一种中药中酚酸类成分的分离方法

1.本发明属于分析化学领域，具体涉及高效液相色谱法分离分析中药中酚酸类成分的方法。
技术背景
2.亲水作用液相色谱模式(hilic)是近年来发展起来的用于分离强极性化合物的新型色谱分离技术，最早是由alpert于1990年提出的[alpert,a.j.j.chromatogr.,1990,499,177-196]。与正相色谱(nplc)相似，hilic使用极性固定相和极性相对较小的水/有机溶剂作为流动相，其中水是强洗脱溶剂。hilic可使用含水量大的溶液体系作为流动相，能够解决正相色谱的流动相对水溶性物质溶解性差，保留时间对流动相水含量十分敏感及与质谱检测器兼容等问题。同时，hilic与rplc的分离选择性差异较大，而流动相体系却相似，可以作为rplc的有效补充，与rplc组合构建二维液相色谱系统，用于复杂样品的分离。
[0003]
中药是典型的复杂体系，有效成分多种多样，包括黄酮、生物碱、有机酸、皂苷、萜类等等。单纯依靠一维反相色谱无法全面研究中药的物质基础，对与反相色谱具有正交性的分离材料提出了迫切的需求。亲水色谱材料由于与反相色谱的固定相具有较大的差异，但流动相体系兼容，及其适用于与反相色谱建立正交的多维分离体系。亲水色谱材料多种多样，色谱分析方法开发需结合固定相与样品的性质，建立中药中不同类化合物适宜的分析方法。酚酸类成分如有机酸、黄酮等中药中重要的活性成分，通常采用反相色谱进行分析，但由于成分复杂，通常存在分离选择性不足、峰容量有限的问题，结合特殊的分离材料，提供与反相材料不同的分离选择性，构建正交的二维分离体系，有望为复杂酚酸类成分的分离提供新的手段。
[0004]
本发明专利采用新型的两性离子亲水色谱固定相，建立了中药中酚酸的分离方法，目标化合物与反相c18柱、其他亲水色谱柱具有不同的分离选择性，为中药复杂体系物质基础的研究提供新的技术手段。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种中药中酚酸的色谱分离方法，获得与反相c18、其他亲水色谱材料不同的分离选择性。
[0006]
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
[0007]
1)取含酚酸类成分的中药提取物，用溶剂溶解，得中药提取物溶液；所述溶剂为甲醇、乙腈、水中的一种或二种以上；溶剂中含有终浓度为0-50mm的甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；
[0008]
2)取上述溶液注入到高效液相色谱仪中，用流动相进行洗脱，所述高效液相色谱仪中色谱柱填料是键合相末端为二元酸酐修饰氨基的两性离子基团；
[0009]
所采用的水相流动相为水，其中添加或不添加添加剂，所述水相流动相中的添加剂包括磷酸、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸中的一种或两种以上，添加剂的浓度在0-250mm(优
选10-100mm)，流动相ph值2.5-7；所采用的有机相流动相为乙腈、甲醇、丙酮中的一种或两种以上；
[0010]
洗脱过程为流动相有机相的体积比例在95％-10％。
[0011]
所述的中药酚酸成分包括银杏中银杏黄酮类化合物或金银花中有机酸类化合物。
[0012]
所述的填料为于硅胶基质表面键合有两性离子亲水色谱固定相，键合相末端为二元酸酐修饰氨基的两性离子基团，其结构示意式如下：
[0013][0014]
所述的两性离子亲水色谱固定相的制备方法为：将吡嗪二酸酐加入体积比为1/10～10/1的水/甲醇、水/乙醇或水/dmf/吡啶混合溶剂中，再加入氨基硅胶(pas)，在40～70℃条件下反应10～100小时；过滤，依次用dmf、甲醇，水，甲醇洗涤，所得固体于60～90℃条件下干燥6～48小时，即得所述固定相(zac)。
[0015]
所述的分离方法使用波长为200-400nm的紫外检测器。
[0016]
本发明具有如下优点：
[0017]
(1)分离选择性好。本发明所建立的色谱方法分离中药中有机酸、黄酮等时，具有与反相色谱、其他亲水色谱材料不同的分离选择性，为中药复杂化合物的分离分析和纯化制备奠定基础。
[0018]
(2)分析方法简便，易操作。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例1所述的银杏黄酮在不同色谱柱的分离。
[0020]
peak1 quercetin-3-o-β-d-glucoside；
[0021]
2-quercetin 3-o-β-d-(6
”‑
p-coumaroyl)glucopyranosyl(1-2)-α-l-rhamnopyranoside；
[0022]
3-rutin；
[0023]
4-quercetin-3-o-2”,6
”‑
rhamnosyl glucoside
[0024]
图2为本发明实施例2所述的有机酸在不同色谱柱的分离。
[0025]
peak1 isochlorogenic acid a；2-chlorogenic acid；3-neochlorogenic acid；
[0026]
图3为本发明实施例2所述的金银花提取物在不同色谱柱的分离。
[0027]
peak 1-isochlorogenic acid a；2-chlorogenic acid；3-neochlorogenic acid；4-isochlorogenic acid b or c。
具体实施方式
[0028]
下面通过具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
[0029]
实施例1
[0030]
采用吡嗪二酸酐键合的两性离子固定相，分析银杏黄酮类化合物，所用色谱条件如下，与其他色谱柱分析银杏黄酮的对比图见图1，在同样的流动相条件下，采用本发明中的两性离子固定相(zac)具有最长的保留时间，且峰形良好。
[0031]
色谱条件：
[0032]
色谱柱：ptz(4.6*150mm,3μm)；xbridge amide(4.6*150mm,3.5μm)；
[0033]
zic hilic(2.1*150mm,3.5μm)；rz5-zace(4.6*150mm,5μm)
[0034]
流动相：a-乙腈；b-水(含60mm甲酸铵，ph 3.2)；
[0035]
等度：a/b(82:18)
[0036]
流速：1.0ml/min&0.2ml/min
[0037]
检测波长：254nm
[0038]
样品制备：称取quercetin-3-o-β-d-glucoside、quercetin 3-o-β-d-(6
”‑
p-coumaroyl)glucopyranosyl(1-2)-α-l-rhamnopyranoside、rutin和quercetin-3-o-2”,6
”‑
rhamnosyl glucoside适量，用50％甲醇/50％水(v/v)配成浓度分别为1mg/ml的混合样品溶液。
[0039]
实施例2
[0040]
采用上述吡嗪二酸酐键合的两性离子固定相，分析有机酸类化合物，不同色谱柱的峰形和保留具有较大的差异，如图2所示，其中zac色谱柱效果最好，主要体现在保留时间最长、峰形最对称，采用其他色谱柱分析时，均存在峰形拖尾的现象。
[0041]
采用该色谱柱分析了金银花提取物，与c18色谱柱分析具有显著的差异，如图3所示，出峰顺序与c18材料不同，zac材料在有机酸的分析中显示了较好的潜力。
[0042]
有机酸对照品的分析条件：
[0043]
色谱柱：ptz(4.6*150mm,3μm)；xbridge amide(4.6*150mm,3.5μm)；
[0044]
zic hilic(2.1*150mm,3.5μm)；rz5-zace(4.6*150mm,5μm)
[0045]
流动相：a-乙腈；b-水(含150mm甲酸铵，ph 2.7)；
[0046]
流速：1.0ml/min&0.2ml/min
[0047]
洗脱条件(等度)：a/b/c(87:13)
[0048]
检测波长：325nm
[0049]
样品制备：称取isochlorogenic acid a、chlorogenic acid和neochlorogenic acid适量，用水溶解，配成各化合物浓度分别为1mg/ml的混合样品溶液。
[0050]
金银花提取物的分析条件：
[0051]
zac色谱柱：
[0052]
流动相(zac)：a-乙腈(含10mm甲酸铵)；b-水(含10mm甲酸铵，ph3.3)；
[0053]
梯度(zac)：0-40min,85-75％a；40-50min,75-50％a。
[0054]
按峰收集对应的酚酸类成分；
[0055]
c18色谱柱
[0056]
流动相(c18)：c-16mm fa水；d-16mm fa乙腈。
[0057]
梯度(c18)：0-50min,5-30％d；
[0058]
流速：1.0ml/min&0.2ml/min
[0059]
金银花样品：称取金银花样品适量，加入50％甲醇水至浓度5mg/ml，超声5h后，过
膜，得金银花提取物溶液备用。
[0060]
申请人声明，本发明通过以上实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于以上详细方法，即不意味着本发明必须依赖以上详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。