包含长双歧杆菌婴儿亚种的婴幼儿配方粉及其应用的制作方法

1.本发明主要是关于一种包含长双歧杆菌婴儿亚种的婴幼儿配方粉及其应用，具体是指一种包含长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)可提升肠道细菌感染抗性和肠道免疫能力的母乳化婴幼儿配方粉、其制备方法及相关应用。


背景技术：

2.在上个千年，已有医学文献记载，未经母乳喂养的婴儿有较高的疾病率和死亡率。母乳不仅为婴儿提供所需营养，母乳中的活性成分更为婴儿的肠道发育和免疫力完善提供保障。母乳喂养的婴儿与配方奶喂养的婴儿相比，肠道菌群中有益菌的相对丰度更高，特别是双歧杆菌和乳酸菌。
3.母乳通过菌群的传递，加上母乳低聚糖和母乳中的细胞因子等活性成分，为新生儿建立起健康的肠道菌群。婴儿每天通过母乳摄入10
7-108个细菌，包括乳酸菌和双歧杆菌。这些菌通过母乳直接传递给婴儿，部分可在婴儿肠道定植，促进生命早期肠道菌群的建立。婴儿肠道菌群的建立，对其肠道的发育，以及对健康和免疫系统有着短期，甚至终生的影响。
4.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，简称hmos)属于母乳中除乳糖和脂肪外，含量第三丰富的物质。其总含量在泌乳期的各个阶段有变化，在成熟乳中大约是12-14g/l，而初乳中大约是20-24g/l。每一种母乳低聚糖的结构在还原端都有一个乳糖，大部分以聚乳糖胺作为结构主链，并在链端含有岩藻糖、唾液酸或二者均有。hmos的存在与含量存在个体差异，并与哺乳母亲的路易斯分泌型组成有关。由于婴幼儿配方粉的原料通常是牛乳，而牛乳中通常不含或含有很少这类低聚糖物质，hmos便成为了婴幼儿配方粉想要更加接近母乳成分所必须跨越的一道鸿沟。
5.上世纪90年代，在大部分母乳中均含有的hmo，2-岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)被发现可有效地减轻大肠杆菌中稳定毒素的毒性；到了2003年，该低聚糖被报道可抑制弯曲空肠杆菌的附着和感染。随后，母乳低聚糖的三大主要功能被逐步报道和发现：(1)抑制特定病菌的附着和感染；(2)作为益生元，促进肠道共生系统里面细菌的生长；(3)直接减缓粘膜在有毒刺激下的炎症反应。使用了2
’‑
fl的首个临床干预试验证实了在低卡路里配方中加入这个特定成分不仅安全还可以让配方奶喂养的婴儿生长速率与母乳喂养的婴儿具有可比性。2
’‑
fl也被用作成年人的营养补充剂，缓解肠道应激性综合症或炎症性肠病，或被用作益生元维持肠道菌群平衡。
6.肠道菌群是人体肠道微生态系统的重要组成物质，对人类健康有重要作用，如可提供必需营养素，生成维生素k，辅助消化过程与促进血管生成和肠道神经作用。益生元与益生菌被视为改善机体健康的微生态管理工具，可改变、调节和重组已经存在的肠道菌群。
7.目前在婴幼儿配方粉等领域，需要有缓解婴幼儿肠道不适及提升自身免疫能力的解决方案。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的在于提供一种可缓解婴幼儿肠道不适、提高胃肠道免疫能力的婴幼儿配方粉。
9.本案发明人在研究中发现，保藏编号cctcc no.m2011122的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)具有抑制肠道病原菌的黏附的作用，提高肠道屏障完整性，并且具有抑制肠道炎症因子产生的作用，能够缓解由于肠道病原菌引起的炎症反应。进一步，当将保藏编号cctcc no.m2011122的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)与母乳低聚糖的组合应用，对于提高胃肠道免疫能力具有协同作用。
10.保藏编号为cctcc no.m2011122的长双歧杆菌婴儿亚种本发明中亦命名为长双歧杆菌婴儿亚种gb-1496。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072；保藏日期：2011年04月10日；保藏编号：cctcc no：m2011122，分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)。长双歧杆菌婴儿亚种cctcc no.m2011122还具有较佳的自由基清除能力以及还原能力，且能诱发caco-2细胞增加抗氧化酶的表达，因此，本发明的长双歧杆菌婴儿亚种gb-1496菌株还具有抗氧化的活性效果，且能够减少自由基浓度，以抑制器官老化。
11.一方面，本发明提供了一种母乳化婴幼儿配方粉，其包括保藏编号cctcc no.m2011122的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)。
12.根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中还进一步包括母乳低聚糖。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，所述母乳低聚糖包括2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种。
[0014]2’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fucosyllactose，2
’‑
fl或2-fl或2fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0015]3’‑
岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3
’‑
fl或3-fl或3fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，与2
’‑
岩藻糖基乳糖互为同分异构体。是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0016]
乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)，为乳糖与四糖形成的六糖结构，是以核心糖链为基础结构，且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0017]3’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl或3-sl或3sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0018]6’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sialyllactose，6
’‑
sl或6-sl或6sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0019]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，所述母乳低聚糖
包括重量比例(0-18):(1-8):(1-6):(1-4):(0-12)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0020]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，所述母乳低聚糖包括重量百分比(0-55％):(3％-44.4％):(3％-33.3％):(3％-22.2％):(0-36％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。所述重量百分比是以母乳低聚糖的总量为100％计。
[0021]
根据本发明的一些优选的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，母乳低聚糖的含量为0.1-6.7％，优选0.3-5％，更优选0.7-3.5％。本发明中，除特别注明外，所述含量或比例均为重量含量或比例。
[0022]
根据本发明的一些优选的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，所述保藏编号cctcc no.m2011122的长双歧杆菌婴儿亚种的含量为1
×
103cfu/g～1
×
10
12
cfu/g，优选为1
×
106cfu/g～1
×
10
10
cfu/g。
[0023]
根据本发明的一些优选的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉，其中总蛋白质含量为10～20g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为50～70％；脂肪含量为15～30g/100g；碳水化合物含量为50～70g/100g。优选地，该母乳化婴幼儿配方粉中亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g。
[0024]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，除上述组分外，还可包括婴幼儿配方粉的常规组分，例如还可以包括复配营养素包。
[0025]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，蛋白、脂肪指标可根据婴儿发育阶段做更进一步细分。具体而言，针对0-6个月婴儿：该奶粉中的总蛋白含量为10～15g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为60～70％，脂肪含量为23～30g/100g，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g，碳水化合物含量为52～56g/100g。针对6-12个月较大婴儿：该奶粉中总蛋白含量为10～20g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为50～70％，脂肪含量为20～30g/100g，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g，碳水化合物含量为52～56g/100g。针对12-36个月幼儿：该奶粉中总蛋白含量为12～20g/100g，乳清蛋白占总蛋白的比例为50～70％，脂肪含量为20～30g/100g，亚油酸含量为2700～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为270～450mg/100g，碳水化合物含量为52～56g/100g。
[0026]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，提供总蛋白的原料包括：生牛乳、全脂奶粉、脱脂奶粉、乳清蛋白粉、脱盐乳清粉中的一种或多种。基于1000重量份的上述婴幼儿配方粉，其原料包括：生牛乳800～3000份，全脂奶粉0～300份，乳清蛋白粉0～120份，脱脂奶粉0～300份，和/或脱盐乳清粉0～300份。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，提供脂肪的原料包括：含有乳脂的原料、混合植物油和opo结构脂中的一种或多种。混合植物油包括玉米油15～50份,大豆油40～70份,葵花籽油0-100份，和/或opo结构脂0～115份。
[0028]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉中，提供碳水化合物的原料包括：乳糖50～450份，和/或含有乳糖的上述蛋白原料。
[0029]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳化婴幼儿配方粉，其原料中还包括适当的包含维生素和矿物质的复配营养素。复配营养素主要包括：复配维生素：牛磺酸、维生
素a、维生素d、维生素e、维生素k1、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b
12
、烟酸、叶酸、泛酸、维生素c、胆碱、生物素；复配矿物质：钠、钾、钙、磷、铜、铁、锌、锰、碘、硒、镁、钾及它们的衍生物。所述各维生素、矿物质的来源、含量及使用量，应该符合婴幼儿配方食品国家标准及相关法规。
[0030]
另一方面，本发明还提供了一种制备所述的母乳化婴幼儿配方粉的方法，该方法采用湿法或干法生产工艺，将长双歧杆菌婴儿亚种、母乳低聚糖与配方中的其他原料混合，制备所述母乳化婴幼儿配方粉。其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。
[0031]
本发明中，长双歧杆菌婴儿亚种可以在配料时一起混料(在婴儿配方粉中以灭活形式存在)，优选在后混料过程中添加(在婴儿配方粉中以活菌形式存在)。
[0032]
本发明中，母乳低聚糖可以在配料时一起混料，也可以在后混料过程中添加。
[0033]
另一方面，本发明还提供了所述的婴幼儿配方粉在制备具有提高胃肠道免疫能力功效的食品中的应用。具体地，所述提高胃肠道免疫能力包括：提升肠道细菌感染抗性，在肠道系统中抵御致病菌侵入，维持肠道屏蔽功能，预防致病菌引起的腹泻，和/或降低肠道细胞释放炎症因子ip-10。
[0034]
综上所述，本发明发现长双歧杆菌婴儿亚种具有降低致病菌对肠道上皮细胞的黏附能力、提高肠道屏障功能、激活肠道免疫能力的作用，将其应用于婴幼儿配方粉中，具有抗感染、调节肠道健康和免疫能力，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0035]
图1显示母乳低聚糖各单体与组合物对受试致病菌epec存活率影响。
[0036]
图2显示益生菌及其与各比例的母乳低聚糖的组合物对致病菌epec作用于肠道细胞caco-2的粘附实验结果。
[0037]
图3显示益生菌及其与各不同比例的母乳低聚糖的组合物对大肠杆菌造成的肠道屏障破坏的作用。
[0038]
图4显示在加入大肠杆菌共培养时，益生菌及其与母乳低聚糖的组合物对肠道细胞分泌炎症因子ip-10的影响。
[0039]
用于专利程序的微生物保藏：
[0040]
本发明的gb-1496菌株
[0041]
保藏日期：2011年04月10日
[0042]
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)
[0043]
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
[0044]
保藏编号：cctcc no：m2011122
[0045]
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)
具体实施方式
[0046]
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域
普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
[0047]
实施例1
[0048]
本实施例提供一种含有母乳低聚糖和长双歧杆菌婴儿亚种组合物的0～6月龄的婴儿配方粉，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0049]
生牛乳1000份，乳糖350份，混合植物油120份，opo结构油脂110份，脱盐乳清粉125份，脱脂奶粉50份，乳清蛋白粉70份，母乳低聚糖(2
’‑
fl)2份，长双歧杆菌婴儿亚种cctcc no：m2011122 0.18份，复配维生素2.5份，复配矿物质8份。
[0050]
本实施例的婴儿配方粉采用干法生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与长双歧杆菌婴儿亚种，得到成品。
[0051]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。
[0052]
实施例2
[0053]
本实施例提供一种含有母乳低聚糖和长双歧杆菌婴儿亚种组合物的6～12月龄的较大婴儿配方粉，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0054]
生牛乳1500份，脱盐乳清粉220份，乳糖170份，脱脂奶粉170份，混合植物油70份，opo结构脂70份，乳清蛋白粉40份，母乳低聚糖(2
’‑
fl、3-fl、lnt、3-sl混合物)4份，长双歧杆菌婴儿亚种cctcc no：m2011122 0.18份，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0055]
本实施例的婴儿配方粉采用干法生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与长双歧杆菌婴儿亚种，得到成品。
[0056]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。
[0057]
实施例3
[0058]
本实施例提供一种含有母乳低聚糖和长双歧杆菌婴儿亚种组合物的12～36月龄的幼儿配方粉，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0059]
生牛乳1500份，脱脂奶粉250份，乳糖180份，脱盐乳清粉150份，混合植物油70份，opo结构油脂65份，乳清蛋白粉35份，母乳低聚糖(2
’‑
fl、3-fl、lnt、3-sl、6-sl混合物)8份，长双歧杆菌婴儿亚种cctcc no：m2011122 0.18份，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0060]
本实施例的幼儿配方粉采用干法生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与长双歧杆菌婴儿亚种，得到成品。
[0061]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。
[0062]
长双歧杆菌婴儿亚种cctcc no：m2011122与母乳低聚糖功效实验
[0063]
实验方法及受试物情况如下：
[0064]
1.实验准备步骤
[0065]
1.1培养基配置与受试益生元的储存和配置
[0066]
含有益生元的培养基在每次实验当天于无菌环境中新鲜配置，并预热到37℃。受试的益生元/hmos被储存在干燥避光的室温环境中。实验中使用的浓度，不论单体还是组合物，均为5g/l。
[0067]
1.2益生菌培养、生长曲线绘制与活性鉴别
[0068]
益生菌粉在实验前以冷冻干燥的状态送到实验室。益生菌被接种到mrs-琼脂平板上，取单独的菌株群落用于16s rdna鉴定，且用来制备甘油原液(储存在-80℃)。在每次实验前，从甘油原液中取出益生菌并在mrs平板上于37℃接种，在静止态下收获，用dpbs冲洗，
并在实验前重新悬浮于mem培养基。在益生菌受试前，用荧光激活细胞分拣系统测量益生菌活性与细胞数。实验中使用的益生菌浓度为1
×
108cfu/ml，以及特定情况下，选用了1
×
106cfu/ml。
[0069]
本发明的长双歧杆菌婴儿亚种gb-1496来源为人类母乳，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072；保藏日期：2011年04月10日；保藏编号：cctcc no：m2011122，分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)。
[0070]
根据16s rdna序列分析以及api细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。长双歧杆菌婴儿亚种gb-1496在形态学及一般性质上的特征详细列于表1。
[0071]
表1
[0072][0073]
长双歧杆菌婴儿亚种gb-1496菌株是以含有20％甘油的mrs培养基保存于-80℃。使用前，以含有0.05％l-cysteine的mrs broth(difco)，37℃下活化(24小时)二次后使用。
[0074]
1.3不同组合益生元和益生菌的配制
[0075]
益生元或其组合物的受试浓度均为5g/l；受试益生菌数量为1
×
cfu/ml，以及特定情况下，选用了1
×
106cfu/ml。
[0076]
组合中五种益生元比例及所占百分比如表2和表3所示。
[0077]
表2
[0078]
比例2
’‑
fl3-fllnt3-sl6-sl组合物a104311组合物b104320组合物c96320组合物d08640组合物e1811112组合物f12.55.754.251.51
[0079]
表3
[0080]
百分比％2
’‑
fl3-fllnt3-sl6-sl组合物a53211655组合物b532116100组合物c453015100组合物d044.433.322.20组合物e5533336组合物f50231764
[0081]
1.4 caco-2细胞培养
[0082]
从德国微生物菌种保藏中心dsmz(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen)购得人结肠肿瘤细胞系(caco-2)，并在有5％co2，37℃一定湿度条件下培养。第40-44代caco-2细胞被用于实验。mem培养基中加入了20％(体积/体积)的胎牛血清(fbs)，1％的非必需氨基酸，1％的glutamax，1％的丙酮酸钠，添加或未添加1％的青霉素-链霉素溶液，以及50μg/ml的庆大霉素(所有均从荷兰布雷达的invitrogen公司购得)。细胞在t75培养瓶中长到80％丰度，用胰蛋白酶消化处理获取。
[0083]
1.5致病菌etec和epec的培养
[0084]
此研究使用了两种致病菌，分别是肠毒性的大肠杆菌etec h10407和肠道致病菌大肠杆菌epec serotype o119。这两种菌可用来模拟体外的小肠感染。这两种都是导致婴儿腹泻和旅行者腹泻的常见致病菌，尤其在卫生条件较差的发展中地区。etec h10407是一个体外实验中常用的、被较好的定义的模型菌株，且已被广泛用在其他评估益生菌和益生元对于致病菌吸附和炎症信号传导的研究中。此菌株也被用在动物试验中用于研发疫苗。epec serotype o119是从婴儿粪便分离的，益生元已被证明可减少其吸附。
[0085]
用bhi-b培养基(美国纽约默克公司)培养etec细胞株h10407(atcc35401)。在37℃厌氧条件下过夜培养后，致病菌在感染前被再次培养，以达到对数中期。离心收集细胞，冲洗并在实验前用pbs再悬浮。
[0086]
epec血清型o119株在冷冻干燥条件下从dsmz处购得(dsm8699)。用bhi-b培养基(美国纽约默克公司)培养菌株。在37℃厌氧条件下过夜培养后，致病菌在感染前被再次培养，以达到对数中期。离心收集细胞，冲洗并在实验前用pbs再悬浮。
[0087]
1.6数据分析
[0088]
如有可能，用三次重复(有时候可用六次重复)来进行每个单独测试的统计分析。抗粘附数据用log10转化。对于log10转化后的抗粘附数据和表皮信号传导数据用one-way anova来进行统计分析。用dunnett’s posthoc测试来鉴定与阴性对照(neg.control)或者用大肠杆菌刺激条件下的统计差异。在跨膜电阻teer测试中，阴性对照与受试组之间在每个时间点的统计学差异用two-way anova以及dunnett’s posthoc测试进行分析。在炎症因子ip-10的测试中，进行了one-way anova统计分析，并用dunnett’s posthoc测试进行显著性分析。用星号表示显著性差异：*代表p《0.05,**代表p《0.01，***代表p《0.001，****代表p《0.0001。p《0.05被认为有显著性差异。标星号的组别与未标星号的组别有显著统计学差异，差异程度视星号的个数而异。因dunnett’s posthoc测试用了anova pooled residual分析，且用了修改的显著性数值用来调整比较的数目，所以同样的结果在一个图表中可能显著，而另一个图表中可能不显著。
[0089]
2.具体实验步骤
[0090]
2.1抗粘附测试
[0091]
在24孔板上培养caco-2细胞。在试验当天，用预热的pbs冲洗caco-2细胞。受试物质被以三倍平行重复加到caco-2细胞中。用受试物质培养细胞1小时。接着加入致病菌大肠杆菌，以感染倍数(moi)50：1加入(最终浓度为107cfu/ml)，与受试物质在37℃共培养1小时。作为阴性对照，caco-2细胞在培养基中仅与致病菌一起培养。因被报道为可减少致病菌吸附，1mm氧化锌(zno)被用作阳性对照。在培养后，冲洗并裂解caco-2细胞，然后致病菌被接种在琼脂上。在37℃琼脂平板上培养过夜后，数细菌的cfu菌落数以衡量致病菌吸附。数
生长中的大肠杆菌菌落数并记录为cfu/ml。与抗粘附测试平行的，将大肠杆菌(终浓度为)107cfu/ml添加到1ml受试的组合物种，并在37℃共培养1小时以测量活性。培养后，从每个样品离心收集大肠杆菌，再悬浮于pbs中，并在琼脂平板上接种。在37℃琼脂平板上培养过夜后，数细菌的cfu菌落数以衡量致病菌吸附。数生长中的大肠杆菌菌落数并记录为cfu/ml。所有条件进行三次重复。
[0092]
2.2肠道屏障完整性测试
[0093]
理想的小肠上皮屏障功能是保护宿主免受致病菌侵入和/或致病菌来源毒素的先决条件。在此研究中，体外的屏障完整性通过测定肠道细胞层的跨表皮的电阻(teer)体现。食物成分可能具有保护感染后肠道屏障功能下降的功能(减轻感染后teer的下降)。为了研究益生元和益生菌对于感染的作用，测定了teer在大肠杆菌感染前和感染后随时间变化的情况。
[0094]
caco-2细胞被接种到transwell聚碳酸酯细胞培养插入物中，平均孔径为0.4μm，面积为0.33cm2直至完全分化(
±
1000ω)。用世界精准仪器购入的evom2表皮伏特测量器测量跨上皮细胞电阻(teer)以衡量屏障完整性。
[0095]
在测试当天，细胞被冲洗，并在37℃下用不含抗生素和血清，但含有受试物质的培养基中培养1小时。紧接着加入大肠杆菌到受试物质之上(感染倍数moi为200:1)，并培养6小时。在实验开始前(t＝-1)，受试物质暴露1小时后及添加致病菌前(t＝0)，并在致病菌接触后1小时、2小时、3小时、4小时和6小时分别测定teer。在与致病菌接触后单独条件下的teer值与其各自在t＝0时的teer值相关，且被表述成δteer(ω.cm2)。阴性对照(只加入大肠杆菌)与未接触致病菌或受试物质的阳性对照也在实验组别中。所有条件重复测定三次，一些对照组被重复测定6次。
[0096]
2.3炎症因子释放测试
[0097]
益生元和益生菌能具有免疫调节(促进或者抗炎症)作用，能增加对于感染的抵抗力或者促进肠道健康。益生元益生菌的免疫调节作用可在存在或不存在促炎症刺激的情况下，测定小肠上皮细胞的细胞因子/趋化因子产生来衡量。用大肠杆菌菌株刺激caco-2细胞并测定上清液中ip-10的产生，可筛选益生元和益生菌对于趋化因子/细胞因子的产生的影响。ip-10在免疫的二级应答中很重要。它可以吸引单核细胞和巨噬细胞，也包括th1细胞，这些对于清除感染有重要作用。促炎症的益生元和益生菌可以增加ip-10的生成，而抗炎症的益生元和益生菌可以减少ip-10的生成。
[0098]
将caco-2细胞在96孔板养到适合的丰度。在实验最初，用不含抗生素的培养基冲洗细胞一次。将单层细胞与受试物质在37℃下用不含抗生素的培养基中共培养1小时，重复三次。加入大肠杆菌刺激细胞(moi 200:1)。在1小时培养后，单层细胞与致病菌共培养，并用含有受试物质和50μg/ml庆大霉素的培养液冲洗和培养过夜。作为空白对照(blank)，只用了培养液而没用大肠杆菌刺激。用大肠杆菌刺激但没用受试物质的培养液被用作大肠杆菌应答的对照。此外，作为caco-2细胞应答的对照，用含有rec tnfα(10ng/ml)以及rec ifnγ(5ng/ml)(均从英国阿宾顿的r&d systems购入)的混合物培养液刺激细胞。刺激24小时候收集上清液并储存于-20℃。按照生产商的使用指导，用bio-plex试剂盒(美国加州biorad公司)测试ip-10。
[0099]
3.受试物质对致病菌epec存活率影响测试
[0100]
为验证致病菌吸附的减少是否与致病菌活性有关，在益生元与益生菌和细胞共培养后，也检测了致病菌活性。如图1，与其他受试益生元类似，加入受试物质各母乳低聚糖2
’‑
fl、3
’‑
fl、lnt、3
’‑
sl等或其组合物后，未显著影响大肠杆菌epec 0119菌的存活率。可见母乳低聚糖不会影响大肠杆菌epec的存活率。
[0101]
益生菌gb-1496及与母乳低聚糖的组合物对致病菌epec于肠道粘附实验结果
[0102]
通过常见致腹泻菌株(epec o119)研究了益生元与益生菌组合物阻止致病菌吸附到小肠上皮细胞的保护作用。该图展示了益生菌gb-1496与2
’‑
fl或hmo组合物a到f形成的组合对于抑制大肠杆菌epec粘附到caco-2细胞的实验结果(均值
±
标准误差，重复三次测量)。
[0103]
因每次实验组别受限，分为两次实验先后进行。实验结果参见表4和图2。
[0104]
表4
[0105][0106][0107]
第一次实验中(图2左部分)，与阴性对照相比，5g/l的2
’‑
fl显著降低了epec的粘附(p《0.01)；gb-1496(108) 2
’‑
fl显著降低了epec的粘附，且比单独的2
’‑
fl降低效果更显著(p《0.001)，体现出了益生菌与hmo的协同效应；单独的组合物c并没有降低epec的粘附，但是加入益生菌后，gb-1496 108 mix c显著降低了epec的粘附(p《0.01)，体现了益生元与
益生菌的协同效应；单独的组合物d相比阴性对照，显著降低了epec粘附(p《0.05)，加入益生菌后，益生菌与组合物d降低的程度更加显著(p《0.01)。
[0108]
在第二次实验中(图2右部分)，将阴性对照与受试组作比较，益生菌106比阴性对照显著降低了致病菌的粘附(p《0.0001)，益生菌108比阴性对照显著降低了致病菌的粘附(p《0.0001)，组合物a比阴性对照显著降低了致病菌的粘附(p《0.0001)，gb-1496 108 组合物a也显著降低了致病菌的粘附(p《0.0001)；组合物b显著降低了致病菌的粘附(p《0.01),gb-1496 108 hmo组合物b也显著降低了致病菌的粘附，且降低的程度更明显(p《0.0001)，体现了益生元与益生菌的协同效应；hmo组合物e显著降低了致病菌的粘附(p《0.001),gb-1496 108 hmo组合物e也显著降低了致病菌的粘附，且降低的程度更明显(p《0.0001)，体现了益生元与益生菌的协同作用。hmo组合物f显著降低了致病菌的粘附(p《0.0001),gb-1496 108 hmo组合物f也显著降低了致病菌的粘附(p《0.0001)。
[0109]
益生菌gb-1496及与母乳低聚糖的组合物对跨膜电阻(teer)影响的实验结果
[0110]
多种母乳低聚糖及与益生菌gb-1496的组合物对跨膜电阻(teer)影响的实验结果参见表5和图3。
[0111]
表5
[0112][0113]
图3展示了单独的益生菌gb-1496与hmo组合物a、b、e或f在暴露于etec h10407的情况下，对跨膜电阻teer的影响(均值
±
标准误差，重复三次测量)。gb-1496(108)与hmo组合物a在t＝1(p《0.05)、t＝2(p《0.05)和t＝6(p《0.05)三个时间点，与阴性对照相比均显著提升了肠道屏障。gb-1496(108) hmo组合物e在t＝6的时间点，与阴性对照相比均显著提升了肠道屏障(p《0.05)。
[0114]
gb-1496(108) hmo组合物a在t＝4(p《0.05)和t＝6(p《0.01)两个时间点，均比单独的益生菌gb-1496(108)有显著提升，体现了益生元和益生菌的协同效应；而gb-1496(108) hmo组合物e在t＝6(p《0.05)的时间点，也比gb-1496(108)组对于teer有显著提升，体现了协同效应；而gb-1496(108) hmo组合物f在t＝6(p《0.05)的时间点，比gb-1496(108)组对于teer也有显著提升，体现了协同效应。
[0115]
益生菌gb-1496及与母乳低聚糖的组合物对肠道细胞分泌炎症因子ip-10的影响
[0116]
实验结果参见表6和图4。
[0117]
表6
[0118][0119]
图4展示了gb-1496与2
’‑
fl的组合物对于etec刺激后，caco-2细胞产生的炎症因子ip-10的影响(均值
±
标准误差，重复三次测量)。可见单独的益生菌在106浓度下，相比阴性对照，可降低炎症因子ip-10的产生(p《0.01)；而单独的益生菌在108条件下，以及单独的母乳低聚糖2
’‑
fl，在5g/l浓度下，均与阴性对照无区别，但当益生菌与hmo形成组合物之后，gb-1496在108条件下，与2
’‑
fl的组合物可显著降低炎症因子ip-10的产生(p《0.001)。