一种促进成骨细胞分化的含硒特立帕肽和融合多肽及其应用

一种促进成骨细胞分化的含硒特立帕肽和融合多肽及其应用
技术背景
1.本发明涉及活性肽技术领域。更具体地，涉及一种促进成骨细胞分化的含硒特立帕肽及其应用。

背景技术：

[0002][0003]
近些年随着我国社会人口向老龄化发展，骨质疏松症(osteoporosis,op)疾病发生率和患病总人数呈逐渐升高的趋势，已成为人类日益重要的健康问题，其治疗花费高，并发症多，患者生存质量差，给家庭和社会带来沉重负担。如何有效预防和治疗骨质疏松症是目前科研者研究的焦点和急需解决的重要难题。有相关研究证实，成骨细胞在骨质疏松症整个疾病发生发展病理过程中处于十分关键的地位，其不但在骨组织形成过程中起着不可替代的作用，还可直接合成和分泌较多细胞因子，进而对破骨细胞的生长、分化等生物学行为发挥决定性的作用，最终对机体骨组织吸收过程予以有效调节和控制。成骨细胞是一种具有形成骨组织潜在能力的功能细胞，而有效加快其增殖速度和促进成骨分化进程均具有十分重要的临床意义。
[0004]
特立帕肽(teriparatide)一种合成的多肽激素，为人甲状旁腺素pth的1-34号氨基酸片段，h-ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-his-asn-phe-oh，是目前临床治疗骨质疏松的常见多肽类药物。它是第一种获得美国食品及药物管理局fda批准的骨形成剂类新药，这种甲状旁腺激素的衍生物可以通过增加成骨细胞的活性及数量而促进骨生长，而目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失。近期涉及到1637例绝经后骨质疏松症患者的临床研究结果显示，与那些只服用了钙和维生素d补加剂的患者相比，96％的患者在接受该药治疗后，其脊柱和臀部的骨(矿物质)密度bmd均表现出显著增加。此外还发现，该药能够分别减少发生脊柱骨折和其他类型骨折危险的65％和53％。该药的另一个特点是副作用相对比较小。
[0005]
硒(se)是一种生命必需的微量营养素，受到人们广泛的关注，通过硒蛋白(含硒酶)，它参与各种生物过程，如抗氧化防御、甲状腺激素产生和免疫反应。虽然硒对骨代谢的重要性尚不清楚，但一些临床疾病如大骨节病与硒缺乏有关。虽然硒缺乏会导致生长迟缓，但尚未确定这种生长抑制是否与骨代谢的变化有关。同时骨细胞中存在多种含硒酶的表达，但硒与骨健康营养和生理作用仍不明确。微量元素硒对人体健康的益处得到了普遍认可，而生物活性硒肽是补充硒元素的重要有机来源之一。随着对硒及其衍生物相关营养学价值探究的愈发深入，硒肽除却其基础营养价值外的多种潜在健康益处也逐渐被发现。以临床抗骨质疏松多肽药物：特立帕肽为活性结构为中心，将含蛋氨酸或半胱氨酸序列替换为含硒代氨基酸或硒代半胱氨酸，或在多肽序列上添加一定数量的硒代氨基酸或硒代半胱氨酸，设计人工合成硒肽。硒肽具有生物安全性高，具有低抗原性、低过敏性、高可溶性等特性。因此，寻找高效的有利于成骨细胞分化过程的硒肽对于抗骨质疏松药物的开发有着非常重要的意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的第一个目的在于提供活性高、毒性小的促进成骨细胞矿化的含硒特立帕肽。
[0007]
本发明的第二个目的在于提供上述含硒特立帕肽在促进成骨细胞分化，预防和/治疗骨质疏松方面的应用。
[0008]
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0009]
根据本发明的第一个目的，本发明提供一种含硒特立帕肽，所述含硒特立帕肽的氨基酸序列包括如下序列中的一种或多种：
[0010]
(1)svseiql{sem}hnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnf；其中，母体特立帕肽序列中8位蛋氨酸被替换成硒代蛋氨酸；
[0011][0012]
(2)svseiqlmhnlgkhlns{sem}ervewlrkklqdvhnf；其中，母体特立帕肽序列中18位蛋氨酸被替换成硒代蛋氨酸；
[0013][0014]
(3)svseiql{sem}hnlgkhlns{sem}ervewlrkklqdvhnf；其中，母体特立帕肽序列中8，18位蛋氨酸均被替换成硒代蛋氨酸；
[0015]
[0016]
进一步的，本发明提供一种融合多肽，所述融合多肽包含上述的含硒特立帕肽中的一种。所述的融合多肽可以是通过化学结合、酶切或者物理断裂方法获得。例如将多肽与卵清白蛋白或者牛血清白蛋白形成的蛋白复合体。
[0017]
本发明的含硒特立帕肽可以通过本领域已知的其他方法制备得到，例如固相合成的方法、生物工程的方法等等。
[0018]
根据本发明的第二个目的，本发明提供所述含硒特立帕肽在促进成骨细胞分化的药物中的应用。进而提供所述含硒特立帕肽在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的应用。
[0019]
本发明进一步涉及一种药物，其中含有本发明的含硒特立帕肽，例如svseiql{sem}hnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnf(母体特立帕肽序列中8位蛋氨酸被替换成硒代蛋氨酸)；svseiqlmhnlgkhlns{sem}ervewlrkklqdvhnf(母体特立帕肽序列中18位蛋氨酸被替换成硒代蛋氨酸)；svseiql{sem}hnlgkhlns{sem}ervewlrkklqdvhnf(母体特立帕肽序列中8，18位蛋氨酸均被替换成硒代蛋氨酸)中的一种或多种。
[0020]
本发明的药物可以制成本领域常见的各种形式，包括但不限于，适于口服的散剂、片剂(包括各种包衣片剂、缓释或控释片剂)、锭剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、颗粒剂、丸剂、可分散粉末、水性或油性混悬剂、水性或油性溶液剂、乳剂、酏剂、糖浆剂等等，适于局部使用的霜剂、软膏剂、凝胶、水性或油性溶液剂、水性或油性混悬剂等等；适于吸入使用的粉末或液体气雾剂；适于经胃肠外给药的静脉内、皮下或肌内注射用无菌水性或油性的注射剂或冻干粉针剂、栓剂等等。
[0021]
本发明的药物中可以进一步含有常规的各种辅料和/或其他活性成分。合适的辅料包括但不限于赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、水溶性聚合物、无机盐、溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、起泡剂和调味剂等等。
[0022]
本发明的有益效果如下：
[0023]
本发明获得含硒特立帕肽可以有效促进成骨细胞矿化，预防和/或治疗骨质疏松，减轻骨质疏松患者的痛苦，这些多肽具有高效低毒的特点。
附图说明
[0024]
图1是24h含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠mc3t3-e1细胞增殖率比较图。
[0025]
图2是48h含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠mc3t3-e1细胞增殖率比较图。
[0026]
图3是72h含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠mc3t3-e1细胞增殖率比较图。
[0027]
图4是24h含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠mc3t3-e1细胞碱性磷酸酶活性比较图。
[0028]
图5是48h含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠mc3t3-e1细胞碱性磷酸酶活性比较图。
[0029]
图6是72h含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠mc3t3-e1细胞碱性磷酸酶活性比较图。
具体实施方式
[0030]
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0031]
实施例1含硒特立帕肽对小鼠成骨细胞mc3t3-e1增殖的影响
[0032]
基于图1-图3设计获得的3种含硒特立帕肽的氨基酸序列，通过固相合成方法获得实验样品，进行成骨细胞增殖活性验证。固相合成肽公司：吉尔生化(上海)有限公司。
[0033]
小鼠成骨细胞mc3t3-e1增殖率的检测：
[0034]
选择处于对数期生长的成骨细胞mt3t3-e1，按照2
×
104个/ml的密度，将细胞加入96孔板中，每孔100μl细胞悬液，实验设置为5组，空白对照组：仅加入含1％胎牛血清的dmem培养基；阳性对照组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，分别加入终浓度为0；62.5；125；250；500ug/ml的特立帕肽；1号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，分别加入终浓度为0；62.5；125；250；500ug/ml的1号含硒特立帕肽；2号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度0；62.5；125；250；500ug/ml的2号含硒特立帕肽；3号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度0；62.5；125；250；500ug/ml的3号含硒特立帕肽。每各实验组设置4个复孔，加入药物作用24h、48h和72h后予以mtt法检测各组细胞的増殖率，实验结束前4h需加入20μl的mtt(5g/l)，然后在37℃、5％co2温度条件下孵育作用4h，吸取和丢弃培养液后加入0.15ml的二甲基亚砜溶液，振摇作用数分钟后直至结晶完全溶解后，使用酶标仪检测其吸光度(od值)，检测波长＝570nm，参考波长＝630nm。细胞增殖率计算公式为：增殖率＝(a样品－a空白)/(a空白血清-a空白)
×
100％。
[0035]
实施例2含硒特立帕肽对小鼠mt3t3-e1细胞碱性磷酸酶的的影响
[0036]
小鼠成骨细胞mt3t3-e1碱性磷酸酶活性的检测：
[0037]
选择处于对数期生长的成骨细胞mt3t3-e1，按照2
×
104个/ml的密度，将细胞加入96孔板中，每孔100μl细胞悬液，实验设置为5组，空白对照组：仅加入含1％胎牛血清的dmem培养基；阳性对照组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，分别加入终浓度为0；62.5；125；250；500ug/ml的特立帕肽；1号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，分别加入终浓度为0；62.5；125；250；500ug/ml的1号含硒特立帕肽；2号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度0；62.5；125；250；500ug/ml的2号含硒特立帕肽；3号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度0；62.5；125；250；500ug/ml的3号含硒特立帕肽。每各实验组设置4个复孔，药物干预作用24h、48h和72h后，吸取和丢弃培养液，使用pbs缓冲液彻底清洗处理2次，将100μl的细胞裂解液(1％tritonx-100)加入每孔内，在4℃温度条件下裂解作用30分钟，根据碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天)的说明书进行检测。
[0038]
实施例3含硒特立帕肽对小鼠mt3t3-e1细胞矿化结节的影响
[0039]
小鼠成骨细胞mt3t3-e1矿化结节的测定：
[0040]
选择处于对数期生长的成骨细胞mt3t3-e1，按照1
×
105个/ml的密度加入6孔板，每孔2ml细胞悬液，培养24h后吸取和丢弃原培养液，换为不含胎牛血清的培养液，饥饿细胞24h待细胞贴壁后，吸取和丢弃不含胎牛血清的培养液，实验设置为5组，空白对照组：仅加入含1％胎牛血清的dmem培养基和三种成骨诱导剂(地塞米松10nmol，β-甘油磷酸钠10mmol,抗坏血酸5μg/ml)；阳性对照组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基和三种成骨诱导剂(地塞米松10nmol，β-甘油磷酸钠10mmol,抗坏血酸5μg/ml)以外，加入终浓度为250ug/ml的特立帕肽；1号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基和三种成骨诱导剂(地塞米松10nmol，β-甘油磷酸钠10mmol,抗坏血酸5μg/ml)以外，加入终浓度为250ug/ml的1号含硒特立帕肽；2号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度250ug/ml的2号含
硒特立帕肽；3号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度250ug/ml的3号含硒特立帕肽。每各实验组设置4个复孔，37℃、5％co2浓度的细胞培养箱分别观察培养14天和21天后，弃去培养基，并用pbs清洗两遍。之后根据细胞钙茜素红染色试剂盒的说明书进处理，最后在倒置显微镜下进行mt3t3-e1细胞间矿化结节观察和计数。
[0041]
小鼠成骨细胞mt3t3-e1上清液骨钙素的检测：
[0042]
将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞mc3t3-e1接种于24孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，24h后弃去培养基。实验设置为5组，空白对照组：仅加入含1％胎牛血清的dmem培养阳性对照组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度为250ug/ml的特立帕肽；1号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度为250ug/ml的1号含硒特立帕肽；2号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度250ug/ml的2号含硒特立帕肽；3号肽组：除加入含1％胎牛血清的dmem培养基以外，加入终浓度250ug/ml的3号含硒特立帕肽。分布培养14天和21天。培养结束后，收集培养基，其骨钙素含量由放射免疫试剂盒进行检测，以得到样品中骨钙素含量。
[0043]
综上，本发明实施例证明的含硒特立帕肽具有较好的促小鼠成骨细胞mt3t3-e1增殖，碱性磷酸酶分泌和矿化作用，是一种具有潜力预防/治疗骨质疏松的生物活性硒肽。
[0044]
表1特立帕肽贺含硒特立帕肽氨基酸序列
[0045][0046]
表2含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠胚胎成骨细胞mc3t3-e1矿化结节计数比较
[0047][0048]
表3含硒特立帕肽和特立帕肽对小鼠胚胎成骨细胞mc3t3-e1中骨钙素含量比较
[0049][0050]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可
以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。