黄芪甲苷在缓解T-2毒素致线粒体损伤中的应用

黄芪甲苷在缓解t-2毒素致线粒体损伤中的应用
技术领域
1.本发明涉及黄芪甲苷的新用途，具体涉及黄芪甲苷用作农作物农药、动物饲料添加剂和人保健品缓解t-2毒素致线粒体损伤中的应用。


背景技术：

2.t-2毒素是单端孢霉烯族毒素中毒性最强的真菌毒素，在自然界中广泛分布，常污染玉米、小麦和大麦等作物，引起农作物减产、人和动物中毒。t-2毒素进入动物机体会引起动物发育迟缓、体重减轻、软骨损伤和免疫功能下降等。t-2毒素在细胞内的主要作用靶点为线粒体，通过作用于线粒体，引起氧化应激反应，导致线粒体损伤、细胞死亡，最后导致机体损伤。t-2毒素天然产生，难以控制，常给种植业、养殖业和人类健康带来严重影响，产生巨大经济损失。为此，筛选能缓解t-2毒素致线粒体损伤的药物对农业发展和人类健康都极为重要。
3.近年来，植物药物作为天然抗氧化剂逐渐受到重视，同时我国中药资源丰富，药效和安全性也得到广泛认可。另外，许多研究表明，植物药物相比化学合成药物，具有毒副作用小的优势，因而具有较大开发潜力。
4.黄芪是常见抗氧化中药之一，其中的活性成分黄芪甲苷因其具有黄芪其他成分无法比拟的生物活性而作为黄芪药材质量优劣的评价标准。现代药理学研究发现，黄芪甲苷具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等药理学作用。鉴于黄芪甲苷表现出来的优势，越来越多的科研人员都在进一步发掘其新用途，以充分利用黄芪甲苷的药用价值。目前，未见黄芪甲苷在缓解t-2毒素致线粒体损伤中的作用和相关应用的研究报道。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供黄芪甲苷在缓解t-2毒素致细胞毒性中的保护作用。
6.本发明的第二个目的是提供黄芪甲苷在缓解t-2毒素致线粒体损伤中的保护作用。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.本发明采用cck-8和乳酸脱氢酶释放实验检测2.5μm黄芪甲苷对10nm t-2毒素引起的细胞毒性的保护作用。
9.本发明进一步采用线粒体膜电位检测、rt-qpcr法测定mtdna含量、免疫荧光法测定线粒体数量变化和atp含量检测2.5μm黄芪甲苷对10nm t-2毒素引起的线粒体损伤中的保护作用。
10.与现有技术相比本发明具有以下有益效果：
11.黄芪甲苷能够逆转t-2毒素诱导的hepg2细胞的细胞毒性和线粒体损伤；本发明发现了黄芪甲苷新用途，开拓了一个新的应用领域，并且黄芪甲苷药理效果好，且毒性低，预示着良好的药用前景。
2毒素处理组，其中2.5μm黄芪甲苷预处理细胞6h，再用10nm t-2毒素处理18h；弃去培养液，加入pbs缓冲液洗涤细胞一次，吸掉pbs缓冲液，加入无血清培养基配制的tmre探针，细胞培养箱培养30min，弃掉培养基，无血清培养基洗涤细胞2次，加入300μl有血清培养基，荧光显微镜下观察。
21.(2)mtdna含量：细胞铺板至6孔板中，5％co2，37℃细胞培养箱培养24h；细胞分组如下：对照组、10nm t-2毒素处理组、2.5μm黄芪甲苷处理组和2.5μm黄芪甲苷 10nm t-2毒素处理组，其中2.5μm黄芪甲苷预处理细胞6h，再用10nm t-2毒素处理18h；弃去培养基，胰酶消化细胞，转移至1.5mlep管，2000rpm，5min，弃上清；加200ul gtl，震荡样品彻底悬浮，加入4μl浓度为100mg/ml的rnase a溶液，涡旋15s，室温放置2min；加入20μl proteinase k，加入200μl buffer gl，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10min；短暂离心去除管壁水珠，加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心；将上一步所得溶液全部转移至收集管的吸附柱(spin columns dm)中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入500μl buffer gw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入500μl buffer gw2，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；重复该步骤1次，以提高dna纯度；12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干，以去除残余乙醇；将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50μl灭菌水，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集dna溶液；为提高dna的浓度，将得到的溶液重新吸到吸附柱中，室温静置5min，12000rpm离心1min；收集dna溶液，进行rt-qpcr实验。
22.(3)rt-qpcr：取dna样品放置冰上，用ddh2o稀释至终浓度为0.4ng/μl，rt-qpcr的反应体系如下(20μl)：
23.荧光定量pcr反应体系
[0024][0025]
将液体混匀离心后，用bio-rad cfx pcr system进行荧光定量pcr实验，程序设置如下：
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荧光定量pcr反应程序
[0027][0028]
实验数据按2-δδct
法处理。
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(4)免疫荧光分析线粒体含量：细胞铺板至24孔板中，5％co2，37℃细胞培养箱培养24h；细胞分组如下：对照组、10nm t-2毒素处理组、2.5μm黄芪甲苷处理组和2.5μm黄芪甲苷 10nm t-2毒素处理组，其中2.5μm黄芪甲苷预处理细胞6h，再用10nm t-2毒素处理18h；弃去培养基，pbs洗涤细胞一至两次，然后添加300μl 4％多聚甲醛，室温固定细胞10min；吸去4％多聚甲醛，用pbs洗细胞两次后添加300μl 0.5％triton x-100溶液用于细胞穿孔，室温孵育5min；弃去triton x-100溶液后用pbs清洗细胞三次，取稀释过的一抗(anti-mitochondria，5％fbs溶液稀释，稀释比例为1∶500)20μl添加到盖玻片上，室温孵育45min；弃去一抗，添加pbs清洗盖玻片三次；取20μl用pbs稀释过的二抗alexafluor592(稀释比例为1∶2000)滴于盖玻片中央，室温避光孵育45min；吸去二抗，用pbs洗细胞三次后加浓度为1ng/ml的dapi溶液20μl至盖玻片中央，室温孵育2min后用pbs洗盖玻片三次，以彻底清除dapi；取载玻片做好标记并在上面添加封片剂(prolong gold antifade reagent)10μl，将盖玻片(有细胞的一面)贴在封片剂上，在盖玻片的周围涂抹薄薄的一层指甲油用于固定，然后用zeiss倒置荧光显微镜观察。
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(5)atp含量：细胞铺板至6孔板中，5％co2，37℃细胞培养箱培养24h；细胞分组如下：对照组、10nm t-2毒素处理组、2.5μm黄芪甲苷处理组和2.5μm黄芪甲苷 10nm t-2毒素处理组，每组设置3个平行重复孔，其中2.5μm黄芪甲苷预处理细胞6h，再用10nm t-2毒素处理18h；去除培养基，加入200μl裂解液裂解细胞，移液器反复吹打；转移至1.5ml ep管中，4℃，12000g离心5min，取上清；取适量atp检测试剂，按照1∶9比例用atp检测试剂稀释液稀释atp检测试剂；加入100μl atp检测工作液到96孔板中，室温放置5min；加入20μl样品，迅速用枪混匀，化学发光仪测定rlu。
[0031]
结果如图2a所示，与对照组相比，10nm t-2毒素处理hepg2细胞，线粒体膜电位极其显著降低46％(p＜0.001)；与10nm t-2毒素处理组相比，2.5μm黄芪甲苷预处理下，线粒
体膜电位水平显著上调21％(p＜0.01)，表明2.5μm黄芪甲苷能恢复10nm t-2毒素引起的线粒体膜电位丢失。
[0032]
结果如图2b所示，与对照组相比，10nm t-2毒素处理hepg2细胞，mtdna含量极其显著增加75％(p＜0.001)；与10nmt-2毒素处理组相比，2.5μm黄芪甲苷预处理下，mtdna含量极显著降低60％(p＜0.01)，表明2.5μm黄芪甲苷能降低t-2毒素引起的线粒体dna的增加。
[0033]
结果如图2c所示，与对照组相比，10nm t-2毒素处理hepg2细胞，线粒体数量显著增加1.17倍(p＜0.05)；与10nm t-2毒素处理组相比，2.5μm黄芪甲苷预处理下，线粒体数量显著降低1.52倍(p＜0.01)，表明2.5μm黄芪甲苷能降低t-2毒素引起的线粒体数量的增加。
[0034]
结果如图2d所示，与对照组相比，10nm t-2毒素处理hepg2细胞，atp含量降低至3.23μm(p＜0.01)；与10nm t-2毒素处理组相比，2.5μm黄芪甲苷预处理显著增加hepg2细胞atp含量至4.17μm(p＜0.05)，表明2.5μm黄芪甲苷能上调10nm t-2毒素引起的atp含量降低。