用于治疗门静脉炎症和纤维化的噻吩衍生物的制作方法

1.本发明涉及医学领域，特别地，涉及肝脏疾病领域。


背景技术：

2.一些肝脏疾病具有与肝门静脉周围炎症相关、有时与肝门静脉周围纤维化相关的特定方面。
3.在这种情况下，考虑非酒精性脂肪性肝炎(nash)可能会很有趣。典型的成人nash组织学模式(称为nash 1型)的特点是存在脂肪变性(主要是大泡)，伴有气球样变性和/或窦周纤维化(3区小叶受累)，并且门静脉束相对较少。然而，儿科型nash(nash 2型)被描述为在没有气球样变性和窦周纤维化的情况下存在脂肪变性以及门静脉炎症和/或纤维化。
4.更一般地，angulo等人(2015年，gastroenterology，149卷，389-397页)报道，门静脉炎症等级与无肝移植的存活率和无肝相关事件的存活率负相关，而没有观察到与脂肪变性等级和小叶炎症等级相关。此外，gadd等人(2014年，hepatology，59卷，1393页)报道，nash中的门静脉炎症与疾病严重程度密切相关。因此，患有门静脉炎症的nash患者代表了需要特定治疗护理的较高风险人群。
5.奥贝胆酸(oca)已经成功完成治疗nash的iii期临床试验。尽管该药物对脂肪变性和小叶炎症有明显效果，但对门静脉炎症没有效果。
6.尽管wo2019/010024公开，将半胱胺盐或胱胺盐用于治疗患有与门静脉周围/门静脉肝脏炎症相关的疾病或病症的患者，但仍然强烈需要能够特异性作用于肝的门静脉周围炎症和任选地作用于门静脉纤维化的药物。


技术实现要素：

7.本技术提供能够特异性作用于肝门静脉周围/门静脉炎症和任选作用于门静脉周围/门静脉纤维化的化合物。这种效果是出乎意料的。实际上，发明人还试验了另一种参考化合物，即奥贝胆酸(oca)。oca对肝门静脉/门静脉周围炎症完全没有影响。由于oca选择性抑制nk-kb介导的肝的炎症反应并抑制nf-kb活化，而本发明的化合物也能够抑制nf-kb途径，所以显然的是，与oca没有效果相比，本发明的化合物对肝门静脉/门静脉周围炎症的特异性效果不能仅仅基于这种机制。因此，这种特异性药理学效果是令人惊讶且出乎意料的。
8.这种新的药理学效果支持将这些化合物用于治疗与肝门静脉/门静脉周围炎症相关的疾病和病症如儿科nafld和儿科nash。
9.此外，这种新的药理学效果支持将这些化合物用于呈现肝门静脉/门静脉周围炎症的疾病和病症。特别地，本发明的化合物特别可用于治疗患有这些疾病或病症之一的患者的亚组，所述患者还具有肝门静脉/门静脉周围炎症。
10.例如，如背景部分所述，患有nash和门静脉周围或门静脉炎症的患者是与更严重疾病相关的患者的亚组。换句话说，并非所有患有nash的患者都具有门静脉周围或门静脉炎症。已经表明，门静脉周围/门静脉炎症与无肝移植的存活率和无肝相关事件的存活率负
相关。因此，有兴趣减少这些患者中的门静脉周围/门静脉炎症，并且患有门静脉周围或门静脉炎症的nash患者是具有用本发明化合物治疗的更大治疗益处的患者的限定亚组。
11.因此，本发明涉及：
[0012]-一种式(i)的化合物，所述式(i)的化合物用于治疗受试者的肝门静脉周围/门静脉炎症；或
[0013]-式(i)的化合物的用途，用于治疗受试者的肝门静脉周围/门静脉炎症；或
[0014]-包含式(i)的化合物的药物组合物，所述药物组合物用于治疗受试者的肝门静脉周围/门静脉炎症；
[0015]-一种治疗受试者的肝门静脉周围/门静脉炎症的方法，包括向受试者施用治疗量的式(i)的化合物，从而减轻受试者的肝门静脉周围/门静脉炎症，
[0016][0017]
其中：
[0018]
r1表示稠合芳基环烷基或环烷基，其任选被选自以下的至少一个基团取代：
[0019]
·
卤素，
[0020]
·
(c
1-c6)烷基或(c
1-c6)烷氧基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代，和
[0021]
·
羟基，
[0022]
·-co-r6或-co2r6，其中r6为氢或(c
1-c6)烷基，和
[0023]
·
任选被取代的芳基；
[0024]
r2表示：
[0025]
·
氢，
[0026]
·
卤素，
[0027]
·
(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代，
[0028]
·
任选被取代的芳基，或
[0029]
·
任选被取代的环烷基；
[0030]
r3表示：
[0031]
·
饱和或不饱和的5-10元环，其选自：
[0032]
ο任选稠合到杂环烷基的芳基，所述杂环烷基优选选自二氧杂环戊烯、吗啉、二烷、四氢吡喃和四氢呋喃，
[0033]
ο杂芳基，
[0034]
ο环烷基，
[0035]
ο杂环烷基，和
[0036]
ο5-10元桥接的碳环基或杂环基，
[0037]
所述5-10元环任选地被选自以下的至少一个基团取代：
[0038]-卤素，
[0039]-(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代、或被任选被(c
1-c6)烷基取代的任选桥接的杂环烷基取代，
[0040]
‑‑
nh-(c
1-c6)烷基或-n-((c
1-c6)烷基)2，其任选被选自杂环烷基、环烷基、羟基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物和(c
1-c6)烷氧基的至少一个基团取代，
[0041]
‑‑
nh-杂环烷基、-nh-环烷基、-n((c
1-c6)烷基)-杂环烷基或-nh((c
1-c6)烷基)-硫杂环烷基-1,1-二氧化物，其任选被羟基、(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烷氧基或-co-r6取代，其中r6为氢或(c
1-c6)烷基，
[0042]-羟基、-cn、-co-r6或-co2r6，其中r6为氢或(c
1-c6)烷基，
[0043]-(c
1-c6)烷氧基，其任选被选自卤素、优选氟、羟基、(c
1-c6)烷氧基、-nr7r8、-nhcor9、-nhco2r9、-co2r6和杂环的至少一个基团取代，其中r7和r8独立地为氢或(c
1-c6)烷基，r9为(c
1-c6)烷基，r6为氢或(c
1-c6)烷基，
[0044]
‑‑
nhcor9、-nhco2r9或-so2r9，其中r9为(c
1-c6)烷基，和
[0045]-杂环烷基、桥接的杂环烷基、杂环烷氧基、环烷氧基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物或螺杂环烷基，其任选被(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烷氧基、羟基、酮、卤素或任选被(c
1-c6)烷氧基取代的(c
1-c6)烷基取代，或
[0046]
·
(c
1-c6)烷基或(c
2-c6)烯基，其任选被如上所定义的5-10元环或-co2r6取代，其中r6为氢或(c
1-c6)烷基；
[0047]
r4表示-cooh；
[0048]
r5表示：
[0049]
·
氢，或
[0050]
·
(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代；
[0051]
及其立体异构体和药用盐。
[0052]
在一个方面，r1表示任选被取代的稠合芳基环烷基。优选地，r1表示任选被取代的稠合芳基环烷基，其选自：茚满基、1,2,3,4-四氢萘基和6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯基，优选茚满基和1,2,3,4-四氢萘基，更优选1,2,3,4-四氢萘基，
[0053]
优选
[0054]
任选地，r3表示：任选稠合到杂环烷基的芳基，所述杂环烷基优选选自二氧杂环戊烯、吗啉、二烷、四氢吡喃和四氢呋喃；或杂芳基，所述芳基、稠合芳基或杂芳基任选地被选自以下的至少一个基团取代：
[0055]
·
杂环烷基或桥接的杂环烷基，其任选被(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烷氧基或酮取代，
[0056]
·
硫杂环烷基-1,1-二氧化物、杂环烷氧基或环烷氧基；
[0057]
·
(c
1-c6)烷氧基或(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素、优选氟、或(c
1-c6)烷氧基取代，
[0058]
·
卤素，优选氟或氯，
[0059]
·-nh-(c
1-c6)烷基或-n-((c
1-c6)烷基)2，其任选被杂环烷基、环烷基、羟基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物或(c
1-c6)烷氧基取代，
[0060]
·-nh-杂环烷基、-n((c
1-c6)烷基)-杂环烷基或-nh((c
1-c6)烷基)-硫杂环烷基-1,1-二氧化物，
[0061]
·
羟基，
[0062]
·-cn，
[0063]
·
(c
1-c6)烷基，其被任选桥接的杂环烷基或任选被取代的杂环烷基取代；和
[0064]
·-so2r9，其中r9为(c
1-c6)烷基。
[0065]
更具体地，r3表示苯基、吡啶基或嘧啶基，优选苯基，其任选被选自以下的至少一个基团取代：
[0066]
·
任选被至少一个甲基取代的吗啉基，
[0067]
·-nh-四氢吡喃基，
[0068]
·-nh-(c
1-c6)烷基或-n(ch3)(c
1-c6)烷基)，其任选被四氢吡喃基、环己基、任选被至少一个甲基取代的任选桥接的吗啉基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物、羟基或(c
1-c6)烷氧基取代，
[0069]
·
任选被(c
1-c6)烷氧基取代的氮杂环丁烷基，
[0070]
·
吡咯烷-2-酮，
[0071]
·
6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷，
[0072]
·
(c
1-c6)烷氧基，其任选被至少一个卤素、优选氟、或一个(c
1-c6)烷氧基取代，
[0073]
·
卤素，优选氟和氯，
[0074]
·
羟基，
[0075]
·-cn，
[0076]
·-so
2-ch3，
[0077]
·
1,1-二氧代-1,2-噻唑烷，
[0078]
·
环丁氧基或四氢吡喃氧基，
[0079]
·
(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代，和
[0080]
·
(c
1-c6)烷基，其被任选被至少一个甲基取代的吗啉基、6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷、8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷或四氢吡喃基取代。
[0081]
任选地，r2表示
[0082]
·
氢，
[0083]
·
卤素，优选氯或氟，和
[0084]
·
任选被取代的(c
3-c6)环烷基，优选环丙基；
[0085]
优选氢、氯或氟。
[0086]
任选地，所述化合物为例如：r1为r2为氢或卤素，优选卤素如f或cl；r1为任选被卤素如f或cl取代的苯基；并且r5为氢。
[0087]
在一个具体方面，所述化合物选自表a中的化合物。
[0088]
在另一个具体方面，所述化合物选自表b中的化合物。
[0089]
任选地，受试者患有如说明书中所定义的1级(轻度)或2级(超过轻度)的肝门静脉/门静脉周围炎症。
[0090]
在第一方面，受试者患有选自以下的疾病：儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、慢性化学和药物诱发的肝损伤、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)以及原发性和继发性线粒体肝病。
[0091]
任选地，受试者患有选自以下的疾病：儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)、reye综合征、印度儿童肝硬化、特发性婴儿铜中毒、新生儿铁贮积疾病、i型酪氨酸血症(tyrosinemia)和齐薇格(zellweger)综合征。
[0092]
在一个非常具体的方面，所述疾病选自：儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)和儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)。特别地，受试者小于18岁。
[0093]
在第二方面，受试者患有肝门静脉/门静脉周围炎症和任选的肝门静脉/门静脉周围纤维化，并且患有选自病毒性肝炎、特别是慢性病毒性肝炎、血色素沉着症和nash的疾病。
[0094]
任选地，所述化合物与其他活性成分、特别地对肝门静脉/门静脉周围炎症具有弱的效果或没有效果的其他活性成分组合使用。任选地，其他活性成分为奥贝胆酸(oca)。
[0095]
本发明还涉及包含如本文中所公开的化合物和奥贝胆酸(oca)的药物组合物。更具体地，包含该组合的药物组合物用于治疗选自以下的疾病：
[0096]-儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、慢性化学和药物诱发的肝损伤、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)以及原发性和继发性线粒体肝病，优选选自以下的疾病：儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)、reye综合征、印度儿童肝硬化、特发性婴儿铜中毒、新生儿铁贮积疾病、i型酪氨酸血症和齐薇格综合征；和
[0097]-以发生肝门静脉/门静脉周围炎症为特征的疾病，任选地具有肝门静脉/门静脉周围纤维化，并且选自：病毒性肝炎，特别地慢性病毒性肝炎；血色素沉着症；和nash。
[0098]
本发明还涉及一种产品或试剂盒，所述产品或试剂盒含有如本文中所公开的化合物和奥贝胆酸(oca)以作为同时、单独或顺序使用的组合制剂，特别是用于治疗选自以下的疾病：
[0099]-儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、慢性化学和药物诱发的肝损伤、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)以及原发性和继发性线粒体肝病，优选选自以下的疾病：儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)、reye综合征、印度儿童肝硬化、特发性婴儿铜中毒、新生儿铁贮积疾病、i型酪氨酸血症和齐薇格综合征；和
[0100]-以发生肝门静脉/门静脉周围炎症为特征的疾病，任选地具有肝门静脉/门静脉周围纤维化，并且选自：病毒性肝炎，特别地慢性病毒性肝炎；血色素沉着症；和nash。
附图说明
[0101]
图1：门静脉周围炎症。图1a：8周给药期间平均门静脉周围炎症评分的变化。图1b：8周给药期前后的个体动物门静脉周围炎症评分。
[0102]
图2：门静脉周围纤维化。图2a：8周给药期间平均门静脉周围纤维化(部分面积的％)的变化。图2b：8周给药期前后的个体动物门静脉周围纤维化(部分面积的％)。
[0103]
图3：小叶炎症。图3a：8周给药期间平均小叶炎症评分的变化。图3b：8周给药期前后的个体动物小叶炎症评分。
具体实施方式
[0104]
定义
[0105]
根据本发明，下述术语具有如下含义：
[0106]
本文中提及的带有前缀的术语如c
1-c3、c
1-c6或c
2-c6也可以与更低数量的碳原子如c
1-c2、c
1-c5或c
2-c5一起使用。例如，如果使用术语c
1-c3，则意味着，相应的烃链可以包含1至3个碳原子，具体为1、2或3个碳原子。例如，如果使用术语c
1-c6，则意味着，相应的烃链可以包含1至6个碳原子，具体为1、2、3、4、5或6个碳原子。例如，如果使用术语c
2-c6，则意味着，相应的烃链可以包含2至6个碳原子，具体为2、3、4、5或6个碳原子。
[0107]
术语“烷基”是指饱和的、线性或支化的脂族基团。术语“(c
1-c3)烷基”更具体地是指甲基、乙基、丙基或异丙基。术语“(c
1-c6)烷基”更具体地是指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基。在一个优选的实施方案中，“烷基”为甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基，更优选甲基。
[0108]
术语“烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的不饱和、线性或支化的脂族基团。术语“(c
2-c6)烯基”更具体地是指乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、戊烯基或己烯基。
[0109]
术语“烷氧基”或“烷基氧基”对应于通过-o-(醚)键与分子键合的如上所定义的烷基基团。(c
1-c3)烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。(c
1-c6)烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。在一个优选的实施方案中，“烷氧基”或“烷基氧基”为甲氧基。
[0110]
术语“环烷基”对应于包含3至20个碳原子的饱和或不饱和的单环、双环或三环烷基。它还包括稠合、桥接或螺连接的环烷基基团。术语“环烷基”包括例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。术语“环烷基”可以还是指5-10元的桥接的碳环基如双环[2,2,1]庚基、双环[2,2,2]辛基、双环[1.1.1]戊基或金刚烷基，优选双环[2,2,1]庚基。在一个优选的实施方案中，“环烷基”为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
[0111]
术语“杂环烷基”对应于还包含至少一个杂原子如氮、氧或硫原子的如上所定义的饱和或不饱和的环烷基基团。它还包括稠合、桥接或螺连接的杂环烷基基团。代表性的杂环烷基基团包括但不限于3-二氧戊环、苯并[1,3]二氧戊环基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡唑啉基、吡喃基、硫代吗啉基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、1,4-二烷基、咪唑啉基、吡咯
啉基、吡咯烷基，哌啶基、咪唑烷基、吗啉基、1,4-二噻吩基、吡咯烷基、唑啉基、唑烷基、异唑啉基、异唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢呋喃基和四氢噻吩基。术语“杂环烷基”可以还是指5-10元的桥接的杂环基如7-氧杂双环[2,2,1]庚基、6-氧杂-3-氮杂双环[3,1,1]庚基和8-氧杂-3-氮杂双环[3,1,1]辛基。在一个具体的实施方案中，它可以还是指螺连接的杂环烷基基团或螺杂环烷基基团如与氮杂环丁烷基或哌啶基螺连接的氧杂环丁烷基。在一个优选的实施方案中，杂环烷基基团为氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡喃基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基和与氮杂环丁烷基或哌啶基螺连接的氧杂环丁烷基。
[0112]
术语“芳基”对应于具有6至12个碳原子的单环或双环芳族烃。例如，术语“芳基”包括苯基、联苯基或萘基。在一个优选的实施方案中，芳基为苯基。
[0113]
如本文中所使用的，术语“杂芳基”对应于包含5至14个原子并包含至少一个杂原子如氮、氧或硫原子的芳族单环或多环基团。这样的单环和多环杂芳基基团的实例可以为：吡啶基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、三嗪基、噻蒽基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、吩噻基(phenoxanthinyl)、异噻唑基、异唑基、吡嗪基、哒嗪基、中氮茚基、异吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基、酞嗪基(phtalazinyl)、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、唑烷基、苯并三唑基、苯并异唑基、羟吲哚基、苯并唑啉基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、靛红基(isatinyl)、二氢吡啶基、嘧啶基、均三嗪基、唑基或硫代呋喃基。在一个优选的实施方案中，杂芳基基团为吡啶基、呋喃基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和异唑基。
[0114]
术语“稠合芳基杂环烷基”和“稠合芳基环烷基”对应于双环基团，其中如上所定义的芳基通过至少两个碳键合到如上所定义的杂环烷基或环烷基。换言之，芳基与杂环烷基或环烷基共享碳键。稠合芳基杂环烷基为例如苯并二氧杂环戊烯(稠合到二氧杂环戊烯的苯基)、异苯并呋喃或苯并吗啉(稠合到吗啉的苯基)。稠合芳基环烷基为例如茚满基、1,2,3,4-四氢萘基(也称为四氢化萘基)或6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯基(稠合苯基-c
7-环烷基)。术语“稠合双环烷基”对应于双环基团，其中如上所定义的环烷基通过至少两个碳键合到如上所定义的环烷基。稠合双环烷基为例如双环[4.1.0]庚基。
[0115]
术语“卤素”对应于氟、氯、溴或碘原子，优选氟、氯或溴。
[0116]
表述“被至少
……
取代”是指被列表中的一个或几个基团取代的基团。
[0117]
表述“任选被取代的”是指在没有任何其他精确性的条件下：任选被以下基团取代：羟基；卤素；任选被至少一个卤素、优选任选被至少一个氟取代的(c
1-c6)烷基；或任选被至少一个卤素、优选任选被至少一个氟取代的(c
1-c6)烷氧基。
[0118]“立体异构体”为具有相同分子式和键合原子序列但其原子在空间中的3d维取向不同的异构化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、顺-反和e-z异构体、构象异构体和异头异构体。在本发明的一个优选实施方案中，立体异构体包括非对映异构体和对映异构体。对映异构体化合物可以使用本领域技术人员已知的任何纯化方法如lc/ms和
手性hplc分析方法和手性sfc纯化方法如实施例中所公开的方法(实施例a-化学品，表1和表3)由外消旋化合物来制备。
[0119]“药用盐”包括无机酸盐和有机酸盐。合适的无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等。合适的有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、甲磺酸等。药用无机酸或有机酸加成盐的其他实例包括在j.pharm.sci.，1977年，66卷，2页和由p.heinrich stahl和camille g.编辑的handbook of pharmaceutical salts:properties,selection,and use，wermuth 2002中列出的药用盐。在一个优选的实施方案中，所述盐选自马来酸盐、盐酸盐、溴水合物和甲磺酸盐。“药用盐”还包括无机碱盐和有机碱盐。合适的无机碱的代表性实例包括：钠盐或钾盐；碱土金属盐如钙盐或镁盐；或铵盐。具有有机碱的合适盐的代表性实例包括例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺形成的盐。在一个优选的实施方案中，所述盐选自钠盐和钾盐。
[0120]
如本文中所使用的，术语“治疗”是指旨在改善患者健康状况的任何行为如疾病、特别地感染、优选病毒性感染的治疗、防止、预防和延缓。在特定实施方案中，这种术语是指疾病或与之相关的症状的改善或根除。在其他实施方案中，该术语是指通过将一种或多种治疗剂施用于患有这种疾病的受试者而导致的疾病的传播或恶化最小化。
[0121]
如本文中所使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”是可互换的并且是指动物，优选哺乳动物，还更优选人，包括成人、儿童、新生儿和处于产前阶段的人。然而，术语“受试者”也能够是指非人类动物，尤其是诸如狗、猫、马、牛、猪、羊和非人类灵长类动物等的哺乳动物。
[0122]
术语“数量”、“量”和“剂量”在本文中可互换使用并且可以是指分子的绝对定量。
[0123]
如本文中所使用的，术语“活性要素”、“活性成分”和“活性药物成分”是等价的并且是指具有治疗效果的药物组合物的组分。
[0124]
如本文中所使用的，术语“治疗效果”是指由根据本发明的活性成分或药物组合物诱发的、能够预防或延迟疾病或病症的出现或发展、或治愈或减轻疾病或病症的影响的效果。
[0125]
如本文中所使用的，术语“有效量”是指活性成分或药物组合物的可预防、消除或减轻疾病、特别是传染病的有害影响的量。显然，本领域技术人员能够根据待治疗的受试者、疾病的性质等来调节待施用的量。特别地，施用的剂量和方案可以根据以下而变化：待治疗的疾病的性质；阶段和严重程度；待治疗的受试者的体重、年龄和整体健康状况；以及医生的判断。
[0126]
如本文中所使用的，术语“赋形剂或药物学上可接受的载体”是指除存在于药物组合物中的活性成分之外的任何成分。它的添加可能旨在赋予最终产品特定的稠度或其他物理或味觉特性。赋形剂或药物学上可接受的载体必须与所述活性成分不能发生任何相互作用，特别是化学相互作用。
[0127]
化合物
[0128]
本发明的化合物可以是wo 2019/154956或wo 2019/154953中所公开的任何化合物，通过引用将其公开内容并入本文中。
[0129]
在第一方面，本发明的化合物可以是wo 2019/154956中公开的任何化合物，特别
为氢或(c
1-c6)烷基，
[0157]-羟基、-cn、-co-r6或-co2r6，其中r6为氢或(c
1-c6)烷基，
[0158]-(c
1-c6)烷氧基，其任选被选自卤素、优选氟、羟基、(c
1-c6)烷氧基、-nr7r8、-nhcor9、-nhco2r9、-co2r6和杂环的至少一个基团取代，其中r7和r8独立地为氢或(c
1-c6)烷基，r9为(c
1-c6)烷基，r6为氢或(c
1-c6)烷基，
[0159]
‑‑
nhcor9、-nhco2r9或-so2r9，其中r9为(c
1-c6)烷基，和
[0160]-杂环烷基、桥接的杂环烷基、杂环烷氧基、环烷氧基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物或螺杂环烷基，其任选被(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烷氧基、羟基、酮、卤素或任选被(c
1-c6)烷氧基取代的(c
1-c6)烷基取代，或
[0161]
·
(c
1-c6)烷基或(c
2-c6)烯基，其任选被如上所定义的5-10元环或-co2r6取代，其中r6为氢或(c
1-c6)烷基；
[0162]
r4表示-cooh；
[0163]
r5表示：
[0164]
·
氢，或
[0165]
·
(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代；
[0166]
及其立体异构体和药用盐。
[0167]
优选地，r2表示：氢；卤素，优选氯或氟；和任选被取代的(c
3-c6)环烷基，优选环丙基。在一个优选的方面，r2表示氢、氯或氟。在一个具体方面，r2为氢。在另一个具体方面，r2为氯或氟。
[0168]
任选地，r3表示：任选稠合到杂环烷基的芳基，所述杂环烷基优选选自二氧杂环戊烯、吗啉、二烷、四氢吡喃和四氢呋喃；或杂芳基，所述芳基、稠合芳基或杂芳基任选地被选自以下的至少一个基团取代：
[0169]
·
杂环烷基或桥接的杂环烷基，其任选被(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烷氧基或酮取代，
[0170]
·
硫杂环烷基-1,1-二氧化物、杂环烷氧基或环烷氧基；
[0171]
·
(c
1-c6)烷氧基或(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素、优选氟、或(c
1-c6)烷氧基取代，
[0172]
·
卤素，优选氟或氯，
[0173]
·-nh-(c
1-c6)烷基或-n-((c
1-c6)烷基)2，其任选被杂环烷基、环烷基、羟基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物或(c
1-c6)烷氧基取代，
[0174]
·-nh-杂环烷基、-n((c
1-c6)烷基)-杂环烷基或-nh((c
1-c6)烷基)-硫杂环烷基-1,1-二氧化物，
[0175]
·
羟基，
[0176]
·-cn，
[0177]
·
(c
1-c6)烷基，其被任选桥接的杂环烷基或任选被取代的杂环烷基取代；和
[0178]
·-so2r9，其中r9为(c
1-c6)烷基。
[0179]
更具体地，r3表示苯基、吡啶基或嘧啶基，优选苯基，其任选被选自以下的至少一个基团取代：
[0180]
·
任选被至少一个甲基取代的吗啉基，
[0181]
·-nh-四氢吡喃基，
[0182]
·-nh-(c
1-c6)烷基或-n(ch3)(c
1-c6)烷基)，其任选被四氢吡喃基、环己基、任选被至少一个甲基取代的任选桥接的吗啉基、硫杂环烷基-1,1-二氧化物、羟基或(c
1-c6)烷氧基取代，
[0183]
·
任选被(c
1-c6)烷氧基取代的氮杂环丁烷基，
[0184]
·
吡咯烷-2-酮，
[0185]
·
6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷，
[0186]
·
(c
1-c6)烷氧基，其任选被至少一个卤素、优选氟、或一个(c
1-c6)烷氧基取代，
[0187]
·
卤素，优选氟和氯，
[0188]
·
羟基，
[0189]
·-cn，
[0190]
·-so
2-ch3，
[0191]
·
1,1-二氧代-1,2-噻唑烷，
[0192]
·
环丁氧基或四氢吡喃氧基，
[0193]
·
(c
1-c6)烷基，其任选被至少一个卤素取代、优选任选被至少一个氟取代，和
[0194]
·
(c
1-c6)烷基，其被任选被至少一个甲基取代的吗啉基、6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷、8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷或四氢吡喃基取代。
[0195]
在一个具体方面，r3为选自以下的基团：
[0196][0197]
在另一个具体方面，r3为选自以下的基团：
[0198][0199]
在另一个具体方面，r3为选自以下的基团：
[0200][0201]
在一个非常具体的方面，r3表示苯基，其任选被卤素、优选氟取代。在这方面，r3可以是
[0202][0203]
在一个具体方面，r2表示卤素，优选氟或氯，并且r3可以是
[0204][0205]
在第一方面，r1表示任选被取代的稠合芳基环烷基。更具体地，r1表示任选被取代的稠合芳基环烷基，其选自：茚满基、1,2,3,4-四氢萘基和6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]轮烯基，优选茚满基和1,2,3,4-四氢萘基，更优选1,2,3,4-四氢萘基。
[0206]
例如，任选被取代的稠合芳基环烷基r1可以包含选自以下的基团：
[0207][0208]
或者，任选被取代的稠合芳基环烷基r1可以包含选自以下的基团：
[0209][0210]
在一个具体方面，r1为
[0211]
或其被取代的基团。
[0212]
在本公开的一个非常具体的方面，r1表示
[0213][0214]
在一个具体的实施方案中，r1为r2为氢或卤素，优选卤素如f或cl；r1为任选被卤素如f或cl取代的苯基；并且r5为氢。
[0215]
在一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物选自下表a中的化合物：
[0216]
表a：
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222][0223]
在一个非常具体的方面，所述化合物选自化合物#16、#17、#151、#157、#171、#194、#195和#196。
[0224]
在第二方面，r1表示任选被取代的环烷基。
[0225]
在一个具体方面，r1为选自以下的基团：
[0226][0227][0228]
在一个优选的方面，所述化合物选自下表b中的化合物：
[0229]
表b：
[0230]
[0231][0232]
本发明涉及这些化合物中任一种的用途。
[0233]
疾病
[0234]
本发明的化合物对肝门静脉周围/门静脉炎症表现出特异性效果。任选地，它们还表现出对肝门静脉周围纤维化的影响。
[0235]
在一个具体方面，本发明的化合物能够减少门静脉周围/门静脉炎症。例如，与没有用化合物治疗的门静脉/门静脉周围炎症相比，可以降低20、30、40、50、60、70、80、90或100％。所述降低可以通过本领域技术人员可用的任何方法例如在如实施例中所详述的动物模型中来测量。
[0236]
在另外的方面，本发明的化合物能够减少门静脉/门静脉周围纤维化。例如，与没有用化合物治疗的门静脉/门静脉周围纤维化相比，可以降低20、30、40、50、60、70、80、90或100％。可以在如实施例中所详述的动物模型中测量所述降低。
[0237]
肝门静脉炎症涉及多种疾病。
[0238]
因此，所述疾病可以选自：儿科非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)、儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、慢性化学和药物诱发的肝损伤或慢性药物毒性、胆道闭锁、特发性新生儿肝炎综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)以及原发性和继发性线粒体肝病。
[0239]
非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafld)是儿童慢性肝脏疾病的最常见原因。nafld包括从良性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(nash)的一系列疾病状态。所述疾病经常导致肝硬化，从而导致需要进行肝移植以及引起其他问题，包括但不限于代谢和心血管疾病。尽管nafld的发病机理仍不清楚，但很可能是胰岛素抵抗、氧化应激增加和脂质过氧化的结果。nafld受试者中防止氧化应激的细胞内谷胱甘肽水平较低。
[0240]
在具体方面，nafld为儿科nafld。于是，待治疗的受试者小于18岁，特别地8岁至17岁。
[0241]
已经对两种不同的nash组织学形式进行了描述。1型nash发生在成人和一些儿童中，并且其特征为脂肪变性、小叶炎症、气球样变性和窦周纤维化。在儿童和青少年中最常见的2型nash的特征为脂肪变性、门静脉炎症和门静脉纤维化。schwimmer等人(hepatgology，42卷(3期)：641-649页，2005年；通过引用并入本文中)描述了用于区分1型nash和2型nash的各种标准和生物标志物。如上所述，1型nash表现出在肝脏中普遍存在的小叶炎症，与2型nash中普遍存在的门静脉炎症相反。nafld和nash可以使用kleiner等人概述的标准进行评分(hepatology 41，1313-21页，2005年)。
[0242]
因此，在具体方面，nash是儿科nash。于是，待治疗的受试者为小于18岁，特别地8岁至17岁。
[0243]
原发性和继发性线粒体肝病为分为原发性(由特定基因突变引起)和继发性(其中线粒体被内源性或外源性毒素靶向)的病症(bandyopadhyay和dutta，2005年，japi，53卷，973-978页)。
[0244]
自身免疫性肝炎(aih)，也称为狼疮性肝炎，是一种慢性、自身免疫性肝脏疾病。公认的自身免疫性肝炎有四种亚型：1型aih；2型aih；3型aih和未检测到自身抗体的aih。
[0245]
原发性线粒体肝病可能是由以下原因造成的：电子传递(呼吸链)缺陷、脂肪酸氧化和传递缺陷、肉碱棕榈酰转移酶i和ii缺乏、肉碱酰基肉碱转位酶缺乏、尿素循环酶缺乏、电子转移黄素蛋白(etf)和etf脱氢酶缺乏、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶缺乏或非酮症高甘氨酸血症。
[0246]
继发性线粒体肝病包括：reye综合征、肝铜超负荷如威尔逊病、印度儿童肝硬化和特发性婴儿铜中毒、新生儿铁贮积病、i型酪氨酸血症、齐薇格综合征、由以下因素引起的继
发性线粒体肝病：药物如丙戊酸、水杨酸、核苷类似物、氯霉素和巴比妥酸盐；化学毒素如铁、氰化物、抗霉素a和鱼藤酮；以及细菌毒素如cereulide或ekiri。
[0247]
慢性化学和药物诱发的肝损伤或慢性药物毒性是一种持续六个月或更长时间的、由药物或化学物质的不利影响引起的肝脏疾病(参见ncbi，mesh数据库，www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh/68056487)。不利影响可能是由药物、药物代谢物、环境中的化学物质或特殊反应引起的。
[0248]
此外，一些疾病可能会出现具有门静脉周围或门静脉炎症的患者的亚组。更具体地，受试者具有1级或2级的门静脉周围或门静脉炎症，如下文所进一步定义的。所述疾病可以选自病毒性肝炎、特别是慢性病毒性肝炎、血色素沉着症和nash。因此，受试者可能患有如下文所进一步定义的1级或2级的门静脉周围或门静脉炎症，并患有选自病毒性肝炎、特别是慢性病毒性肝炎、血色素沉着症和nash的疾病。任选地，受试者可能还患有肝门静脉周围纤维化，特别是处于如下所定义的1c阶段、2阶段或3阶段的肝门静脉周围纤维化。
[0249]
例如，如背景部分所描述的，患有nash和门静脉周围或门静脉炎症的患者是与更严重疾病相关的患者的亚组。事实上，并非所有患有nash的患者都有门静脉周围或门静脉炎症。特别地，门静脉周围/门静脉炎症与无肝移植的存活率和无肝相关事件的存活率负相关。因此，有兴趣减少这些患者的门静脉周围/门静脉炎症。
[0250]
可以在肝活检中评估门静脉周围/门静脉炎症和纤维化。
[0251]
如brunt等人(hepatology；2009年，49卷，809-820页；hepatology，2011年，53卷，810-820页)所述，门静脉炎症可以更具体地定义为从0到2的等级，其公开内容通过引用并入本文中。0级对应于“无”。1级对应于“轻度”。2级对应于“超过轻度”。在一个具体方面，受试者或患者具有轻度门静脉炎症(即1级)或超过轻度的门静脉炎症(即2级)。
[0252]
然后，待治疗的受试者患有具有肝门静脉周围/门静脉炎症的疾病。在一个具体方面，受试者患有轻度门静脉炎症(即，1级)或超过轻度的门静脉炎症(即，2级)。
[0253]
任选地，受试者可能还患有具有肝门静脉周围纤维化的疾病。在一个具体方面，受试者患有门静脉纤维化，例如处于1c阶段(门静脉/门静脉周围)、2阶段(鼻窦周和门静脉/门静脉周围)或3阶段(桥接纤维化)的纤维化。可以使用kleiner等人(hepatology 41，1313-21页，2005年，更具体地表1)和brunt等人(am j gastroenterol 1999年；94卷：2467-2474页)概述的标准对纤维化进行评分。
[0254]
在一个具体方面，受试者为人类。在一个具体方面，受试者为儿童或青少年。因此，受试者小于20、19或18岁。例如，受试者为10至20岁、11至19岁或12至18岁。在另一个方面，受试者为成年人。
[0255]
受试者可以是肥胖或超重的。更具体地，bmi为30以上的受试者通常被认为是肥胖的并且bmi等于或大于25且小于30的受试者被认为是超重的。
[0256]
在一个非常具体的方面，疾病为非酒精性脂肪肝脏疾病(nafld)或儿科非酒精性脂肪性肝炎(nash)。受试者为儿童或青少年，尤其是如上所定义的，并且受试者超重或肥胖。受试者可能有高肝检查和/或肝超声检查异常。
[0257]
组合
[0258]
本公开的化合物可以与其他治疗剂组合使用。其他治疗剂可以选自已经用于治疗上述疾病之一的药剂。
[0259]
在一个具体方面，其他治疗剂对门静脉/门静脉周围炎症或门静脉/门静脉周围纤维化的效果弱或没有效果。
[0260]
在一个非常具体的方面，其他治疗剂为奥贝胆酸(oca)。因此，本发明还涉及：
[0261]-一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所公开的化合物和奥贝胆酸(oca)，以特别地用于治疗如上所述的疾病；
[0262]-药物组合物的用途，用于制造用于治疗如上所述疾病的药物，所述药物组合物包含如本文中所公开的化合物和奥贝胆酸(oca)；
[0263]-一种如本文中所公开的化合物或一种包含如本文中所公开的化合物的药物组合物，以与奥贝胆酸(oca)组合的方式用于治疗如上所述的疾病；
[0264]-如本文中所公开的化合物或包含如本文中所公开的化合物的药物组合物的用途，用于制造用于治疗如上所述疾病的药物，所述化合物和所述药物组合物与奥贝胆酸(oca)组合使用；
[0265]-一种治疗受试者的如上所述疾病的方法，包括：向受试者施用治疗量的药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所公开的化合物和奥贝胆酸(oca)；或向受试者施用治疗量的如本文中所公开的化合物和治疗量的奥贝胆酸(oca)。
[0266]
药物组合物
[0267]
所述药物组合物包含本发明的化合物和任选的至少一种药物学上可接受的载体或赋形剂。
[0268]
根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物可以通过任何常规施用途径来施用。特别地，本公开的化合物或药物组合物可以通过局部、肠内、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、动脉内、肌内、皮下或眼内施用等来施用。
[0269]
特别地，根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物可以以用于局部、肠内、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、动脉内、肌内、皮下或眼内施用等的方式来配制。
[0270]
优选地，根据本发明的化合物或根据本公开的药物组合物通过肠内或肠胃外施用途径来施用。当经肠胃外施用时，根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物优选通过静脉内施用途径来施用。当经肠施用时，根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物优选通过口服施用途径来施用。
[0271]
包含所述分子的药物组合物根据本领域技术人员已知的标准药物实践(lippincott williams和wilkins，2000and encyclopedia of pharmaceutical technology，编辑j.swarbrick和jcboylan，1988-1999年，marcel dekker，new york)来配制。
[0272]
对于口服施用，可以将组合物配制成常规口服剂型如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂和液体制剂如糖浆剂、酏剂和浓缩滴剂。可以使用无毒固体载体或稀释剂，包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。对于压缩的片剂，还需要粘合剂，所述粘合剂为赋予粉末状材料内聚性的试剂。例如，作为粘合剂，能够使用淀粉、明胶、诸如乳糖或右旋糖的糖以及天然或合成树胶。片剂中还需要崩解剂以促进片剂的破碎。崩解剂包括淀粉、粘土、纤维素、藻类、树胶和交联聚合物。此外，片剂中还包含润滑剂和助流剂，以防止在制造过程中片剂材料粘附到表面，并改善粉末材料在制造过程中的流动特性。最常将胶体二氧化硅用作助流剂并且最常将诸如滑石或硬脂酸的化合物用
作润滑剂。
[0273]
对于经皮施用，可以将组合物配制成软膏、乳膏或凝胶形式，并且可以使用适当的渗透剂或去污剂来促进渗透，所述渗透剂或去污剂为例如二甲基亚砜、二甲基乙酰胺和二甲基甲酰胺。
[0274]
对于经粘膜施用，可以使用鼻喷雾剂、直肠或阴道栓剂。通过本领域已知的方法能够将活性化合物并入任何已知的栓剂基质中。这种基质的实例包括可可脂、聚乙二醇(碳蜡)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯以及这些物质与用于改变熔点或溶解速率的其他相容材料的混合物。
[0275]
根据本发明的药物组合物可以配制成在施用后基本上立即释放活性药物或在施用后的任何预定时间或时间段释放活性药物。
[0276]
根据本发明的化合物或根据本公开的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用。
[0277]
优选地，定期施用治疗，优选在每天与每月之间，更优选在每天与每两周之间，更优选在每天与每周之间，还更优选每天施用治疗。在一个具体实施方案中，每天施用治疗，任选每天施用1、2或3次。
[0278]
用根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物进行治疗的持续时间可以是数周、数月或甚至数年。特别地，只要疾病持续存在，治疗的持续时间就可以持续。
[0279]
根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物的施用量必须通过本领域普通技术人员熟知的标准程序来确定。必须考虑患者的生理数据(例如年龄、体型和体重)和施用途径以确定合适的剂量，从而将治疗有效量施用于患者。
[0280]
在一个具体方面，每次施用根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物的总化合物剂量为0.00001g至1g。
[0281]
根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物的药物组合物形式、施用途径和施用剂量可以由本领域技术人员根据疾病的类型和严重程度以及患者的、特别是其年龄、体重、性别和一般身体状况来进行调节。
[0282]
在接下来的实施例中将对本发明的其他方面和优点进行描述，这些实例应被视为是说明性的而非限制性的。
[0283]
实施例
[0284]
结果
[0285]
用高脂肪饮食喂养小鼠30周，然后通过口服施用来治疗，每天两次使用化合物#157或每天一次使用oca进行治疗并持续8周。在治疗前和在研究完成时确定对门静脉/门静脉周围炎症和纤维化以及对小叶炎症的效果。
[0286]
在nash小鼠模型中治疗8周后，化合物#157解决了门静脉/门静脉周围炎症和纤维化(参见图1和2)。相反，如图1和图3所示，oca在小叶区域(图3)中产生明显的抗炎效果，但在门静脉/门静脉周围区域(图1)中没有效果。
[0287]
材料和方法
[0288]
给五周大的雄性c57bl/6jrj小鼠喂食对照饮食(chow diet)(altromin 1324，brogaarden，丹麦)或amln饮食(40％总脂肪千卡，其中18.5％为反式脂肪千卡，20％为果糖，2％为胆固醇；研究饮食#d09100301)。将这种饮食持续29周，然后开始研究。
[0289]
在研究开始前三周，进行肝活检，并从研究中取消选择脂肪变性《2级并且纤维化
阶段《1的动物。在第一次施用测试制品之前，根据来自第3周活检的胶原蛋白1a1(ihc)形态学将小鼠分层随机化到治疗组中。每个治疗组包括12只小鼠。
[0290]
总共8周，以7mg/kg或20mg/kg的浓度每天两次(上午6点和下午4点)口服施用化合物#157。以总体积为5ml/kg的媒介物(在去离子水中的1.5％的cmc 0.25％的tween 80)施用化合物#157。
[0291]
总共8周，以30mg/kg的浓度每天一次(早上6点)口服施用奥贝胆酸(oca)。以总体积为5ml/kg的媒介物(在去离子水中的1.5％的cmc 0.25％的tween 80)施用oca。
[0292]
终止时，切除肝脏的右内侧和/或左外侧叶(每个收获叶的》50％)并固定在10％中性缓冲福尔马林中(室温下至少7天)。肝组织被石蜡包埋、切片(5um)并安装，注意选择代表组织边缘和中心的类似大小的切片。将苏木精和伊红染色用于形态学分析，并将马松三色和天狼星红染色用于评估肝纤维化。组织病理学分析由对该研究不知情的病理学家进行。通过使用kleiner等人(hepatology 41，1313-21页，2005年)概述的标准对nafld和nash进行评分。
[0293]
通过使用200倍放大倍数(每只动物最少5个视野)对每个视野中苏木精和伊红(h&e)阳性炎症病灶的数量进行计数来评估炎症。将病灶定义为》3个炎性细胞的簇，而不是一行。嗜酸体不包括在该评估中。炎症评分定义如下：
[0294][0295]
使用visiopharm组织病理学图像分析软件(visioparm，丹麦)对门静脉纤维化进行量化。在picro sirius red染色载玻片中对门静脉三联体进行了注释，并使用卷积神经网络deeplabv3 进行分区(chen，liang-chieh等人，欧洲计算机视觉会议论文集(eccv)；2018年))。将门静脉周边区域定义为距门静脉区域100μm的距离。然后使用线性贝叶斯(bayesian)方法在门静脉周围区域检测门静脉周围纤维化，并报告为面积分数。