具有强裂解作用的产气荚膜梭菌噬菌体及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株具有强裂解作用的产气荚膜梭菌噬菌体及应用。


背景技术：

2.产气荚膜梭菌(clostridium perfringens, cp)也称魏氏梭菌(clostridium welchii)，革兰氏阳性厌氧菌，广泛分布于土壤、饲料、污水、动物消化道和粪便中。产气荚膜梭菌是一种能够引起人类食物中毒和动物坏死性肠炎的食源性病原，在动物产品生产过程中引发疾病并通过加工环节传播，威胁人类健康，同时给养殖行业带来巨大经济损失。产气荚膜梭菌是引起动物坏死性肠炎（necrotic enteritis, ne）的主要病原，造成较大经济损失且不利于动物福利，ne广泛分布于世界各地，呈全球流行态势，2015 年全球因ne导致的禽养殖业损失高达60亿美元。在欧美国家中，由于抗生素的限制性使用，ne发病率呈上升趋势(10%～50%)，而在我国，由于长期通过在饲料中添加抗生素等促生长剂的方法来预防和控制禽ne，耐药菌株不断产生导致防治失败，给家禽养殖业带来巨大经济损失。
3.产气荚膜梭菌为条件性致病菌，导致的疾病多突然发生而且危害严重。因此，做好预防工作是防止该病发生的首要选择。近年来，治疗产气荚膜梭菌相关疾病所采用的方法主要有疫苗预防、抗生素治疗、噬菌体的预防和治疗。其中采用疫苗和抗生素防治产气荚膜梭菌病存在较多的弊端，例如疫苗可能导致一系列不良反应，抗生素预防和治疗导致多重耐药菌的产生和致动物道菌群紊乱以及环境污染等一系列问题。随着耐药问题的日益严峻以及 2020 年“饲料端全面禁抗”的实施，利用生物防控技术进行产气荚膜梭菌防治将在养殖业中发挥巨大作用。
4.噬菌体来源于环境，作为一类细菌依赖性病毒专门侵噬细菌，面对抗生素残留及细菌耐药现象的频发，噬菌体又成为了新型抗菌制剂的候选。由于其具有自我高效复制、特异针对病原、不影响正常菌群且不产生抗性等特点，目前在国外已有较多成功应用的报道，尤其在治疗多重耐药菌方面有着极大的优势。因此针对鸡坏死性肠炎主要病原产气荚膜梭菌因芽孢传播而难以清除等特点，利用噬菌体的特异性裂解优势，抑制并清除产气荚膜梭菌，不仅可以预防亦可用于ne的治疗。噬菌体在裂解细菌中发挥的作用方式更为直接。如miller等的研究表明，噬菌体产品inf-401能够有效控制由产气荚膜梭菌引起的鸡ne，并且混合噬菌体往往优于单一噬菌体。用不同方式(灌胃、饮水和饲料)以2.5
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10
9 pfu连续饲喂5天，可显著降低ne鸡死亡率，同时还能提高肉鸡体重和饲料转化效率。有研究发现将产气荚膜梭菌噬菌体p4和p3组成“鸡尾酒”，并与细菌素结合应用，不仅能够抑制产气荚膜梭菌生长，当噬菌体加入后能够协同将产气荚膜梭菌完全清除。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中采用抗生素、疫苗等防治产气荚膜梭菌相关疾病存在的耐药性、药物残留、不良反应等缺陷，提供一种产气荚膜梭菌噬菌体，该噬菌体具有
很强的裂解细菌的作用，并且采用噬菌体进行产气荚膜梭菌相关疾病的防治，具有安全无毒、不产生抗性等特点。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：具有强裂解作用的产气荚膜梭菌噬菌体，该噬菌体为噬菌体rkp-cp-21028，于2021年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23094。
7.进一步地，所述噬菌体的基因组序列如seq id no.1所示。
8.进一步地，本发明还提供所述噬菌体的应用，所述噬菌体可应用于制备预防和/或治疗产气荚膜梭相关疾病的抑菌制剂。
9.进一步地，本发明还提供一种预防和/或治疗产气荚膜梭相关疾病的抑菌制剂，包括所述的产气荚膜梭菌噬菌体或其培养物。
10.本发明的有益效果体现在：（1）本发明发现并分离得到的噬菌体rkp-cp-21028，对养殖环境中的产气荚膜梭菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽产气荚膜梭菌的防治提供了良好的噬菌体来源；（2）本发明得到的噬菌体对产气荚膜梭菌的裂解谱较宽；对不同毒素型的产气荚膜梭菌均具有很强的裂解能力，此特性显示这株噬菌体具有很重要的生产应用价值和科学研究价值；（3）噬菌体进行传代30次的条件下，仍然可以保持较高水平的效价，表明这株噬菌体具有较强的遗传稳定性，而高稳定性对于生产运输具有非常重要的意义；（4）本发明所得噬菌体可以用于产气荚膜梭菌引起的疾病的防治和治疗，并且具有安全性极高的特性。
附图说明
11.图1为本发明实施例中产气荚膜梭菌在血琼脂基础平板上的培养特性；图2 产气荚膜梭菌在tsc板上的形态特征；图3噬菌体rkp-cp-21028对宿主菌的噬菌斑；图4噬菌体rkp-cp-21028的电镜观察照片；图5 噬菌体rkp-cp-21028对宿主的裂解试验效果；图6为噬菌体rkp-cp-21028的遗传稳定性实验结果。
具体实施方式
12.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
13.除有特殊说明，本发明实施例中涉及到的实验方法、仪器、试剂等，均为实验室常规技术手段。
14.实施例1 致病性产气荚膜梭菌的分离及其鉴定从发病养殖场采样，取粪水于流体硫乙醇酸盐培养基（ftg）中37℃厌氧培养过夜，
kit方法构建文库；具体步骤为：（1）以1μg 噬菌体基因组dna起始量建库；（2）covaris m220超声打断dna到300-500bp；（3）补平3’端加a、连接index接头（truseq
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nano dna sample prep kit）；（4）文库富集，pcr扩增8个cycles；（5）2%琼脂糖胶回收目的条带（certified low range ultra agarose）；（6）tbs380（picogreen）定量，按数据比例混合上机；（7）cbot固相载体上进行桥式pcr扩增，生成clusters；（8）illumina hiseq测序平台，进行2
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150bp测序。
20.测序结果如seq id no.1所示。
21.将噬菌体rkp-cp-21028于2021年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23094，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
22.实施例3 噬菌体rkp-cp-21028对宿主产气荚膜梭菌cp-21028的裂解效果试验将厌氧箱培养6h的宿主菌悬液以1:100的比例接种到100ml ftg流体培养基中，37℃厌氧培养2h（od约0.15，约5.0
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108cfu/ml，或者使用ftg液体培养基将菌液调整到od为0.15）将菌悬液分装在6个无菌锥形瓶中，以最佳感染复数（(moi分别为0 .1和1）向其中3个加入噬菌体悬液0.2ml(约2.5
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109pfu/ml，经0.22μm膜过滤），同时以不加噬菌体、只加同等量ftg的作为对照。分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h后分别取0 .2ml检测od600值，比较加入噬菌体后的od600变化。在细菌液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致od600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线，结果如图5所示。
23.由图5可知，相比对照组，加入噬菌体的菌液od600有所下降，尤其是moi为1的体系噬菌体的对菌的裂解效果很明显。由此可见，噬菌体对宿主菌产气荚膜梭菌具有显著的裂解作用，而且不同作用浓度均能够有效抑制产气荚膜梭菌的生长。
24.实施例4 噬菌体rkp-cp-21028的稳定性遗传实验将噬菌体连续传代30次，每代培养基中加入等量的噬菌体和宿主菌，每代培养时间6h，然后铺双平板，将噬菌体连续传29代后，测定其效价，结果如图6所示。
25.由图6可知，噬菌体在传代过程中，效价整体稳定，说明噬菌体的生物遗传稳定性较好。
26.实施例5产气荚膜梭菌噬菌体rkp-cp-21028的裂解谱系分析采用双层平板法点板法，测定本发明的产气荚膜梭菌噬菌体对菌株库保存的不同毒素型的产气荚膜梭菌的裂解效果，其中所用的产气荚膜梭菌a型20株、b型10株、c型40株、d型5株、e型5株。
27.制备不同毒素型的产气荚膜梭菌菌液，取100μl厌氧培养6h的待测菌菌液加入到0.7％的ty半固体培养基中混匀，倒入平皿中，静置凝固。取10μl噬菌体悬液滴加到软琼脂平皿上，37℃培养4-6h左右，观察有无噬菌斑出现。
28.由表1所知，本发明噬菌体对与宿主菌同毒素型的产气荚膜梭菌的裂解高达100%，对不同毒素型的产气荚膜梭菌的裂解率为92.1%。由此可见，噬菌体对同毒素型和不同毒素型的产气荚膜梭菌具有很好的裂解效果。
29.表1产气荚膜梭菌噬菌体rkp-cp-21028的裂解谱实施例6噬菌体rkp-cp-21028的安全性检测1、本实验以小鼠为实验对象，所用小鼠为7～8周龄雌性spf级小鼠，重约25g左右，共30只。分为2组，各15只；实验组正常饲喂加噬菌体109pfu/0.1ml/只；对照组正常饲喂加相同体积的sm缓冲液。连续喂养7天，观察小鼠日常行为、内脏以及及消化黏膜的变化情况。
30.观察结果显示，以此量的噬菌体饲喂实验用小鼠，小鼠的日常行为没有变化、均正常，解剖检查小鼠的内脏和消化道无异常，且在饲喂结束两到三天后，在小鼠的粪便中检测不到噬菌体的存在。
31.2、噬菌体rkp-cp-21028在禽类养殖过程中的预防性抗/抑菌效果本实验以雏鸡为实验对象，通过选20日龄雏鸡120只，分为6组，每组20只。其中第1组为对照组，进行正常的饲喂7天；第2组正常饲喂的情况下用噬菌体rkp-cp-21028灌服，1
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108pfu/0.1ml/只，连续灌服7天；第3组正常饲喂的情况下用噬菌体rkp-cp-21028灌服，1
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109pfu/0.1ml/只，连续灌服7天；第4组正常饲喂的情况下用噬菌体rkp-cp-21028灌服，1
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10
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pfu/0.1ml/只，连续灌服7天；第5组正常饲喂加恩拉霉素饮水（0.05％w/v）连续饮水7天；第6组空白对照，进行正常的饲喂7天。
32.分别对前5组雏鸡在第8天以108pfu/0.1ml/只的量进行产气荚膜梭菌cp-21028感染，第10天对雏鸡进行解剖观察肠道健康情况、分析坏死性肠炎发生状况并统计结果（-为正常小肠， 为肠道轻度黏液覆盖， 为严重坏死性肠炎），统计每组雏鸡的死亡率，结果参见表2。
33.表2噬菌体rkp-cp-21028在禽类养殖过程中的预防性抗/抑菌情况统计表由表2可以看出，饲喂噬菌体组与饲喂抗生素组的肠道评分和死亡率均低于对照
组，且肠道无显著的病理性损伤；仅饲喂噬菌体组的小鼠的健康情况与空白对照组比较，没有显著的差异，表明使用噬菌体rkp-cp-21028饲喂雏鸡无显著的副作用，具有安全无毒副作用的特性；而且噬菌体以1
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108、1
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109、1
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pfu/0.1ml/只的剂量饲喂小鼠，均具有抗/抑制产气荚膜梭菌的效果，表明本发明提供的噬菌体rkp-cp-21028在养殖过程中具有预防性抗/抑菌的效果。