一株调控产酸的毕赤酵母及应用的制作方法

1.本发明涉及一株调控产酸的毕赤酵母及应用，属于酿造微生物技术领域。


背景技术：

2.毕赤酵母是酱香型白酒发酵中最常用的产酒功能菌株之一。毕赤酵母具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分的优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。
3.研究发现，毕赤酵母在发酵过程中能有效抑制酸败菌(食果糖乳杆菌、乳酸菌、霉菌为主)的生长与产乳酸的作用。大量乳酸菌的生长导致在白酒酿造过程中乳酸的大量积累，使得酒醅酸度过高，进而影响其它产酒酵母的生长与产酒，其中食果糖乳杆菌在发酵产醇阶段，通过异型乳酸发酵主导的乙醇代谢模式引起发酵体系乳酸过度积累,造成“乳酸高酒精不低”的现象，影响后续轮次发酵。因此，通过控制发酵体系生物因素来抑制酸败菌的生长尤为重要。


技术实现要素：

4.为了解决酱香型白酒发酵过程中因酸败菌生长带来的乳酸过度积累问题，减小发酵存在酸败的风险，本发明提供了一株调控产酸的毕赤酵母及其在酒醅发酵过程中的应用。
5.本发明提供了毕赤酵母cgmcc no:14068在抑制酒醅中的微生物产乳酸方面的应用；所述毕赤酵母，其分类命名为库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichia kudriavzevii)，已于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no:14068，并公开于公开号为cn107287127a的专利申请中。
6.在一种实施方式中，所述酒醅中的微生物包括但不限于抑制植物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌或面包乳杆菌。
7.本发明提供了毕赤酵母cgmcc no:14068在抑制酒醅酸败方面的应用。
8.在一种实施方式中，所述应用是将所述毕赤酵母以≥1
×
109cfu/kg酒醅的接种量加入至用于发酵的酒醅中，再将酒醅发酵。
9.在一种实施方式中，所述酒醅为酱香型白酒酒醅。
10.在一种实施方式中，所述抑制酒醅酸败包括但不限于抑制酒醅产生板结现象。
11.在一种实施方式中，所述毕赤酵母cgmcc no:14068以菌泥的形式加入至酒醅中。
12.在一种实施方式中，所述应用是将所述毕赤酵母cgmcc no:14068以1～10％的质量百分比加入至酒醅中。
13.在一种实施方式中，所述应用是将所述毕赤酵母cgmcc no:14068以5％的质量百分比加入至酒醅中，与酒醅混匀后堆积发酵。
14.本发明还提供了所述毕赤酵母cgmcc no:14068在酱香型白酒生产中的应用。
15.在一种实施方式中，所述应用包括但不限于将所述毕赤酵母cgmcc no:14068用于酱香型酒醅发酵。
16.有益效果：
17.(1)本发明应用毕赤酵母cgmcc no:14068有效降低了植物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌和面包乳杆菌发酵产生的乳酸含量，可在高粱汁培养基中使乳酸菌的乳酸产量相比于乳酸菌单独发酵的产量降低64.0％～94.1％；
18.(2)本发明将cgmcc no:14068加入至酱香型白酒发酵酒醅中，可显著改善酒醅板结、霉变的现象。
附图说明
19.图1为发酵酒醅呈现的酸败、板结现象。
20.图2为原位发酵体系菌群发酵的酸败抑制。
21.图3为原位发酵体系酒醅的乙酸、乳酸含量。
具体实施方式
22.(一)培养基
23.高粱汁培养基的制备：将高粱与水以1:4(m:v)的比例混合，加淀粉酶(酶活单位：20000u/ml)1μl酶/g高粱蒸煮液化，60℃加糖化酶(酶活单位：100000u/ml)5μl/g高粱糖化，四层纱布过滤，10000r/min离心10分钟，上清液调节糖度至7
°
bx；
24.(二)检测方法
25.乳酸检测方法：取1ml发酵液于2ml离心管，12000rpm4℃离心10min，取一定量的上清液，用超纯水稀释30倍，过0.2μm滤膜过滤，滤液进样液相色谱分析。
26.乙酸检测方法：称取15g酒醅于50ml离心管中，加入30ml超纯水，280rpm振荡15min，超声5min，4℃条件下4000rpm离心6min，吸取上清液710μl置于ep管中，加入790μl95％乙醇，-20℃冷冻2小时以上，4℃条件下12000rpm离心10min，离心后上清液(不少于0.5ml)转移至2ml样品瓶中进样分析。
27.乙醇检测方法：取15g酒醅于50ml离心管中，加入30ml超纯水，280rpm振荡15min，超声5min，4℃条件下4000rpm离心6min，吸取4ml上清液于20ml顶空进样瓶中进样分析。
28.乳酸下降率：乳酸下降率是指发酵结束后，对照组与实验组的乳酸含量之差与对照组乳酸含量的百分比。
29.实施例1毕赤酵母对乳酸菌的产酸抑制
30.种子液的制备：将毕赤酵母cgmcc no:14068接种于ypd液体培养中，于30℃预培养至菌体浓度od值为0.3，获得毕赤酵母种子液。
31.将从酒醅中原位筛选的植物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌、面包乳杆菌分别接种于mrs液体培养基中，于37℃预培养至od值达0.3。
32.空白组1：灭菌高粱汁培养基(糖度7
°
bx)1.5ml，37℃下静置72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
33.空白组2：将7.5μl毕赤酵母种子液接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
34.实验组1：7.5μl毕赤酵母种子液与7.5μl植物乳杆菌种子液混合接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时。，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
35.实验组2：7.5μl毕赤酵母种子液与7.5μl乳酸片球菌种子液混合接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
36.实验组3：7.5μl毕赤酵母种子液与7.5μl桥乳杆菌种子液混合接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。。
37.实验组4：7.5μl毕赤酵母种子液与7.5μl面包乳杆菌种子液混合接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
38.对照组1：取植物乳杆菌种子液7.5μl接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
39.对照组2：取乳酸片球菌种子液7.5μl接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
40.对照组3：取桥乳杆菌种子液7.5μl接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
41.对照组4：取上述面包乳杆菌种子液7.5μl接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵终点的发酵液中乳酸含量及乳酸菌菌体量。
42.表1不同培养体系发酵终点的乳酸含量
[0043][0044][0045]
对比例1毕赤酵母模式菌株atcc6258对乳酸菌的产酸抑制
[0046]
毕赤酵母cgmcc no:14068种子液的制备：将毕赤酵母cgmcc no:14068接种于ypd液体培养中，于30℃预培养至菌体浓度od值为0.3，获得毕赤酵母种子液。
[0047]
将植物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌、面包乳杆菌分别接种于mrs液体培养基中，于37℃预培养至od值达0.3，分别获得植物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌、面包乳杆菌的种子液。
[0048]
将7.5μl毕赤酵母模式菌株atcc6258的种子液分别与7.5μl植物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌或面包乳杆菌接种于1.5ml高粱汁培养基中，37℃下静置培养72小时，测定发酵结束后的四组发酵培养基中的乳酸含量，以毕赤酵母atcc6258单独在高粱汁培养基中发酵作为对照，结果如表2所示。
[0049]
表2不同培养体系发酵终点的乳酸含量
[0050][0051]
结果显示，毕赤酵母模式菌株atcc6258对物乳杆菌、乳酸片球菌、桥乳杆菌和面包乳杆菌产乳酸抑制效果远低于本技术的菌株(pichia kudriavzevii)cgmcc no:14068。
[0052]
对比例2毕赤酵母在高粱汁中对乳酸菌产乳酸的抑制能力
[0053]
将从酒醅中原位筛选的发酵乳杆菌、丝状片球菌、肠系膜明串珠菌分别接种于mrs液体培养基中，于37℃预培养至od值达0.3。
[0054]
将毕赤酵母cgmcc no:14068按照实施例1的方法制备种子液。
[0055]
按照实施例1相同的策略，将7.5μl毕赤酵母cgmcc no:14068的种子液分别与7.5μl发酵乳杆菌、丝状片球菌或肠系膜明串珠菌接种于1.5ml高粱汁培养基中，于37℃下静置培养72小时，测定发酵结束后的四组发酵培养基中的乳酸含量。
[0056]
表3不同培养体系发酵终点的乳酸含量
[0057][0058]
结果显示，毕赤酵母cgmcc no:14068对于不同乳酸菌产乳酸的抑制能力不同，不具有普适性。
[0059]
实施例2原位发酵体系菌群发酵的酸败抑制
[0060]
毕赤酵母cgmcc no:14068菌剂的制备：将毕赤酵母cgmcc no:14068接种于高粱汁液体培养基中，30℃恒温震荡培养48h，将获得的培养液在12000r/min下离心10min，弃上清液，获得毕赤酵母cgmcc no:14068的菌体细胞沉淀，用无菌水洗涤数次，并用血球计数板计
算酵母菌液的浓度，结果显示，菌泥的菌体量为106cfu/g菌泥。
[0061]
实验组：将毕赤酵母cgmcc no:14068菌剂按5％(质量百分比)的比例与制酒生产中已丢堆的糟醅(500
±
10g)混合均匀，疏松地装于搪瓷缸中，并用纱布封口后，埋于堆积发酵阶段酒醅发酵堆深约20厘米处，设置3个平行；
[0062]
对照组：将制酒生产中已丢堆的糟醅(500
±
10g)，疏松地装于搪瓷缸中，并用纱布封口后，与实验组同埋于堆积发酵阶段酒醅发酵堆子深约20公分处，共设置3个平行；
[0063]
窖内发酵阶段，将上述实验组和对照组同时转移至窖内酒醅距窖面深约1.5米处，窖内发酵结束，观察实验组与对照组发酵感官情况。
[0064]
结果显示(图2)，在搪瓷缸中未添加毕赤酵母的原位对照组发生了酒醅结块现象，而添加毕赤酵母的实验组酒醅松散，未出现结块现象。经检测，对照组酒醅中的乳酸含量为9.3199g/kg酒醅，乙酸含量为1.6083g/kg酒醅，添加毕赤酵母酒醅中的乳酸含量为3.2667g/kg酒醅，乙酸含量为0.7837g/kg酒醅，乳酸的下降率为64.9％，乙酸下降率为51.3％。同时，对照组酒醅中的乙醇含量为15.12g/kg酒醅，与添加毕赤酵母酒醅中乙醇含量无显著性差异。因此，毕赤酵母可以使发酵过程中乳酸含量降低，而不影响乙醇的代谢功能。
[0065]
表4原位发酵体系酒醅乳酸、乙酸含量
[0066][0067]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。