c
2-c
10
烯基，更优选地c
2-c6烯基。具体地，这样的烯基可以例举例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包含顺式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、己烯基等。
[0271]
本说明书中的“炔基”是具有至少一个三键(两个相邻的sp碳原子)的一价基团。可以例举直链状或支链状炔基，包含内部亚烷基。优选地可以例举c
2-c
10
炔基，更优选地c
2-c6炔基。具体地，炔基可以例举例如乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基等。
[0272]
本说明书中的“烷氧基”是指与上述定义的“烷基”键合的氧基，可以例举例如1～20个碳原子数(c
1-c
20
)的烷氧基。具体地，烷氧基可以例举例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、(3,7,11,15-四甲基十六烷基)氧基
等。
[0273]
卤素可以例举氟(-f)、氯(-cl)、溴(-br)、碘(-i)等。
[0274]
本说明书中的“磺基”是由-so3h表示的基团。
[0275]
本说明书中的“三甲基甲硅烷基”是由-si(ch3)3或tms表示的基团。
[0276]
在某个实施方案中，第一溶液包含粗产物、溶剂、碱，所述粗产物包含欲计算含量的、含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物(第一fmoc化合物)。第一溶液中可以包含内标准物质。在第一溶液中发生具有fmoc骨架的保护基的脱保护反应。在通过固相法合成用具有fmoc骨架的保护基保护的肽的情形，本发明的方法可以包括在去保护步骤之前，从树脂中切出负载于固相合成用树脂的肽化合物而得到上述肽的步骤。在本说明书中，第一溶液有时称为“样品溶液”。另外，在本说明书中，脱保护反应前的样品溶液有时称为“未反应”样品溶液，在与该术语一起使用时，术语“样品溶液”有时指脱保护反应后的溶液。优选地定量进行在第一溶液中的脱保护反应。
[0277]
在某个实施方案中，第二溶液包含作为可信样品使用的、含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物(第二fmoc化合物)、溶剂和碱。第二溶液中可以包含内标准物质。第二fmoc化合物只要能够确定其准确的含量就没有限制，例如，使用纯度和/或含量为100％或接近100％的化合物。具体地，第二fmoc化合物可以例举由许多供应商出售的。氨基用fmoc基团保护的甘氨酸(fmoc-gly-oh)，但不限于此。与第一溶液同样地，第二溶液也发生具有fmoc骨架的保护基的脱保护反应。在本说明书中，第二溶液有时称为“标准溶液”。另外，在本说明书中，脱保护反应前的标准溶液有时称为“未反应”标准溶液，在与该术语一起使用时，术语“标准溶液”有时指脱保护反应后的溶液。优选地定量进行在第二溶液中的脱保护反应。
[0278]
在第一溶液和/或第二溶液中可以使用溶解分析样品和作为可信样品使用的第二fmoc化合物的任意溶剂，可以优选使用例如乙腈、dmf、dma、nmp、dmso等非质子性极性溶剂。在第一溶液和/或第二溶液中使用的溶剂可以相同或不同，但优选使用相同的溶剂。
[0279]
在本说明书中，“除去”和“脱保护”是指用具有fmoc骨架的保护基保护的伯氨基和/或仲氨基不受该保护基保护的状态。
[0280]
在某个实施方案中，具有fmoc骨架的保护基可以通过固相反应或液相反应除去。另外，含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物可以负载在固相上，也可以不负载在固相上，优选不负载在固相上。
[0281]
在某个实施方案中，可以通过在碱存在下，在0℃～溶剂沸点附近的温度，优选地在0℃～80℃的温度，更优选地在0～50℃的温度，将反应混合物搅拌和/或静置1分钟～5天来除去具有fmoc骨架的保护基。在该反应中，可以加入也可以不加入不参与除去反应的内标准物质。
[0282]
在某个实施方案中，具有fmoc骨架的保护基的除去可以使用能够除去保护基的任意碱。这样的碱可以例举有机碱或无机碱，优选有机碱。
[0283]
在某个实施方案中，有机碱可以例举1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、2,3,6,7-四氢-1h,5h-9-氮杂苯并[ij]喹啉、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、1,8-双(四甲基胍基)萘、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、三乙胺、三甲胺、1-甲基哌啶、n,
n'-二甲基哌嗪、n-甲基吗啉、n-乙基吗啉、对二甲基氨基吡啶等含有叔胺的碱，除这些之外，有机碱还可以例举哌啶、吗啉、二环己胺、对二甲氨基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、哌嗪、四丁基氟化铵等，但不限于此。这些有机碱中，优选包含一种或多种叔胺但不包含伯胺和仲胺的有机碱，更优选1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)。
[0284]
在某个实施方案中，本发明可以使用能够完全除去具有fmoc骨架的保护基的任意等量碱。具体地，溶液中可以使用0.1～20v/v％、优选地1～10v/v％、更优选地1～4v/v％的碱。
[0285]
本说明书中的“二苯并富烯或其衍生物”是指除去具有fmoc骨架的保护基时产生的、下式(2)所示的化合物：
[0286][0287]
(式中，r1～r
10
与式(1)所示的具有fmoc骨架的保护基的各r1～r
10
同义)。r1～r
10
均为氢的下式(3)所示的化合物是“二苯并富烯”：
[0288][0289]
在某个实施方案中，在本发明中，可以通过比较第一溶液中二苯并富烯或其衍生物的含量和第二溶液中二苯并富烯或其衍生物的含量，计算相对于第二fmoc化合物，第一fmoc化合物的含有率(重量％)。
[0290]
在某个实施方案中，可以通过色谱法将第一溶液中和/或第二溶液中的二苯并富烯或其衍生物与第一溶液中和/或第二溶液中的其他成分分离，可以通过相同方法定量其含量。
[0291]
色谱法可以使用能够分离含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物、含有氨基的化合物(脱保护体)、二苯并富烯(dbf)或其衍生物、和内标准物质的任意方法。这样的色谱法可以例举例如液相色谱法、超临界流体色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、亲水性相互作用色谱法(hilic)、离子交换色谱法(iex)、尺寸排阻色谱法(sec)等色谱法、电泳法、离子迁移率光谱法(例如，离子迁移率)等；优选液相色谱法、气相色谱法、电泳法、或离子迁移率光谱法。另外，液相色谱法优选高效液相色谱法(hplc)、超高效分离液相色谱法(uplc)。这些方法可以是公知的。
[0292]
正相液相色谱法可以使用例如二氧化硅、氧化铝等固定相和己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、异丙醇、乙醇、甲醇、四氢呋喃和这些的混合溶剂等流动相，通过公知的方法进行。
[0293]
反相液相色谱可以通过公知方法进行。反相液相色谱的固定相可以使用例如用疏水化合物修饰的填充剂，具体地例如用疏水化合物修饰的硅胶。反相液相色谱法的流动相可以使用例如有机溶剂、水溶液和它们的混合溶剂。有机溶剂可以例举例如乙腈、甲醇、乙
醇、异丙醇等。有机溶剂中也可以包含甲酸、三氟乙酸、乙酸等酸。水溶液可以例举例如水、甲酸水溶液、甲酸铵水溶液、三氟乙酸水溶液、乙酸水溶液、乙酸铵水溶液、碳酸氢铵水溶液、氨水、缓冲液等。另外，还可以在溶剂中追加烷基磺酸钠和其盐、四烷基铵或三烷基胺和其盐等离子对试剂。由此，在峰分离较差的情形，可以提高分析柱的分离能力。在液相色谱法中，当流动相是混合溶剂的情形，可以阶段性地或连续地改变混合比。液相色谱法的温度条件和流动相的流量可以根据二苯并富烯或其衍生物、内标准物质等的性质合适地设定。
[0294]
可以使用任意方法鉴定和定量含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物、二苯并富烯(dbf)或其衍生物、和内标准物质。这样的方法可以例举例如使用紫外可见光吸收检测器、二极管阵列检测器(pda)、荧光检测器、示差折光率检测器、蒸发光散射检测器、带电粒子检测器(cad)、质谱仪等的方法。从高灵敏度和高选择性检测的角度来看，优选使用紫外可见光吸收检测器。因此，包括于本发明方法的分离定量方法更优选地使用组合了液相色谱(lc)和紫外可见光吸收检测器的lc-uv、lc-pda等来进行。
[0295]
第一溶液(样品溶液)或第二溶液(标准溶液)中的二苯并富烯或其衍生物可以通过上述色谱法测定其峰面积并定量。
[0296]
在某个实施方案中，基于内标准(内部标准)，校正相对于第二fmoc化合物，第一fmoc化合物的含有率。即，作为校正第一溶液(样品溶液)和第二溶液(标准溶液)向色谱的注入量的内标准，可以通过在这些溶液中包含内标准物质，更准确地定量第一和第二fmoc化合物。基于内标准的校正可以通过例如在第一溶液(样品溶液)和/或第二溶液(标准溶液)的制备时添加内标准物质并静置，并在保护基除去后产生的二苯并富烯或其衍生物的定量结果(实测值)中考虑内标准物质的含量而实施。更具体地，例如，可以通过将第一溶液中包含的内标准物质(有时称为第一内标准物质)的含量与第二溶液中包含的内标准物质(有时称为第二内标准物质)的含量进行比较来校正含有率。添加内标准物质的时机不限于第一溶液(样品溶液)和/或第二溶液(标准溶液)的制备时，也可以是除去保护基后添加内标准物质。
[0297]
只要能够通过色谱法与二苯并富烯(dbf)或其衍生物分离，则内标准物质可以使用任意物质。这样的内标准物质例如，可以使用市售的物质，具体地，可以例举例如蒽、菲、萘、苯、甲苯、三亚苯、并四苯等。其中，优选蒽。
[0298]
第一溶液(样品溶液)或第二溶液(标准溶液)中内标准物质的含量可以通过色谱法测定其峰面积来定量。内标准物质的峰面积优选地在与二苯并富烯(dbf)或其衍生物的峰面积相同的测定条件下测定。
[0299]
在某个实施方案中，相对于第二fmoc化合物，第一fmoc化合物的含有率(重量％)使用
[0300]
1)第一溶液(样品溶液)和第二溶液(标准溶液)的二苯并富烯或其衍生物的峰面积(a
t
和as)，和
[0301]
2)使用第一溶液(样品溶液)中假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的粗产物浓度(c
t
)和第二溶液(标准溶液)中第二fmoc化合物的浓度(cs)，
[0302]
通过以下计算式可以计算：
[0303]
[0304]
(式中，
[0305]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0306]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0307]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0308]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积)。
[0309]
具体而言，可以根据粗产物的称量值和第一fmoc化合物的分子量计算c
t
。
[0310]
另外，当第一fmoc化合物是通过固相法合成的fmoc-肽时，将固相合成用树脂负载的fmoc肽化合物视为第一fmoc化合物，可以求得c
t
。具体地，可以基于例如固相合成用树脂负载的fmoc肽化合物的称量值和fmoc肽的分子量来计算c
t
。
[0311]
另外，在某个实施方案中，相对于第二fmoc化合物，第一fmoc化合物的含有率(重量％)在进行了通过内标准物质校正的情形，可以进一步使用第一溶液(样品溶液)和第二溶液(标准溶液)的内标准物质的峰面积(is
t
和iss)，通过以下计算式计算：
[0312][0313]
(式中，
[0314]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0315]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0316]
iss是第二溶液的内标准物质的峰面积；
[0317]
is
t
是第一溶液的内标准物质的峰面积；
[0318]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0319]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积)。
[0320]
在某个实施方案中，通过粗产物的fmoc纯度可以校正上述含有率。在此，“fmoc纯度”是指相对于粗产物中所含的所有种类的、用具有fmoc骨架的保护基保护的化合物的含量之和，第一fmoc化合物的含量的比值(％)。通过实施该校正，可以消除粗产物(分析样品)中的含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物以外的、具有fmoc骨架的保护基的化合物(杂质)所引起的误差，由此更准确地计算含有率。
[0321]
具体而言，可以基于(i)第一fmoc化合物的峰面积和(ii)粗产物中第一fmoc化合物以外的用具有fmoc骨架的保护基保护的化合物(有时称为其他fmoc化合物或fmoc相关杂质)的各峰面积来计算fmoc纯度。当粗产物中存在多种fmoc相关杂质时，优选使用可检测到的全部fmoc相关杂质的峰面积来计算fmoc纯度。
[0322]
更具体地，例如fmoc纯度可以通过
[0323]
(i)用色谱法鉴定第一fmoc化合物和fmoc相关杂质对应的峰
[0324]
(ii)求得第一fmoc化合物和fmoc相关杂质的峰面积，并对这些值进行加和；和
[0325]
(iii)将第一fmoc化合物的峰面积除以(ii)中求得的加和值，
[0326]
而求得。
[0327]
通过色谱分析中的uv色谱图(254nm)判断有无具有fmoc骨架的保护基，可以鉴定是否为fmoc相关杂质峰。
[0328]
通过固相法制备第一fmoc化合物(例如，fmoc肽)时，利用自固相合成用树脂切出第一fmoc化合物所使用的溶液(切出溶液)，经求得第一fmoc化合物和fmoc相关杂质的峰面
积，可以求得fmoc纯度。
[0329]
在与二苯并富烯或其衍生物或内标准物质的定量相同的测定条件下，通过测定第一fmoc化合物和fmoc相关杂质的峰面积求得fmoc纯度，可以误差小地计算出准确的含有率。在某个实施方案中，通过使求纯度所用的测定仪器和测定条件与二苯并富烯或其衍生物的定量所用的测定仪器和测定条件相同，可以误差更小地计算出准确的含有率。
[0330]
在通过fmoc纯度进行校正时，含有率例如可以通过以下的计算式求出。
[0331]
(不使用内标准物质校正时)
[0332][0333]
(式中，
[0334]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0335]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0336]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0337]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0338]
ps是fmoc纯度)。
[0339]
(使用内标准物质校正时)
[0340][0341]
(式中，
[0342]cs
是第二fmoc化合物的摩尔浓度；
[0343]ct
是假设粗产物仅由第一fmoc化合物组成时的该粗产物的摩尔浓度；
[0344]
iss是第二溶液的内标准物质的峰面积；
[0345]
is
t
是第一溶液的内标准物质的峰面积；
[0346]as
是第二溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0347]at
是第一溶液的二苯并富烯或其衍生物的峰面积；
[0348]
ps是fmoc纯度)。
[0349]
在某个实施方案中，可以使用酸用来防止二苯并富烯或其衍生物的降解。可以通过使产生的二苯并富烯或其衍生物与酸接触来实现二苯并富烯或其衍生物的降解抑制(稳定化)。酸优选地可以例举有机酸、无机酸，且可以使用有机酸、无机酸和它们的组合。
[0350]
在添加酸的情形，可以在具有fmoc骨架的保护基除去后，向分析样品(例如，第一和/或第二溶液)中添加酸。优选在除去后立即加入酸以防止二苯并富烯降解。酸的量可以使用任意量，只要标准溶液或样品溶液相对于中性偏酸性，例如，添加与为了除去保护基而添加的碱相同的或更多的等量酸可以实现这一点。酸可以直接添加到分析样品中，也可以在酸溶解于有机溶剂等中之后添加到分析样品中。
[0351]
作为有机酸，可以使用柠檬酸、草酸、马来酸、四甲基硫酸氢铵、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、一氟乙酸、二氟乙酸、三氯乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸或它们的组合，优选使用柠檬酸。
[0352]
作为无机酸，可以使用磷酸、硼酸、盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、膦酸或它们的组合，优选使用磷酸。
[0353]
在某个实施方案中，本发明涉及通过定量脱保护后的含有氨基的化合物来定量含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的方法。
[0354]
在某个实施方案中，本发明涉及从含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物除去具有fmoc骨架的保护基，定量由此产生的含有氨基的化合物的方法。
[0355]
在某个实施方案中，上述方法可以通过色谱法将含有氨基的化合物与其他成分分离，并测量其峰面积来定量其含量。
[0356]
在某个实施方案中，对于通过色谱法分离含有氨基的化合物，可以使用能够分离含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物、二苯并富烯(dbf)或其衍生物和含有氨基的化合物的任意方法。这样的色谱法可以例举例如液相色谱法、超临界流体色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、亲水性相互作用色谱法(hilic)、离子交换色谱法(iex)、尺寸排阻色谱法(sec)等色谱法、电泳法、离子迁移率光谱法(例如，离子迁移率)等；优选亲水性相互作用色谱法(hilic)。这些方法可以是公知的。
[0357]
对于含有氨基的化合物的鉴定和定量方法，可以使用任意方法。这样的方法可以例举例如使用紫外可见光吸收检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光率检测器、蒸发光散射检测器、带电粒子检测器(cad)、质谱仪等的方法。优选使用即使当化合物不吸收紫外可见光波长时也能检测到该化合物的带电粒子检测器(cad)和/或质谱仪。因此，包括于本发明方法的分离定量方法更优选地使用组合了亲水性相互作用色谱法(hilic)和带电粒子检测器(cad)的hilic-cad等来进行。
[0358]
第一溶液(样品溶液)或第二溶液(标准溶液)中的含有氨基的化合物的含量可以通过测定自上述色谱法获得的含有氨基的化合物的峰面积来定量。
[0359]
另外，在本说明书中引用的所有现有技术文献通过引用并入本说明书作为参考。
[0360]
实施例
[0361]
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的内容并非仅限于以下的实施例。
[0362]
在本实施例中描述的定量中使用了以下fmoc-氨基酸。
[0363]
fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-val-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-cleu-oh、fmoc-nme-gly-oh、fmoc-nme-ala-oh、fmoc-nme-leu-oh、fmoc-nme-val-oh、fmoc-nme-cha-oh、fmoc-aze-oh。它们是从渡边化学工业等原材料制造商处购买的。除非另有说明，相同的fmoc-氨基酸包括不同的原材料制造商和批次。
[0364]
实施例1(通过dbf对fmoc-氨基酸的定量-1)
[0365]
标准溶液的制备
[0366]
fmoc-gly-oh(约10mg)按照日本药典精密称量，向溶解于乙腈(20ml)中制备的fmoc-gly-oh溶液(包含500ug/ml浓度fmoc-gly-oh的乙腈溶液)添加内部标准溶液(包含250ug/ml浓度蒽的乙腈溶液)、dbu溶液(包含10v/v％浓度dbu的乙腈溶液)和乙腈，制备分别包含100ug/ml浓度fmoc-gly-oh、50ug/ml浓度蒽、4v/v％浓度dbu的乙腈溶液。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的标准溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“标准溶液”。另外，标准溶液的制备中使用的fmoc-gly-oh(纯度99.8％，含水量小于0.10％)购自渡边化学工业。
[0367]
样品溶液的制备
[0368]
包含定量对象fmoc-氨基酸的粗fmoc-氨基酸(约10mg)按照日本药典精密称量，向溶解于乙腈(20ml)中制备的粗fmoc-氨基酸溶液(包含500ug/ml浓度粗fmoc-氨基酸的乙腈溶液)添加内部标准溶液(包含250ug/ml浓度蒽的乙腈溶液)、dbu溶液(包含10v/v％浓度dbu的乙腈溶液)和乙腈，制备分别包含100ug/ml浓度粗fmoc-氨基酸、50ug/ml浓度蒽、4v/v％浓度dbu的乙腈溶液。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的样品溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“样品溶液”。
[0369]
分析装置和分析条件如下。
[0370]
(分析装置)
[0371]
hplc系统：h级(waters)
[0372]
·
紫外可见光吸收检测器：acq-tuv
[0373]
·
泵：acq-qsm
[0374]
·
自动进样器：acq-ftn
[0375]
(分析条件)
[0376]
柱：osaka soda capcell core adme(2.1x150mm，2.7um)
[0377]
流动相a：0.05％tfa/水
[0378]
流动相b：0.05％tfa/乙腈
[0379]
流速：0.3ml/min
[0380]
柱温度：40℃
[0381]
样品注入量：2ul
[0382]
测定波长：254nm
[0383]
梯度条件：见表1
[0384]
[表1]
[0385]
时间(分钟)b(％)0302070221002410024.1302830
[0386]
图1显示了标准溶液的色谱图，图2～图7显示了各样品溶液的色谱图。
[0387]
另外，使用以下数学式可以计算各fmoc-氨基酸相对于fmoc-gly-oh的含有率(w/w％)。表2(没有用蒽校正注入量)和表3(用蒽校正注入量)显示了其结果。
[0388]
计算公式(没有用蒽校正注入量的情形)
[0389][0390]cs
：未反应的标准溶液中fmoc-gly-oh的浓度(umol/l)
[0391]ct
：各未反应的样品溶液中各粗fmoc-氨基酸的浓度(umol/l)
[0392]as
：标准溶液的dbf峰面积
[0393]at
：各样品溶液的dbf峰面积
[0394]
计算公式(用蒽校正注入量的情形)
[0395][0396]cs
:未反应的标准溶液中fmoc-gly-oh的浓度(umol/l)
[0397]ct
:各未反应的样品溶液中各粗fmoc-氨基酸的浓度(umol/l)
[0398]
iss:标准溶液的蒽峰面积
[0399]
is
t
:各样品溶液的蒽峰面积
[0400]as
:标准溶液的dbf峰面积
[0401]at
:各样品溶液的dbf峰面积
[0402]
[表2]
[0403]
(没有用蒽校正注入量)
[0404][0405]
[表3]
[0406]
(用蒽校正注入量)
[0407][0408]
由上述结果可知，有含有率几乎为100％的fmoc-氨基酸，如fmoc-ile-oh和fmoc-nme-leu-oh；也有含有率不到100％的fmoc-氨基酸。认为含有率不到100％的fmoc-氨基酸
包含水分和无机盐、残留溶剂等uv不能检测出的杂质。另外，即使在标准溶液和各样品溶液的注入量不同时，也可以通过用内部标准物质的峰面积校正来定量计算。
[0409]
实施例2(通过dbf对fmoc-氨基酸的定量-2)
[0410]
标准溶液的制备
[0411]
fmoc-gly-oh(约10mg)按照日本药典精密称量，向溶解于乙腈(10ml)中制备的fmoc-gly-oh溶液(包含1mg/ml浓度fmoc-gly-oh的乙腈溶液)添加内部标准溶液(包含500ug/ml浓度蒽的乙腈溶液)、dbu溶液(包含10v/v％浓度dbu的乙腈溶液)和乙腈，制备分别包含100ug/ml浓度fmoc-gly-oh、50ug/ml浓度蒽、4v/v％浓度dbu的乙腈溶液。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的标准溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“标准溶液”。另外，标准溶液的制备中使用的fmoc-gly-oh购自渡边化学工业(纯度99.8％、含水量小于0.10％)。
[0412]
样品溶液的制备
[0413]
包含定量对象fmoc-氨基酸的粗fmoc-氨基酸(约10mg)按照日本药典精密称量，向溶解于乙腈(10ml)中制备的粗fmoc-氨基酸溶液(包含1mg/ml浓度粗fmoc-氨基酸的乙腈溶液)添加内部标准溶液(包含500ug/ml浓度蒽的乙腈溶液)、dbu溶液(包含10v/v％浓度dbu的乙腈溶液)和乙腈，制备分别包含100ug/ml浓度粗fmoc-氨基酸、50ug/ml浓度蒽、4v/v％浓度dbu的乙腈溶液。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的样品溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“样品溶液”。
[0414]
分析装置和分析条件如下。
[0415]
(分析装置)
[0416]
hplc系统：h级(waters)
[0417]
·
紫外可见光吸收检测器：acq-tuv
[0418]
·
泵：acq-qsm
[0419]
·
自动进样器：acq-ftn
[0420]
(分析条件)
[0421]
柱：osaka soda capcell core adme(3.0x 150mm,2.7um)
[0422]
流动相a：0.05％tfa/水
[0423]
流动相b：0.05％tfa/乙腈
[0424]
流速：0.6ml/min
[0425]
柱温度：40℃
[0426]
样品注入量：2ul
[0427]
测定波长：254nm
[0428]
梯度条件：见表4
[0429]
[表4]
[0430]
时间(分钟)b(％)0302070
221002410024.1302830
[0431]
图8显示了标准溶液的色谱图，图9～图11显示了各样品溶液的色谱图。
[0432]
另外，使用实施例1所示的数学式可以计算各fmoc-氨基酸相对于fmoc-gly-oh的含有率(w/w％)。表5(没有用蒽校正注入量)和表6(用蒽校正注入量)显示了其结果。
[0433]
[表5]
[0434]
(没有用蒽校正注入量)
[0435][0436]
[表6]
[0437]
(用蒽校正注入量)
[0438][0439]
由上述结果可知，上述三种fmoc-氨基酸的含有率几乎为100％。另外，通过有无用蒽校正注入量，含有率几乎没有变化，因此，推测在本实施例中的标准溶液的注入量与各样品溶液的注入量没有差异。
[0440]
实施例3(用fmoc-氨基酸纯度校正的含量分析)
[0441]
样品溶液的制备
[0442]
稀释1mg/ml粗fmoc-氨基酸溶液制备样品溶液(包含100ug/ml浓度粗fmoc-氨基酸的乙腈溶液)。另外，样品溶液中使用的各种粗fmoc-氨基酸购自渡边化学工业。
[0443]
分析装置和分析条件如下。
[0444]
(分析装置)
[0445]
hplc系统：h级(waters)
[0446]
·
紫外可见光吸收检测器：acq-tuv
[0447]
·
泵：acq-qsm
[0448]
·
自动进样器：acq-ftn
[0449]
(分析条件)
[0450]
柱：osaka soda capcell core adme(3.0x150mm，2.7um)
[0451]
流动相a：0.05％tfa/水
[0452]
流动相b：0.05％tfa/乙腈
[0453]
流速：0.6ml/min
[0454]
柱温度：40℃
[0455]
样品注入量：2ul
[0456]
测定波长：254nm
[0457]
梯度条件：见表7
[0458]
[表7]
[0459]
时间(分钟)b(％)0302070221002410024.1302830
[0460]
如图12～图20所示，自与实施例2的色谱图的比较，可以确认因dbu处理而消失的fmoc-氨基酸的峰。认为该峰是来自具有fmoc基团的化合物的峰，表8显示了仅积分这些峰而计算的各fmoc-氨基酸的纯度。用这些纯度校正和用蒽校正注入量，可以计算含有率。表9显示了其结果。
[0461]
计算公式
[0462][0463]
dbf测定法
样品
：在用纯度校正前的各fmoc-氨基酸的含有率
[0464]
ps：具有fmoc基团的化合物中的各fmoc-氨基酸纯度
[0465]
[表8]
[0466]
各fmoc氨基酸的纯度
[0467][0468]
[表9]
[0469]
各fmoc氨基酸的含量(有纯度校正)
[0470] 含量fmoc-val-oh101.2％fmoc-phe-oh100.6％
fmoc-nme-val-oh100.8％
[0471]
实施例4(dbf稳定性的研究)
[0472]
样品溶液的制备
[0473]
在表10所示的各溶剂中溶解fmoc-gly-oh，制备样品溶液(包含100ug/ml浓度fmoc-gly-oh)。另外，将样品溶液保存在10℃，并实施分析。
[0474]
[表10]
[0475][0476]
分析装置和分析条件如下。
[0477]
(分析装置)
[0478]
hplc系统：h级(waters)
[0479]
·
紫外可见光吸收检测器：acq-pda
[0480]
·
泵：acq-qsm
[0481]
·
自动进样器：acq-ftn
[0482]
(分析条件)
[0483]
柱：osaka soda capcell core adme(2.1x150mm,2.7um)
[0484]
流动相a：0.05％tfa/水
[0485]
流动相b：0.05％tfa/乙腈
[0486]
流速：0.3ml/min
[0487]
柱温度：40℃
[0488]
样品注入量：2ul
[0489]
测定波长：254nm
[0490]
梯度条件：见表11
[0491]
[表11]
[0492]
时间(分钟)b(％)030
2070221002410024.1302830
[0493]
表12显示了第一天的样品溶液中的和保存各期间为1天、2天、5天后的样品溶液中的dbf及其降解物的各峰面积的比例。另外，表13显示了第一天的样品溶液中的和保存5天后的样品溶液中的dbf峰面积比较(保存5天/第一天)的结果。由此可知，通过柠檬酸处理可以抑制dbf降解。
[0494]
[表12]
[0495]
稳定性试验中dbf与其降解物的峰比例
[0496][0497]
注)dbf-pip是以下结构。
[0498][0499]
注)dbf降解物是以下结构。
[0500][0501]
[表13]
[0502]
第一天和保存5天后的样品溶液中的dbf的峰面积的比较结果
[0503][0504]
实施例5(与定量nmr的比较)
[0505]
为了评价本发明的定量法(dbf测定法)的妥当性，与实施例1或2同样地对各种粗fmoc-氨基酸定量了用dbu处理产生的dbf(未用内标准物质校正，但用纯度校正)，并与通过定量nmr测定的上述粗fmoc-氨基酸的定量值进行比较。另外，使用fmoc-ile-oh(通过定量nmr的含有率为99.18％)作为用于制备标准溶液的可信样品氨基酸。如图21和表14所示，观察到本发明的定量值与定量nmr的定量值之间具有良好的正相关性，相关系数为0.95，证明了本发明的妥当性。
[0506]
分析装置和试剂如下。
[0507]
(分析装置)
[0508]
nmr:jeol 500mhz royal hfx probe
[0509]
试剂:fmoc-氨基酸
[0510]
溶剂:dmso-d6
[0511]
标准品:3,5-双(三氟甲基)-苯甲酸(99.96％
±
0.06％、定量nmr用试剂)
[0512]
[表14]
[0513][0514]
自与qnmr的相关，显示了本定量法与qnmr同样地是有效的定量法。
[0515]
实施例6(dbu处理fmoc-氨基酸后的氨基酸定量)
[0516]
用dbu脱保护fmoc-氨基酸时，产生dbf和氨基酸。在实施例1～4中定量了dbf，但在本实施例中定量了氨基酸。用dbu脱保护fmoc-nme-gly-oh而产生的h-nme-gly-oh的峰面积与使用作为内标准物质的h-nme-gly-oh的氨基酸标准溶液的峰面积进行比较的结果，通过脱保护产生的h-nmegly-oh以97.2％的收率获得(图22～24)。由此，证实了通过添加dbu的脱保护反应是定量进行的。
[0517]
另外，本实施例通过亲水性相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,hilic)实施测定，疏水性高的化合物(例如dbf)的峰出现在较早的洗脱位置，而亲水性高的化合物(例如氨基酸)的峰出现在较后的洗脱位置。另外，h-nme-gly-oh几乎不吸收紫外可见光波长，因此用cad检测。
[0518]
氨基酸标准溶液的制备
[0519]
制备包含100ug/ml浓度h-nmegly-oh(n-甲基甘氨酸)的溶液。h-nme-gly-oh(纯度99.7％(非水法))购自东京化成工业。
[0520]
样品溶液的制备
[0521]
向fmoc-nmegly-oh添加2％dbu溶液(包含2v/v％浓度dbu的乙腈溶液)后，用ch3cn/h2o(4:1)稀释制备样品溶液(包含300ug/ml浓度fmoc-氨基酸的溶液)。fmoc-megly-oh购自原材料制造商。
[0522]
分析装置和分析条件如下。
[0523]
(分析装置)
[0524]
hplc系统：1200系列(agilent)
[0525]
·
紫外可见光吸收检测器：agilemt 1200mwd
[0526]
·
泵：agilent 1200二元泵-1,-2
[0527]
·
自动进样器：agilent 1200自动进样器
[0528]
(分析条件)
[0529]
柱：imtakt intrada amino acid(3x 100mm,3um)
[0530]
流动相a：0.1％甲酸/乙腈
[0531]
流动相b：100mm甲酸铵/水
[0532]
流速：1.0ml/min
[0533]
柱温度：35℃
[0534]
样品注入量：2ul
[0535]
检测器：带电气溶胶检测器(cad)(corona ultra)
[0536]
梯度条件：见表15
[0537]
[表15]
[0538]
时间(分钟)a(％)b(％)086143861410010010.018614148614
[0539]
实施与该条件不同的逆梯度设置，向检测器中通常引入a∶b＝50∶50。
[0540]
逆梯度条件：见表16
[0541]
[表16]
[0542]
时间(分钟)a(％)b(％)014863148610100010.011486141486
[0543]
实施例7(通过dbf进行fmoc-肽的定量)
[0544]
标准溶液的制备
[0545]
按照日本药典精密称量fmoc-gly-oh(约10mg)，向溶解于乙腈(20ml)中制备的fmoc-gly-oh溶液(包含500ug/ml浓度fmoc-gly-oh的乙腈溶液)添加内部标准溶液(包含250ug/ml浓度蒽的乙腈溶液)、dbu溶液(包含10v/v％浓度dbu的乙腈溶液)和乙腈，制备分别包含50ug/ml浓度fmoc-gly-oh、25ug/ml浓度蒽、2v/v％浓度dbu的乙腈溶液。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的标准溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“标准溶液”。另外，标准溶液的制备中使用的fmoc-gly-oh(纯度98.6％)购自东京化成工业。
[0546]
样品溶液的制备-1
[0547]
按照日本药典精密称量定量对象的粗fmoc-phe-phe-oh(约10mg)，向溶解于乙腈(20ml)中制备的粗fmoc-phe-phe-oh溶液(包含500ug/ml浓度fmoc-phe-phe-oh的乙腈溶液)添加内部标准溶液(包含250ug/ml浓度蒽的乙腈溶液)、dbu溶液(包含10v/v％浓度dbu的乙腈溶液)和乙腈，制备分别包含50ug/ml浓度粗fmoc-phe-phe-oh、25ug/ml浓度蒽、2v/v％浓度dbu的乙腈溶液。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。溶液的制备中使用的粗fmoc-phe-phe-oh(纯度99.8％)购自渡边化学工业社。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的样品溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“样品溶液”。
[0548]
样品溶液的制备-2(通过固相反应合成且负载于树脂的粗fmoc-肽化合物)
[0549]
按照日本药典精密称量定量对象，为通过固相反应合成且负载于树脂的粗fmoc-肽化合物(下文中有时仅称为“负载于树脂的粗fmoc-肽化合物”)(约30mg)，加入二氯甲烷(3ml)，静置15分钟以上使其溶胀。另外，在本实施例和实施例8中，使用ctc树脂作为固相合成用树脂。排出二氯甲烷后，树脂用二氯甲烷(3ml)洗涤两次。向树脂加入0.6ml tfa溶液(含有浓度为1v/v％的tfa的二氯甲烷溶液)并在室温振摇以从树脂中切出粗fmoc-肽。向其中加入内部标准溶液(含蒽浓度为250μg/ml的乙腈溶液)、dbu溶液(含dbu浓度为10v/v％的乙腈溶液)和乙腈，制备含有粗fmoc-肽的乙腈溶液，其分别含有浓度为1mg/ml的粗fmoc-肽作为负载于树脂的粗fmoc-肽化合物、25ug/ml浓度蒽、2v/v％浓度dbu。接下来，涡旋搅拌该溶液后，室温静置10分钟以上，脱保护fmoc基团。通过hplc得到的uv色谱图确认了脱保护反应定量进行。在本实施例中，将脱保护反应开始前的上述溶液称为“未反应的样品溶液”，将脱保护反应后的上述溶液仅称为“样品溶液”。
[0550]
分析装置和分析条件如下。
[0551]
(分析装置)
[0552]
hplc系统：h级(waters)
[0553]
·
紫外可见光吸收检测器：acq-tuv
[0554]
·
泵：acq-qsm
[0555]
·
自动进样器：acq-ftn
[0556]
(分析条件)
[0557]
柱：osaka soda capcell core adme(2.1x150mm,2.7um)
[0558]
流动相a：0.05％tfa/水
[0559]
流动相b：0.05％tfa/乙腈
[0560]
流速：0.3ml/min
[0561]
柱温度：40℃
[0562]
样品注入量：2ul
[0563]
测定波长：254nm
[0564]
梯度条件：见表17
[0565]
[表17]
[0566]
时间(分钟)b(％)0302070221002410024.1302830
[0567]
图25显示了标准溶液的色谱图，图26～图29显示了各样品溶液的色谱图。
[0568]
另外，使用以下数学式可以计算各fmoc-肽相对于fmoc-gly-oh的含有率(w/w％)。表18显示了(没有用蒽校正注入量)的其结果，且表19显示了(用蒽校正注入量)的其结果。另外，样品溶液中所含的fmoc-肽的分子量计算为末端具有羧基的羧酸体。
[0569]
计算公式(没有用蒽校正注入量的情形)
[0570][0571]cs
：未反应的标准溶液中fmoc-gly-oh的浓度(umol/l)
[0572]ct
：各未反应的样品溶液中各粗fmoc-肽的浓度(umol/l)
[0573]as
：标准溶液的dbf峰面积
[0574]at
：各样品溶液的dbf峰面积
[0575]
计算公式(用蒽校正注入量的情形)
[0576][0577]cs
:未反应的标准溶液中fmoc-gly-oh的浓度(umol/l)
[0578]ct
:各未反应的样品溶液中各粗fmoc-肽的浓度(umol/l)
[0579]
iss:标准溶液的蒽峰面积
[0580]
is
t
:各样品溶液的蒽峰面积
[0581]as
:标准溶液的dbf峰面积
[0582]at
:各样品溶液的dbf峰面积
[0583]
[表18]
[0584]
(没有用蒽校正注入量)
[0585][0586]
[表19]
[0587]
(用蒽校正注入量)
[0588][0589]
实施例8(用fmoc-肽的纯度校正的含量分析)
[0590]
样品溶液的制备-1
[0591]
稀释500ug/ml粗fmoc-phe-phe-oh溶液，制备样品溶液(包含50ug/ml浓度粗fmoc-phe-phe-oh的乙腈溶液)。
[0592]
样品溶液的制备-2
[0593]
与实施例7的“样品溶液的制备-2”同样地，用乙腈稀释切出溶液，以使粗fmoc-肽
作为负载于树脂的粗fmoc-肽化合物以1mg/ml的浓度含有，以此作为样品溶液。
[0594]
分析装置和分析条件如下。
[0595]
(分析装置)
[0596]
hplc系统：h级(waters)
[0597]
·
紫外可见光吸收检测器：acq-tuv
[0598]
·
泵：acq-qsm
[0599]
·
自动进样器：acq-ftn
[0600]
(分析条件)
[0601]
柱：osaka soda capcell core adme(2.1x150mm,2.7um)
[0602]
流动相a：0.05％tfa/水
[0603]
流动相b：0.05％tfa/乙腈
[0604]
流速：0.3ml/min
[0605]
柱温度：40℃
[0606]
样品注入量：2ul
[0607]
测定波长：254nm
[0608]
梯度条件：见表20
[0609]
[表20]
[0610]
时间(分钟)b(％)0302070221002410024.1302830
[0611]
分别计算各样品溶液的粗fmoc-肽相对于总fmoc化合物的纯度。其结果显示在表21中。用计算的纯度和用蒽进行校正以计算fmoc-肽的含有率。其结果显示在表22中。对于经测定的样品在保存期间产生的甲酯形式的样品，将甲酯形式也作为目标fmoc-肽来计算纯度。
[0612]
计算公式
[0613][0614]
dbf测定法
样品
：用纯度校正前的各fmoc-肽的含有率
[0615]
ps：具有fmoc基团的化合物中的各fmoc-肽纯度
[0616]
[表21]
[0617][0618]
[表22]
[0619] 含有率fmoc-phe-phe-oh96.6％fmoc-gly-gly-o-树脂4.3％fmoc-gly-leu-o-树脂13.6％fmoc-gly-bala-o-树脂15.4％
[0620]
以上结果显示了，本发明的定量法可以用于fmoc-肽的含量分析以及来自固相反应合成的负载于树脂的fmoc-肽化合物的fmoc-肽的含量分析。
[0621]
产业可利用性
[0622]
本发明提供对含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的新定量方法。根据本发明，能够高精度且简便地定量分析样品中所含的含有用具有fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的含量。