非重复基因组基因座的活细胞成像的制作方法

非重复基因组基因座的活细胞成像
1.相关申请
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2019年08月16日提交的美国临时申请系列号62/887,913和2020年03月03日提交的美国临时申请系列号62/984,466的权益，其全部内容通过引用整体并入本文。
3.政府许可权利
4.本发明在由美国国立卫生研究院(national cancer institute)授予的资助号p30ca034196和美国国家人类基因组研究所(national human genome research institute)授予的资助号r01-hg009900的政府支持下完成。政府对本发明享有一定的权利。


背景技术：

5.两米长的基因组dna被浓缩到直径约10微米的人细胞核中(1)。基因组的三维组织影响转录活性和调控、dna复制和dna修复等功能(2)。这种结构和这些过程的破坏与疾病有关(3，4)。包括hi-c and chia-pet技术(5-7)在内的dna测序方法揭示了基因组内的染色质相互作用以及基因组和调控元件之间的相互作用，但这些技术需要固定染色质，与核环境隔离和片段化。


技术实现要素：

6.在一些方面中，本文提供了用于对活细胞内的动态核结构和过程进行成像的方法。例如，使用crispr和tale对非重复序列进行活细胞成像受到繁琐的方案和低信噪比(snr)的阻碍，需要转染数十个质粒才能标记每个基因座。本公开内容提供了一种基于crispr/casilio的成像方法，具有增强的snr，可以仅使用单个grna标记一个非重复基因组基因座。这种方法可用于实时分析3d染色质相互作用。
7.在一些方面中，本公开内容提供了方法，其包括：(a)对活细胞成像，所述活细胞包含：无催化活性的核糖核酸(rna)指导的核酸酶，由单个独特指导rna(grna)结合的非重复基因组基因座，和与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和(b)在所述活细胞中检测所述puf结构域的所述可检测分子，所述puf结构域已结合至所述grna的所述puf结构域结合序列。
8.本公开内容的其他方面提供了方法，其包括：(a)对活细胞成像，所述活细胞包含：无催化活性的rna指导的核酸酶，多个非重复基因组基因座，和与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列，其中每个非重复基因座由单个独特grna结合，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座之一互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列，和(b)在所述活细胞中的所述多个非重复基因组基因座共同检测所述puf结构域的所述可检测分子，所述puf结构
域已结合至所述grna的所述puf结构域结合序列。
9.本公开内容的还有其它方面提供了方法，其包括：(a)将活细胞与以下接触：无催化活性的rna指导的核酸酶或编码rna指导的核酸酶的多核苷酸，多个grna、编码多个grna的多核苷酸或编码grna的多个多核苷酸，和与puf结构域连接的荧光蛋白或编码与puf结构域连接的荧光蛋白的多核苷酸，所述puf结构域结合每个所述grna的所述puf结构域结合序列，其中每个所述grna包含(i)与在所述活性胞中单个非重复基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列，和(b)在所述活细胞中共同检测与puf结构域连接的所述荧光蛋白，所述puf结构域已结合至所述grna的所述puf结构域结合序列。
10.本公开内容的仍有其它方面提供了方法，其包括：(a)在活细胞中对多个非重复基因组基因座成像，其中每个非重复基因组基因座由单个独特grna结合，和与rbp结构域连接的可检测分子，所述rbp结构域结合所述grna的所述rbp结构域结合序列，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)rna结合蛋白(rbp)结构域结合序列，和(b)在所述活细胞中检测所述rbp结构域的所述可检测分子，所述rbp结构域已结合至所述grna的所述rbp结构域结合序列。
11.本公开内容的进一步的方面提供了用于对染色质结构成像的方法，其包括：在活细胞中使用以下标记第一非重复染色质锚定基因座：(a)单个独特指导rna(grna)，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和(b)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列；在所述活细胞中标记多个其他非重复染色质基因座，每个基因座标记有：(a)单个独特grna，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列，和(b)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列，其中所述多个其他非重复基因座位于与所述锚定基因座越来越远的距离；和在一段时间内在所述活细胞中对所述可检测分子成像，从而在所述活细胞中对染色质结构成像。
12.在一些实施方式中，在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是1kb至5kb、1kb至100kb、10kb至100kb。在一些实施方式中，在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是至少1kb、至少5kb、至少10kb或至少20kb。
13.在一些实施方式中，所述方法包括对活细胞的延时成像。
14.在一些实施方式中，可检测分子是荧光蛋白。
15.在一些实施方式中，将活细胞与至少两个puf结构域接触，每个puf结构域连接至不同可检测分子。在一些实施方式中，可检测分子是相对于彼此具有不同发射波长的荧光蛋白。
16.在一些实施方式中，活细胞包含至少两个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。例如，活细胞可以包含至少五个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。
17.在一些实施方式中，活细胞包含至少三个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。例如，活细胞可以包含至少五个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。
18.在一些实施方式中，活细胞不包含grna的混合物。
19.在一些实施方式中，所述无催化活性的rna指导的核酸酶是dcas9核酸酶。
20.在一些实施方式中，至少一个所述grna包含所述puf结构域结合序列的至少一个拷贝。
21.在一些实施方式中，一个或多个非重复基因组基因座包含染色质。
22.本公开内容的其他方面提供了一种包含活细胞的体外组合物，所述活细胞包含无催化活性的rna指导的核酸酶，多个非重复基因组基因座，其中每个非重复基因座由单个独特grna结合，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座之一互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列，和与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列。
23.本公开内容的一些方面提供了用于检测细胞中的染色体重排的方法，其包括向活细胞递送以下：(a)无催化活性的rna指导的核酸酶，(b)第一单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在核酸酶切割位点附近和上游结合，(c)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第一grna的所述puf结构域结合序列，(d)第二单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在核酸酶切割位点附近和下游结合，和(e)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第二grna的所述puf结构域结合序列，其中每个grna还包含rna指导的核酸酶结合序列和puf结构域结合序列；和在所述活细胞中对所述第一grna和所述第二grna之间的距离成像，以确定是否存在染色体重排。在一些实施方式中，所述染色体重排是易位、倒位或重复。
24.本公开内容的其他方面提供了用于鉴定细胞中的基因异常的方法，其包括向活细胞递送以下：(a)无催化活性的rna指导的核酸酶，(b)第一单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在基因异常附近和上游结合，(c)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第一grna的所述puf结构域结合序列，(d)第二单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在基因异常附近和下游结合，和(e)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第二grna的所述puf结构域结合序列，其中每个grna还包含rna指导的核酸酶结合序列和puf结构域结合序列；在所述活细胞中对所述第一grna和所述第二grna之间的距离成像，以确定是否存在染色体重排。在一些实施方式中，所述基因异常是染色体重排。在一些实施方式中，所述染色体重排是易位、倒位或重复。
25.国际公开号wo 2016/148994的全部内容通过引用并入本文。
附图说明
26.图1a-1f显示了非重复和重复基因座的实时成像。图1a显示了grna的混合物(grna)的muc4靶向基因座的示意图。图1b显示了在u2os细胞中非重复基因座的10个grna的混合物与e3(重复)基因座的共定位。来自4次独立转染的10个细胞的100％显示出共定位。
图1c显示了针对非重复单个基因座#72的muc4靶向基因座的示意图。图1d显示了使用1个grna的非重复单个基因座#72和e3(重复)基因座的共定位。来自10次独立转染的44个细胞的93％显示出共定位。图1e显示了针对非重复单个基因座#33的muc4靶向基因座的示意图。图1f显示了使用1个grna的非重复单个基因座#33和e3(重复)基因座的共定位。来自11次独立转染的87个细胞的92％显示出共定位。比例尺为5μm。箭头指向与muc4基因座结合的grna。
27.图2a-2h显示了非重复单个基因座的实时成像。图2a显示了每个使用1个grna的靶向muc4基因座对的示意图。网格显示了u2os细胞中基因座对(阴影)的共定位。图2b显示了基因座#1和#12的标记。来自4次独立转染的20个细胞的75％显示出共定位。图2c显示了基因座#22和基因座#33的标记。来自2次转染的10个细胞的100％显示出共定位。图2d显示了基因座#33和基因座#72的标记。来自3次转染的13个细胞的85％显示出共定位。图2e显示了基因座#46和#52的标记。来自3次转染的10个细胞的100％显示出共定位。图2f显示了基因座#56和#60的标记。来自3次转染的14个细胞的79％显示出共定位。图2g显示了基因座#65和#72的标记。来自3次转染的16个细胞的63％显示出共定位。图2h显示了基因座#72和#1的标记。来自2次转染的21个细胞的43％显示出共定位。比例尺为5μm。箭头指向与muc4基因座结合的grna。
28.图3a-3j显示了增加grna之间的距离会增加点之间的距离。图3a显示了距离3号染色体上的非重复基因座#33越来越远的靶向非重复基因座的示意图。图3b显示了在u2os细胞中一个非重复基因座和非重复基因座#33的信号之间的3d距离(每个点代表一个距离)。平均值是水平线。对于每个千碱基(kb)，n＝17-36个基因座对。每个kb成像8-16个细胞。图3c显示了距基因座#33为8kb的基因座的标记。平均距离为0.14μm(n＝30对)。图3d显示了距基因座#33为14kb的基因座的标记。平均距离为0.16μm(n＝25对)。图3e显示了距基因座#33为19kb的基因座的标记。平均距离为0.29μm(n＝30对)。图3f显示了距基因座#33为24kb的基因座的标记。平均距离为0.51μm(n＝19对)。图3g显示了距基因座#33为28kb的基因座的标记。平均距离为1.19μm(n＝20对)。图3h显示了距基因座#33为44kb的基因座的标记。平均距离为1.21μm(n＝28对)。图3i显示了距基因座#33为58.5kb的基因座的标记。平均距离为1.66μm(n＝36对)。图3j显示了距基因座#33为74kb的基因座的标记。平均距离为1.74μm(n＝17对)。比例尺为5μm。
29.图4a-4e显示了五个连续基因座的活细胞成像。图4a显示了casilio顺序0-28kb-44kb-58.5kb-74kb探针的示意图，其用于可视化chr3:195,735,394-195809539的74kb基因组区域，其中grna靶向三个位置(0，44kb，74kb)，15xpbsc募集clover-pufc，以及grna靶向两个位置(28kb，58.5kb)，15xpbs9r募集puf9r-mruby2。图4b和4d显示了在hek293t(b)和arpe-19(d)细胞中使用0-28kb-44kb-58.5kb 74kb casilio探针成像的chr3:195,735,394-195,809,539的代表性延时图像(比例尺，1
□
m)。图4c和4e显示了hek293t(c)和arpe-19(e)细胞在时间0处标记的荧光簇(参见b和d)的3d模型以及从x-y、y-z和z-x平面的显微视图。
30.图5a-5d显示了非重复序列#72的实时成像。显示了在u2os细胞中使用1个grna的muc4非重复单个基因座#72和e3基因座(重复)的共定位。来自10次转染的44个细胞的93％显示出共定位。比例尺为5μm。箭头指向与muc4基因座结合的grna。
31.图6a-6c显示了非重复序列#72的延时成像。图6a-6b显示了在u2os细胞中使用1个grna的muc4非重复单个基因座#72和e3重复的共定位。每30分钟拍摄一次图像，持续15小时。图6c显示了使用1个grna的muc4非重复单个基因座#72和e3重复的共定位。每30分钟拍摄一次图像，持续8小时。比例尺为5μm。箭头指向与muc4基因座结合的grna。
32.图7a-7d显示了非重复序列#33的实时成像。图7a-7d显示了在u2os细胞中使用1个grna的muc4非重复单个基因座#33和e3重复的共定位。来自11次转染的87个细胞的92％显示出共定位。比例尺为5μm。箭头指向与muc4基因座结合的grna。
33.图8a-8c显示了非重复cistr-act单个基因座的实时成像。图8a显示了cistr-act靶向基因座的示意图。图8b-8c显示了在u2os细胞中使用1个grna的cistr-act非重复单个基因座#4和#1的共定位。来自4次转染的12个细胞的100％显示出共定位。比例尺为5μm。箭头指向与cistr-act基因座结合的grna。
34.图9a-9g显示了染色质相互作用的活细胞成像。图9a显示了casilio探针的示意图，其用于可视化由cohensin(rad21)介导的染色质相互作用，其中grna靶向基因座a(基因组5’锚定)，15xpbsc募集clover-pufc，以及grna靶向基因座b(基因组3’锚定)，15xpbs9r募集puf9r-mruby2。图9b显示了chr3:187318256-187680546环的uwash基因组浏览器视图，其中3号染色体上的锚定的距离为367kb。基因座a和基因座b表示grna结合位置。图9c显示了在arpe-19细胞中chr3:187318256-187680546环锚定的代表性延时图像，基因座a靠近masp1(绿色)和基因座b靠近bcl6(洋红色)。左侧图像显示时间0时的整个细胞核(比例尺，5μm)。右侧的图像条显示了第1对(上)和第2对(下)在指定时间点的图像(比例尺，1μm)。图9d显示了第1对和第2对的荧光焦点随着时间的推移的配对距离。图9e显示了chr17:40302616-40355921环的uwash基因组浏览器视图，其中17号染色体上的锚定的距离为55kb。图9f显示了在arpe-19细胞中chr17:40302616-40355921环锚定的代表性延时图像，基因座a靠近cdc6(绿色)和基因座b靠近rara(洋红色)。左侧图像显示时间0时的整个细胞核(比例尺，5μm)。右侧的图像条显示了第1对(上)和第2对(下)在指定时间点的图像(比例尺，1μm)。图9g显示了第1对和第2对的荧光焦点随着时间的推移的配对距离。
具体实施方式
35.在一些方面中，本文提供了用于在活细胞的非重复基因组基因座每个基因座使用无催化活性的rna指导的核酸酶(例如，dcas9)和单个独特指导rna(grna)成像的方法和组合物。例如，这些方法可以用于实时检查不同基因的局部和全局三维(3d)结构。如本文所示，使用双标记grna对检查基因的基因座3d结构，所述双标记grna包括锚定grna和设计为在相对于锚定grna增加的基因组距离处结合的grna。使用该技术观察了在标记的基因座处染色质折叠的异质性和动态性质。本公开内容的方法解决了与使用活细胞成像研究核过程相关的很多技术挑战，如染色质重塑，尤其是在难以转染的细胞中。这些方法还简化了全基因组grna文库设计，因为每个目标基因座可以用一个grna靶向，而其他方法需要每个靶基因座多个grna。因此，本文所述的方法和组合物，在一些实施方式中，促进(表观)基因组的扰动(例如，使用激活剂和阻遏剂模块)和伴随的3d染色质相互作用动力学的读取(使用本文描述的成像模块)，提供可定制和灵活的技术来研究，除其他以外，核结构和过程。
36.活细胞成像
37.染色质构象、定位和动力学对于调控细胞行为很重要。虽然基于荧光原位杂交的技术已广泛用于研究健康和患病条件下的染色质结构，但细胞固定的要求禁止对染色质活性进行全面的动态分析。最近，已将dcas9-grna系统用于靶向非重复基因座，但是由于将数十个grna递送到细胞中的挑战以及递送如此大量grna伴随着脱靶效应增加，这些系统难以用于生物学应用(chen b等，cell 2013；155:1479
–
1491；和anton t.等，nucleus 2014；5:163
–
172)。
38.本文提供的平台通过使用每个基因座的单个独特grna对非重复(和/或包含低重复)区域进行多色标记来解决这些挑战。本文的方法使用(a)无催化活性的rna指导的核酸酶(例如，dcas9)，独特rna(grna)，其包含(i)与非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和(b)与puf结构域连接的可检测分子(例如，荧光蛋白)(可检测缀合物)，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列。在活细胞中，将由rna指导的核酸酶和grna相互作用形成的复合物引导至特定非重复基因组基因座，其中grna作为可检测缀合物的对接位点。可检测信号能够在一个或多个非重复基因组基因座进行活细胞成像。
39.应当理解的是，“独特grna”指仅与限定区域内，例如，在1kb区域内的一个基因组基因座(例如，一个染色质基因座)结合的grna。也就是说，将独特grna设计为包含dna靶向序列，其仅与定义区域内的一个其他序列互补。在一些实施方式中，将独特grna设计为仅与细胞整个基因组中的一个序列结合。尽管如此，如本领域公知的，即使将grna设计为对特定基因座而言是独特的，其在一些情况下也可能结合“脱靶”。
40.在一些方面中，本文的方法包括对包含多个基因组基因座的活细胞成像，每个基因组基因座由三元复合物结合，所述三元复合物包含由可检测缀合物结合的单个独特grna和无催化活性的rna指导的核酸酶。
41.本公开内容的活细胞成像(可视化)方法，在一些实施方式中，用于对染色质动力学进行成像，例如，以检查基因组的组织和变化。例如，本文的方法可用于通过在相对于初始“锚定”grna和/或相对于彼此增加的距离处标记多个基因座来监测染色质结构的多维度变化。
42.在一些实施方式中，将所述方法用于研究染色质在转录调控中的作用。例如，可以将本文的方法用于在整个细胞周期中跟踪染色质基因座(例如，非重复基因座)，以确定细胞核中转录活性和非转录活性区域的不同定位。在一些实施方式中，可以将所述方法用于对表观遗传调控进行成像。
43.在一些实施方式中，可以将所述方法用于对与dna复制、dna损伤修复和/或基因表达相关的过程进行成像(例如，研究、检查等)。
44.在一些实施方式中，将所述方法用于检测细胞中的染色体重排。所述方法可以包括，例如，向活细胞递送以下：(a)无催化活性的rna指导的核酸酶，(b)第一单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在核酸酶切割位点附近和上游(5’)结合，(c)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合第一grna的puf结构域结合序列，(d)第二单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在核酸酶切割位点附近和下游(3’)结合，和(e)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合第二grna的puf结构域结合序列，其中每个grna还包含rna指导的核酸酶结合序列和puf结构域结合序列。
所述方法可以进一步包括在活细胞中对第一grna和第二grna之间的距离进行成像以确定染色体重排的存在与否。两个grna之间的距离比预期的大，例如，可能表明存在染色体重排。或者，两个grna之间的预期距离可能表明不存在染色体重排。
45.各种类型的染色体重排是公知的。在一些实施方式中，染色体重排是易位、倒位、重复或缺失。
46.本公开内容的其他方面提供了用于鉴定细胞中的基因异常的方法，其包括向活细胞递送以下：(a)无催化活性的rna指导的核酸酶，(b)第一单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在基因异常附近和上游结合，(c)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第一grna的所述puf结构域结合序列，(d)第二单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在基因异常附近和下游结合，和(e)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第二grna的所述puf结构域结合序列，其中每个grna还包含rna指导的核酸酶结合序列和puf结构域结合序列。所述方法可以进一步包括在活细胞中对第一grna和第二grna之间的距离进行成像以确定染色体重排的存在与否。在一些实施方式中，基因异常是染色体重排。在一些实施方式中，染色体重排是易位、倒位、重复或缺失。
47.在一些方面中，所述方法用于检测活细胞中的多个非重复基因组基因座(例如，染色质重排)。例如，所述方法可以用于检测2-100、2-75、2-50、2-25、2-15、2-10、5-100、5-75、5-50、5-25、5-15、5-10、10-100、10-75、10-50、10-25或10-15个非重复基因座。在一些实施方式中，所述方法可以用于检测2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个非重复基因座。因此，在一些实施方式中，使用2-100、2-75、2-50、2-25、2-15、2-10、5-100、5-75、5-50、5-25、5-15、5-10、10-100、10-75、10-50、10-25或10-15个独特grna(或编码grna的核酸)转染活细胞。例如，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个独特grna(或编码grna的核酸)转染本文的活细胞。
48.单个基因座可以与任何其他基因座分开至少1千碱基对(kb)的距离。在一些实施方式中，单个基因座与另一个基因座分开1kb至100kb的距离。例如，单个基因座可以与任何其他基因座分开1-5kb、1-10kb、1-15kb、1-20kb、1-25kb、1-30kb、1-35kb、1-40kb、1-45kb、1-50kb、1-55kb、1-60kb、1-65kb、1-70kb、1-75kb、1-80kb、1-85kb、1-90kb、1-100kb、5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、10-20kb、10-30kb、10-40kb、10-50kb、10-60kb、10-70kb、10-80kb、10-90kb、10-100kb、20-30kb、20-40kb、20-50kb、20-60kb、20-70kb、20-80kb、20-90kb、20-100kb、30-40kb、30-50kb、30-60kb、30-70kb、30-80kb、30-90kb、30-100kb、40-50kb、40-60kb、40-80kb、40-100kb、50-60kb、50-80kb、50-100kb、60-70kb、60-80kb、60-100kb、70-80kb、70-90kb、70-100kb、80-90kb、80-100kb或90-100kb的距离。在一些实施方式中，在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、55kb、60kb、65kb、70kb、75kb、80kb、85kb、90kb、95kb、100kb或更多。在一些实施方式中，grna不是混合的，即，grna不针对相同的基因组基因座。
49.在一些实施方式中，标记的基因座相对于“锚定”基因座位于越来越远的距离。锚
定基因座只是如本文提供的标记的已知固定基因座。其他标记基因座可以表征为位于距锚定基因座一定距离。如在实施例中所示，例如，本文中的grna可设计为在相对于锚定grna增加的基因组距离处结合。通过这种方式，可以相对于彼此对某个基因区域内的多个基因座进行标记、成像和表征，以提供有关该基因组区域中例如动态染色质相互作用的信息。例如，第一个基因座可以位于距锚定基因座1kb的距离处，第二个基因座可以位于距锚定基因座2kb的距离处(例如，距第一个基因座1kb)，第三个基因座可以位于距锚定基因座3kb的距离处(例如，距第二个基因座1kb和距第一个基因座2kb)，依此类推。
50.例如，可检测分子可以是荧光蛋白、荧光团或其他荧光分子。本文使用的可检测分子相对于彼此可以是相同的或不同的。例如，在单个细胞中的所有可检测分子可以是绿色荧光蛋白(gfp)，每个都定位于单个基因座，或者可以使用多个不同的荧光蛋白(例如，红色、绿色、蓝色、黄色；每种颜色定位于一个基因座)。因此，在一些实施方式中，可以使用相对于彼此具有不同发射波长的荧光蛋白。在一些实施方式中，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同可检测分子(例如，不同荧光蛋白)。可以用于本文的荧光蛋白的非限制性实例包括gfp、clover、mruby2、superfolder gfp、egfp、bfp、ebfp、ebfp2、azurite、mkalama1、cfp、ecfp、cerulean、cypet、mturquoise2、yfp、citrine、venus、ypet、bfpms1、rogfp和胆红素诱导荧光蛋白如unag、dsred、eqfp611、dronpa、tagrfp、kfp、eosfp、dendra、irisfp。可以使用其他荧光蛋白。
51.可以在转染后12-96小时进行成像。例如，可以在转染后12、24、36、48、60、72、84或96小时进行成像。作为另一个实例，可以在转染后12-24、12-48、12-72、24-48、24-72或48-72小时进行成像。成像可以进行小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟。在一些实施方式中，在某些时间点获取图像，例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒。在一些实施方式中，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟获取图像。在一些实施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、24、36、48、60或72小时时间段进行成像。例如，可以每30分钟捕获图像，持续5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20小时。
52.可以通过本领域公知的任何方法完成成像。选择的成像方法取决于所使用的可检测分子。例如，当使用荧光可检测分子时，可以将荧光显微镜(例如，共聚焦荧光显微镜)用于检查活细胞群。
53.rna指导的核酸酶
54.本文所述的方法包括使用rna指导的核酸酶，如无催化活性的rna指导的核酸酶。将所述无催化活性的rna指导的核酸酶工程化为具有降低或缺乏的核酸酶活性，但是当与grna复合时保留其dna结合能力。rna指导的核酸酶的实例包括cpfl、cas9及其活性片段、衍生物和变体。在一个实施方式中，所述无催化活性的rna指导的核酸酶是修饰的cas9蛋白，如死cas9(dcas9)蛋白。在一些实施方式中，dcas9基本上没有可检测的核酸内切酶(例如，脱氧核糖核酸内切酶)活性。在一些实施方式中，当dcas9具有降低的催化活性时(例如，当cas9蛋白具有d10、g12、g17、e762、h840、n854、n863、h982、h983、a984、d986和/或a987突变时，例如，d10a、g12a、g17a、e762a、h840a、n854a、n863a、h982a、h983a、a984a和/或d986a)，多肽仍可以位点特异性方式结合至靶dna，因为其仍被grna的dna靶向序列引导至靶多核苷酸序列，只要其保留与grna的cas9结合序列的相互作用能力即可。
55.在一些情况下，dcas9切割靶dna的互补链和非互补链的能力降低。作为非限制性实例，在一些情况下，dcas9具有wo2013/176772的图3中描述的氨基酸序列的d10a和h840a突变或wo 2013/176772的seq id no:1-256和795-1346中列出的任何氨基酸序列的相应突变(所有这些序列以引用的方式并入)。
56.指导rna(grna)
57.rna指导的核酸酶与工程化的指导rna(grna)如独特单个grna相互作用。本文所述的独特单个grna包含至少三个组分：dna靶向序列、rna指导的核酸酶结合序列和rna结合蛋白(rbp)结构域结合序列。在一些实施方式中，这三个区段按从5’到3’的顺序排列。
58.grna的rna指导的核酸酶结合序列和无催化活性的核糖核酸(rna)指导的核酸酶(例如，dcas9蛋白)基于靶向dna的序列和靶多核苷酸序列之间的序列互补性，可以形成与特定靶多核苷酸序列结合的复合物。grna的dna靶向序列通过其与靶dna的靶多核苷酸序列的序列互补性为复合物提供靶特异性，如下文所讨论的。
59.dna靶向序列
60.dna靶向序列包含与靶dna(或靶dna的互补链)内的特定序列互补的核苷酸序列。换言之，dna靶向序列通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶dna的靶多核苷酸序列相互作用。这样，dna靶向序列的核苷酸序列可能会有所不同，其决定了grna和靶dna将相互作用的靶dna内的位置。可以对dna靶向序列进行修饰或设计(例如，通过基因工程)以与靶dna内的任何所需序列杂交。在一些实施方式中，dna靶向序列与非重复基因组基因座内的序列互补，例如，dna靶向序列靶向染色质序列。在一些实施方式中，靶多核苷酸序列紧邻互补链的pam(原型间隔物相邻基序)序列的3’，其可以是5
’‑
ccn-3’，其中n是任何dna核苷酸。即，在该实施方式中，靶多核苷酸序列的互补链紧邻pam序列的5’，即5
’‑
ngg-3’，其中n是任何dna核苷酸。在相关实施方式中，互补链的pam序列匹配无催化活性的rna指导的核酸酶(例如，dcas9)。
61.dna靶向序列可以具有从约12个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，dna靶向序列可以具有从约12个核苷酸至约80nt、从约12nt至约50nt、从约12nt至约40nt、从约12nt至约30nt、从约12nt至约25nt、从约12nt至约20nt或从约12nt至约19nt的长度。例如，dna靶向序列可以具有从约19nt至约20nt、从约19nt至约25nt、从约19nt至约30nt、从约19nt至约35nt、从约19nt至约40nt、从约19nt至约45nt、从约19nt至约50nt、从约19nt至约60nt、从约19nt至约70nt、从约19nt至约80nt、从约19nt至约90nt、从约19nt至约100nt、从约20nt至约25nt、从约20nt至约30nt、从约20nt至约35nt、从约20nt至约40nt、从约20nt至约45nt、从约20nt至约50nt、从约20nt至约60nt、从约20nt至约70nt、从约20nt至约80nt、从约20nt至约90nt或从约20nt至约100nt的长度。
62.与靶dna的靶多核苷酸序列互补的dna靶向序列的核苷酸序列可以具有至少约12nt的长度。例如，与靶dna的靶多核苷酸序列互补的dna靶向序列可以具有至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt的长度。例如，与靶dna的靶多核苷酸序列互补的dna靶向序列可以具有从约12个核苷酸(nt)至约80nt、从约12nt至约50nt、从约12nt至约45nt、从约12nt至约40nt、从约12nt至约35nt、从约12nt至约30nt、从约12nt至约25nt、从约12nt至约20nt、从约12nt至约19nt、从约19nt至约20nt、从约19nt至约25nt、从约19nt至约30nt、从约19nt至约35nt、从约
19nt至约40nt、从约19nt至约45nt、从约19nt至约50nt、从约19nt至约60nt、从约20nt至约25nt、从约20nt至约30nt、从约20nt至约35nt、从约20nt至约40nt、从约20nt至约45nt、从约20nt至约50nt或从约20nt至约60nt的长度。与靶dna的靶多核苷酸序列互补的dna靶向序列的核苷酸序列可以具有至少约12nt的长度。
63.在一些情况下，与靶dna的靶多核苷酸序列互补的dna靶向序列的长度为20个核苷酸。在一些情况下，与靶dna的靶多核苷酸序列互补的dna靶向序列的长度为19个核苷酸。
64.dna靶向序列和靶dna的靶多核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少50％(例如，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。在一些情况下，dna靶向序列和靶多核苷酸序列之间的互补性百分比在靶多核苷酸序列的七个或八个连续的最5
’‑
核苷酸上是100％。在一些情况下，dna靶向序列和靶多核苷酸序列之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上是至少60％。在一些情况下，dna靶向序列和靶多核苷酸序列之间的互补性百分比在靶多核苷酸序列的7、8、9、10、11、12、13或14个连续的最5
’‑
核苷酸上(即，dna靶向序列的7、8、9、10、11、12、13或14个连续的最3
’‑
核苷酸)是100％，其余低至0％。在这种情况下，可以认为dna靶向序列的长度分别是7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。
65.rna指导的核酸酶结合序列
66.grna的rna指导的核酸酶结合序列结合无催化活性的rna指导的核酸酶(例如，dcas9)。无催化活性的rna指导的核酸酶和grna的rna指导的核酸酶结合序列一起结合由dna靶向序列识别的靶多核苷酸序列。rna指导的核酸酶结合序列包含两个互补的核苷酸片段，其彼此杂交以形成双链rna双链体(dsrna双链体)。这两个互补的核苷酸片段可以通过称为接头或接头核苷酸的插入核苷酸而共价连接(例如，在单个分子多核苷酸的情况下)，并杂交形成cas9结合序列的双链rna双链体(dsrna双链体，或“cas9结合发夹”)，从而形成茎环结构。
67.rna指导的核酸酶结合序列可以具有从约10个核苷酸至约100个核苷酸，例如，从约10个核苷酸(nt)至约20nt、从约20nt至约30nt、从约30nt至约40nt、从约40nt至约50nt、从约50nt至约60nt、从约60nt至约70nt、从约70nt至约80nt、从约80nt至约90nt或从约90nt至约100nt的长度。例如，rna指导的核酸酶结合序列可以具有从约15个核苷酸(nt)至约80nt、从约15nt至约50nt、从约15nt至约40nt、从约15nt至约30nt、从约37nt至约47nt(例如，42nt)或从约15nt至约25nt的长度。
68.rna指导的核酸酶结合序列的dsrna双链体可以具有从约6个碱基对(bp)至约50bp的长度。例如，cas9结合序列的dsrna双链体可以具有从约6bp至约40bp、从约6bp至约30bp、从约6bp至约25bp、从约6bp至约20bp、从约6bp至约15bp、从约8bp至约40bp、从约8bp至约30bp、从约8bp至约25bp、从约8bp至约20bp或从约8bp至约15bp的长度。例如，rna指导的核酸酶结合序列的dsrna双链体可以具有从约8bp至约10bp、从约10bp至约15bp、从约15bp至约18bp、从约18bp至约20bp、从约20bp至约25bp、从约25bp至约30bp、从约30bp至约35bp、从约35bp至约40bp或从约40bp至约50bp的长度。在一些实施方式中，rna指导的核酸酶结合序列的dsrna双链体具有36个碱基对的长度。杂交以形成rna指导的核酸酶结合序列的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少约60％。例如，杂交以形成rna指导的核酸酶结合序列的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少约65％、至
少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。在一些情况下，杂交以形成rna指导的核酸酶结合序列的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比是100％。
69.接头可以具有从约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，接头可以具有从约3个核苷酸(nt)至约90nt、从约3个核苷酸(nt)至约80nt、从约3个核苷酸(nt)至约70nt、从约3个核苷酸(nt)至约60nt、从约3个核苷酸(nt)至约50nt、从约3个核苷酸(nt)至约40nt、从约3个核苷酸(nt)至约30nt、从约3个核苷酸(nt)至约20nt或从约3个核苷酸(nt)至约10nt的长度。例如，接头可以具有从约3nt至约5nt、从约5nt至约10nt、从约10nt至约15nt、从约15nt至约20nt、从约20nt至约25nt、从约25nt至约30nt、从约30nt至约35nt、从约35nt至约40nt、从约40nt至约50nt、从约50nt至约60nt、从约60nt至约70nt、从约70nt至约80nt、从约80nt至约90nt或从约90nt至约100nt的长度。在一些实施方式中，接头是4nt。
70.可以包含在适宜rna指导的核酸酶结合序列(即，cas9手柄)中的核苷酸序列的非限制性实例如wo 2013/176772的seq id no:563-682中所示(参见，例如，wo 2013/176772的图8和图9)，其通过引用并入本文。
71.在一些情况下，适宜rna指导的核酸酶结合序列包含与任一上文列出的序列具有1、2、3、4或5个核苷酸差异的核苷酸序列。
72.rna结合蛋白(rbp)结构域结合序列
73.grna包含一个或多个串联序列，每个串联序列可以被特定的rna结合蛋白结构域(例如，pumilio-fbf(puf)结构域)特异性识别和结合。可以将此类序列，在本文中称为rna结合蛋白(rbp)结构域结合序列(例如，puf结构域结合序列，pbs)，工程化为结合任何rbp结合结构域(例如，puf结构域)。例如，基于puf结构域的单独puf基序与其识别的单个rna核苷酸之间的核苷酸特异性相互作用，pbs序列可以是结合其相应puf结构域的任何设计序列。
74.在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有8-mer。在其他实施方式中，本公开内容的pbs具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个rna核苷酸。
75.在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uguauaua-3’，并且结合野生型人pumilio 1puf结构域。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uguaugua-3’，并且结合puf结构域puf(3-2)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uugauaua-3’，并且结合puf结构域c。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uggauaua-3’，并且结合puf结构域puf(6-2)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uuuauaua-3’，并且结合puf结构域puf(7-2)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
ugugugug-3’，并且结合puf结构域puf
531
。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uguauaug-3’，并且结合puf结构域puf(1-1)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uuuauaua-3’或5
’‑
uauauaua-3’，并且结合puf结构域puf(7-1)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uguauuua-3’，并且结合puf结构域puf(3-1)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uuuauuua-3’，并且结合puf结构域puf(7-2/3-1)。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uugaugua-3’，并且结合puf结构域pufc。在一些实施方式中，本公开内容的pbs具有序列5
’‑
uguuguaua-3’，并且结合puf结构域puf9r。wo 2016/148994中描述的任何一种puf结构域都可以如本文所提供的那样使用。可以使用其他puf结构域。
76.在一些实施方式中，一个或多个间隔物区域分隔两个相邻的pbs序列。间隔物区域可以具有从约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，间隔物可以具有从约3个核苷酸(nt)至约90nt、从约3个核苷酸(nt)至约80nt、从约3个核苷酸(nt)至约70nt、从约3个核苷酸(nt)至约60nt、从约3个核苷酸(nt)至约50nt、从约3个核苷酸(nt)至约40nt、从约3个核苷酸(nt)至约30nt、从约3个核苷酸(nt)至约20nt或从约3个核苷酸(nt)至约10nt的长度。例如，间隔物可以具有从约3nt至约5nt、从约5nt至约10nt、从约10nt至约15nt、从约15nt至约20nt、从约20nt至约25nt、从约25nt至约30nt、从约30nt至约35nt、从约35nt至约40nt、从约40nt至约50nt、从约50nt至约60nt、从约60nt至约70nt、从约70nt至约80nt、从约80nt至约90nt或从约90nt至约100nt的长度。在一些实施方式中，间隔物是4nt。
77.可检测的缀合物
78.为了对一个或多个靶向的非重复基因座成像，需要至少一个可检测分子。在一些实施方式中，将rna结合蛋白(rbp)结构域序列(例如，puf结构域序列)连接至可检测分子(在本文中称为可检测缀合物)，可以将其用于对活细胞成像。在一些实施方式中，可检测分子可以是荧光蛋白、多肽、变体或其功能性结构域，如gfp、clover、mruby2、superfolder gfp、egfp、bfp、ebfp、ebfp2、azurite、mkalama1、cfp、ecfp、cerulean、cypet、mturquoise2、yfp、citrine、venus、ypet、bfpms1、rogfp和胆红素诱导的荧光蛋白，如unag、dsred、eqfp611、dronpa、tagrfps、kfp、eosfp、dendra、irisfp等。在一些实施方式中，可检测分子是荧光团。可以使用其他可检测分子。
79.与可检测分子连接的rbp结构域与grna的rbp结构域结合序列杂交。然后，可以对可检测分子成像，指示一个或多个靶非重复基因座或基因座。在一些实施方式中，rbp结构域序列是puf结构域。
80.puf蛋白(以果蝇(drosophila)pumilio和秀丽隐杆线虫(c.elegans)fern-3结合因子命名)公知参与介导mrna稳定性和翻译。这些蛋白包含独特的rna结合结构域，称为puf结构域。rna结合puf结构域，如人pumilio 1蛋白(本文称为pum)的结构域，包含8个重复序列(每个重复序列称为puf基序或puf重复序列)，其以反向平行方式结合连续碱基，每个重复序列识别单个碱基，即puf重复序列r1至r8分别识别核苷酸n8至n1。例如，pum由8个串联重复序列组成，每个重复序列由34个氨基酸组成，这些氨基酸折叠成由α螺旋组成的紧密排列的结构域。在一些实施方式中，rbp结构域-可检测分子构建体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个puf结构域。
81.每个puf重复序列使用来自每个重复序列中心的两个保守氨基酸来特异性识别rna识别序列中一个单独碱基的边缘，并使用第三个氨基酸(tyr、his或arg)堆叠在相邻碱基之间，导致puf结构域和8-mer rna之间的十分特异性的结合。例如，识别碱基u的密码是氨基酸序列“nyxxq”，其中“(c/s)rxxq”识别a和“snxxe”识别g。这些氨基酸对应于人pumilio 1puf基序中的第12、13和16位。每个pufα-α-α重复序列中位置12和16的两个识别氨基酸侧链识别相应碱基的watson-crick边缘，并在很大程度上决定了该重复序列的特异性。
82.因此，puf结构域的序列特异性可以通过改变rna识别序列内碱基识别所涉及的保守氨基酸(例如，通过定点诱变)来精确改变。通过改变每个重复序列中的两个氨基酸，可以修饰puf结构域以结合几乎任何8-nt rna序列。这种独特的结合系统使puf及其衍生物成为
可编程的rna结合结构域，可以在一些实施方式中进行工程改造，以结合grna中的特定puf结构域结合序列，从而将检测分子带到grna上的特定pbs。
83.如本文所用，“puf结构域”是指野生型或天然存在的puf结构域，以及基于/衍生自天然或现有puf结构域，如原型人pumilio 1puf结构域的puf同源结构域。本公开内容的puf结构域特异性结合rna序列(例如，8-mer rna序列)，其中puf结构域和rna序列之间的整体结合特异性由puf结构域内的每个puf基序/puf重复序列与相应的单个rna核苷酸之间的序列特异性结合来定义。
84.在一些实施方式中，puf结构域包含或基本上由8个puf基序组成，其每一个特异性识别并结合一个rna核苷酸(例如，a、u、g或c)。
85.在一些实施方式中，puf结构域具有多于或少于8个puf基序/重复序列，例如，puf结构域包含或基本上由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个puf重复序列/基序组成，每个特异性识别和结合一个rna核苷酸(例如，a、u、g或c)，只要puf结构域结合5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个核苷酸的rna即可。通过增加或减少puf基序的数量，识别的rna的长度将相应增加或减少。由于每个puf基序识别一个rna碱基，因而将结构域减少一个基序会减少一个碱基识别的rna的长度；而当结构域增加一个基序时，则增加一个碱基识别的rna的长度。可以存在任何数量的基序。因此，在此类实施方式中，本公开内容的puf结构域-融合的特异性可能因puf结构域长度的变化而改变。在一些实施方式中，将其他puf基序插入两个原始puf基序之间，例如，在第1个之前，在第1个和第2个之间、在第2个和第3个之间、在第3个和第4个之间，在第4个和第5个之间，在第5个和第6个之间，在第6个和第7个之间，在第7个和第8个之间或者在第8个之后。在一些实施方式中，在上述任何插入点之间有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个插入的puf基序。例如，在一些实施方式中，在第5个和第6个原始puf基序之间有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个插入的puf基序。filipovska等(nature chemical biology doi:10.1038/nchembio.577，网络出版：2011年5月15日)已报道了具有16个puf基序的工程化puf结构域，包括在第5个和第6个原始puf基序之间插入的8个其他puf基序。
86.在一些实施方式中，puf结构域包含来自不同蛋白的不同puf结构域的puf基序。例如，本公开内容的puf结构域可以用来自人pumilio 1蛋白的puf基序和来自一种或多种其他puf蛋白(如pudp或fbf)的一个或多个其他puf基序构建。puf结构域的rna结合口袋具有天然的凹曲率。由于不同puf蛋白可能具有不同的曲率，因而可以使用puf结构域中的不同puf基序来改变puf结构域的曲率。改变曲率是改变puf结构域的特异性和/或结合亲和性的另一种方法，因为更平坦的曲率可以允许识别更多的rna碱基。
87.本公开内容的范围还包括主题puf结构域或其融合的功能性变体。如本文所用，术语“功能性变体”指与亲本puf结构域具有实质或显著序列同一性或相似性的puf结构域，其功能性变体保留其作为变体的puf结构域的生物学活性-例如，与亲本puf结构域相比，在结合亲和性方面保留了以相似程度、相同程度或更高程度识别靶rna的能力，和/或具有与亲本puf结构域基本相同或相同的结合特异性。例如，功能性变体puf结构域的氨基酸序列与亲本puf结构域具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更高同一性。功能性变体可以，例如，包含具有至少一个保守性氨基酸取代的亲本puf结构域的氨基酸序列，例如，在puf结构域支架中的保守性氨基酸取代(即，不与rna相互作用的氨基酸)。或者或另外的，功
能性变体可以包含具有至少一个非保守性氨基酸取代的亲本puf结构域的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能性变体的生物学活性。非保守氨基酸取代可以增强功能性变体的生物学活性，使得功能性变体的生物学活性与亲本puf结构域相比增加，或者可以将puf结构域的稳定性改变到所需水平(例如，由于在支架中的氨基酸取代)。puf结构域可以基本上由一个或多个本文所述的特定氨基酸序列组成，使得其他组分，例如，其他氨基酸，不会实质性地改变功能性变体的生物活性。
88.在一些实施方式中，puf结构域是pumilio同源结构域(pu-hud)。在特定实施方式中，pu-hud是人pumilio 1结构域。人pum的序列是本领域公知的，并且在下文再现(seq id no:53)：
[0089][0090]
wt人pum特异性结合nanos响应元件(nre)rna，其具有核心8-nt序列5
’‑
uguauaua-3’。
[0091]
在一些实施方式中，本公开内容的puf结构域是具有pum-hd结构域的任何puf蛋白家族成员。puf家族成员的非限制性实例包括在秀丽隐杆线虫中的fbf、在果蝇中的ds pum以及在植物如拟南芥和水稻中的puf蛋白。tam等提供了拟南芥、水稻以及其他植物和非植物物种的pum-hd系统发育树(“the puf family of rna-binding proteins in plants:phylogeny,structural modeling,activity and subcellular localization.”bmc plant biol.10:44,2010，其全部内容通过引用并入本文)。
[0092]
puf家族成员从酵母到人类都是高度保守的，并且该家族的所有成员都以序列特异性方式与rna结合，并具有可预测的密码。在prosite数据库(swiss institute of bioinformatics)中该结构域的登录号为ps50302，该家族的一些成员的序列比对如wo 2011-160052 a2的图5和图6所示(人、小鼠、大鼠)pumilio 1(hpum1、mpum1、ratpum1)以及人和小鼠pumilio 2(hpum2、mpum2)分别进行clustalw多序列比对)。
[0093]
任何主题puf结构域都可以使用例如golden gate assembly试剂盒((参见abil等，journal of biological engineering 8:7,2014)，其可以在addgene(kit#
1000000051)获得)制备。
[0094]
细胞
[0095]
如上文所讨论的，本文所述的方法可以用于对活细胞成像(例如，体内、体外和/或原位)。因为grna通过与靶dna的靶多核苷酸序列杂交来提供特异性，所以细胞包括但不限于细菌细胞；古菌细胞；单细胞真核生物；植物细胞；藻细胞，例如，布朗葡萄藻(botryococcus braunii)、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻(nannochloropsis gaditana)、蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(sargassum patens)、c.agardh等；真菌细胞；动物细胞；来自无脊椎动物(例如，昆虫、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞；真核寄生虫(例如，疟疾寄生虫，例如，恶性疟原虫(plasmodium falciparum)；蠕虫等)；来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞；哺乳动物细胞，例如，啮齿动物细胞、人细胞、非人灵长类动物细胞等。适于成像的细胞包括天然存在的细胞；基因修饰的细胞(例如，在实验室中基因修饰的细胞，例如，通过“人工”)；和以任何方式在体外操纵的细胞。在一些实施方式中，细胞是分离的或培养的。
[0096]
任何类型的细胞都可能是感兴趣的(例如，干细胞，例如，胚胎干(es)细胞、诱导多能干(ips)细胞、生殖细胞；体细胞，例如，成纤维细胞、造血细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞；任何阶段胚胎的体外或体内胚胎细胞，例如，1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞等阶段的斑马鱼胚胎等)。细胞可以来自已建立的细胞系，或者其可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，指源自受试者的细胞和细胞培养物，并允许培养物在体外生长有限的传代次数(即，分裂)。例如，原代培养物包括可能已传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但没有足够时间经历危机阶段的培养物。原代细胞系可在体外维持少于10代。在一些实施方式中，细胞在培养基中生长。
[0097]
如果细胞是原代细胞，则可以通过任何方便的方法从个体收获这些细胞。例如，白细胞可以通过单采术、白细胞单采术、密度梯度分离等方便地收获，而来自皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、肠、胃等组织的细胞最方便地通过组织活检来收获。可以使用合适的溶液来分散或悬浮收获的细胞。此类溶液通常是平衡盐溶液，例如，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、hank’s平衡盐溶液等，可以方便地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及可接受的低浓度缓冲液，例如，5-25mm。方便的缓冲液包括hepes、磷酸盐缓冲液、乳酸缓冲液等。细胞可以立即使用，或者其可以长期储存、冷冻、解冻并能够重复使用。在这种情况下，通常将细胞冷冻在10％二甲基亚砜(dmso)、50％血清、40％缓冲培养基或本领域常用的其他溶液中，以在这种冷冻温度下保存细胞，并以本领域公知的用于解冻冷冻培养细胞的方式解冻。
[0098]
将grna、rna指导的核酸酶和可检测分子构建体引入细胞
[0099]
可以通过多种众所周知的方法中的任何一种将grna、rna指导的核酸酶(例如，dcas9)和可检测分子构建体(例如，与rbp结构域连接的可检测分子)引入细胞。
[0100]
将核酸引入细胞的方法是本领域公知的，并且任何已知的方法都可以用于将核酸(例如，载体或表达构建体)引入靶细胞。适宜的方法包括例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(pei)介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接微量注射、纳米粒子
介导的核酸递送(参见，例如，panyam等，adv.drug deliv.rev.,pii:s0169-409x(12)00283-9.doi:10.1016/j.addr.2012.09.023)等。在一个实施方式中，通过转染将grna、rna指导的核酸酶(例如，dcas9)和可检测分子构建体(例如，与rbp结构域连接的可检测分子)引入细胞。
[0101]
因此，本公开内容还提供了包含编码grna的核苷酸序列的分离的核酸。在一些情况下，分离的核酸还包含编码rna指导的核酸酶(例如，dcas9)的核苷酸序列。
[0102]
在一个实施方式中，将dcas9、包含puf结合位点的grna和puf可检测分子构建体克隆到单独的质粒中。然后，可以使用本领域公知的任何方法(例如，使用bglii)将质粒线性化，之后进行体外转录。随后将所得rna用于转染细胞。在一些实施方式中，使用一种以上grna(例如，以检测多个基因座)。在这些情况下，每种grna可以等量添加(例如，每种grna 33ng)或不等量(例如，一种grna 33ng，不同grna 67ng)。
[0103]
在一些实施方式中，主题方法涉及向细胞(或细胞群)中引入一种或多种核酸(例如，载体)，其包含编码单个独特grna和/或rna指导的核酸酶(例如，dcas9蛋白)和/或可检测分子构建体(例如，与荧光蛋白连接的puf结构域)的核苷酸序列。在一些实施方式中，包含靶dna的细胞是体外的。适宜的核酸包括表达在他，所述核酸包含编码单个独特grna和/或rna指导的核酸酶(例如，dcas9蛋白)和/或可检测分子构建体(例如，与荧光蛋白连接的puf结构域)的核苷酸序列，其中所述表达载体可以是重组表达载体。
[0104]
在一些实施方式中，重组表达载体是病毒构建体，例如，重组腺相关病毒构建体(参见，例如，美国专利号7,078,387)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体等。
[0105]
适宜的表达载体包括但不限于病毒载体(例如，基于牛痘病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，li等，invest opthalmol.vis.sci.,35:2543-2549,1994；borras等，gene ther.,6:515-524,1999；li和davidson,proc.natl.acad.sci.usa,92:7700-7704,1995；sakamoto等，hum.gene ther.,5:1088-1097,1999；wo 94/12649，wo 93/03769；wo 93/19191；wo 94/28938；wo 95/11984和wo 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，ali等，hum.gene ther.,9:81-86,1998，flannery等，proc.natl.acad.sci.usa,94:6916-6921,1997；bennett等，invest opthalmol vis sci38:2857-2863,1997；jomary等，gene ther.,4:683-690,1997，rolling等，hum.gene ther.,10:641-648,1999；ali等，hum.mol.genet.,5:591-594,1996；srivastava wo 93/09239,samulski等，j.vir.,63:3822-3828,1989；mendelson等，virol.,166:154-165,1988；和flotte等，proc.natl.acad.sci.usa,90:10613-10617,1993)；sv40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，miyoshi等，proc.natl.acad.sci.usa,94:10319-23,1997；takahashi等，j.virol.,73:7812-7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，小鼠白血病病毒、脾坏死病毒和来自逆转录病毒的载体，如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、hiv病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。
[0106]
很多适宜的表达载体是本领域技术人员公知的，并且很多是可商购的。以实例的方式提供了以下载体；针对真核宿主细胞：pxtl、psg5(stratagene)、psvk3、pbpv、pmsg和psvlsv40(pharmacia)。然而，可以使用任何其他载体，只要其与宿主细胞相容即可。
[0107]
取决于所使用的宿主/载体系统，很多适宜的转录和翻译控制元件中的任何一种，
包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等都可以用于表达载体中(参见，例如，bitter等，methods in enzymology,153:516-544,1987)。
[0108]
试剂盒
[0109]
本公开内容还提供了用于执行主题方法的试剂盒。主题试剂盒可以包含：(a)本公开内容的独特单个grna，或包含编码其的核苷酸序列的核酸(例如，载体)；任选地，(b)主题无催化活性的rna指导的核酸酶(例如，dcas9蛋白)，或编码其的载体(包含编码其的可表达mrna)；和任选地，(c)连接至可检测分子的一个或多个主题rbp结构域(例如，puf结构域)，或编码其的载体(包含编码其的可表达mrna)。
[0110]
在一些实施方式中，可以由相同载体编码(a)-(c)的一个或多个。
[0111]
在一些实施方式中，试剂盒还包含有助于将(a)-(c)的任何一个引入宿主细胞的一种或多种缓冲液或试剂，如用于转化、转染或感染的试剂。
[0112]
例如，主题试剂盒还可以包含一种或多种其他试剂，其中此类其他试剂可以选自：缓冲液；洗涤缓冲液；对照试剂；对照表达载体或rna多核苷酸；用于体外生产rna指导的核酸酶(例如，dcas9)或来自dna的rbp结构域构建体的试剂，等等。
[0113]
主题试剂盒的组分可以在单独容器中；或者可以组合在单一容器中。
[0114]
除了上述组分以外，主题试剂盒还可以包含使用该试剂盒的组分来实施主题方法的说明书。实施主题方法的说明书通常记录在适宜的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材，如纸或塑料等上。这样，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，试剂盒容器或其组件的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方式中，说明书以电子存储数据文件的形式存在于适宜的计算机刻度存储介质，例如，cd-rom、软盘、闪存驱动器等上。在另外其他实施方式中，实际的说明书不在试剂盒中，而是以从远程来源获取说明书的方式(例如，通过互联网)提供。该实施方式的实例是试剂盒，其包括网址，可以在该网址查看说明书和/或从该网址下载说明书。与说明书一样，将用于获得说明书的方法记录在适宜基材上。
[0115]
实施例
[0116]
实施例1：可以将一个grna用于对一个对非重复基因座成像
[0117]
为了显示casilio在非重复基因组基因座成像中的用途，靶向3号染色体上的muc4基因(图1a)。使用10个grna的混合物，每个grna都靶向5kb区域内的独特非重复基因座，与人骨肉瘤u2os细胞中外显子2的重复区域e3的指导物共同标记被显示(图1b)。将对非重复基因座成像所需的grna数量缩小到一个grna，观察到单个基因座#72处的荧光灶，并通过与重复区域e3的重叠确认(图1c-1d，图5)。延时成像显示共标记长达15小时(图6)。此外，显示了与重复区域e3共标记的单个基因座#33(图1e-1f，图7)。
[0118]
实施例2：针对每个基因座可以使用一个grna标记多个非重复基因座
[0119]
测试两个相距≤5kb的非重复基因座是否可以同时由casilio用两种颜色标记，muc4基因的每个基因座使用一个grna(图2a)。八对非重复基因座显示共标记(图2b-2h)。荧光蛋白clover和mruby2的使用可在两个靶点之间互换。dcas9和两个非重复grna由质粒表达。为了证明非重复基因座的casilio标记可以应用于其他基因座，靶向12号染色体上的cistr-act基因(图8a)。对u2os细胞中相距1.2kb的两个基因座中的每一个使用一个grna，证明了共标记(图8b)。此前仅使用grna混合物检测muc4(15)和cistr-act(19)基因座。
[0120]
实施例3：可以在与锚定非重复基因座越来越远的距离标记多个非重复基因座
[0121]
为了进一步验证和研究这种方法的分辨率，将grna设计为靶向与3号染色体上的非重复单个基因座#33距离越来越远的非重复基因座(图3a)。图像中对基因座对的测量显示，与锚定#33的8kb平均分隔为0.14μm(图3b-3c)。随着基因组靶距离的增加，平均测量距离增加(图3b，3d-3j)。基因座对显示与锚定#33平均分隔针对14kb为0.16μm、针对19kb为0.29μm、针对24kb为0.51μm、针对28kb为1.19μm、针对44kb为1.21μm、针对58.5kb为1.66μm和针对74kb为1.74μm(图3b，3d-3j)。这支持了本文所述的早期结果，其中在最近点相距21kb的非重复基因座#72和重复区域e3中可见共标记(图1c-1d，图5)。其还支持本文所述的早期结果，其中在最近点相距24kb的非重复基因座#33和重复区域e3中可见共标记(图1e-1f，图7)。每个平均对之间每kb的距离是一致的：针对8kb为0.018μm/kb、针对14kb为0.012μm/kb、针对19kb为0.015μm/kb、针对24kb为0.021μm/kb、针对28kb为0.043μm/kb、针对44kb为0.028μm/kb、针对58.5kb为0.028μm/kb和针对74kb为0.024μm/kb。
[0122]
实施例4：染色质相互作用的casilio活细胞成像
[0123]
为测试casilio是否可用于研究活细胞中染色质相互作用的时间动态，我们从已发表的cohesin(rad21)chia-pet数据集(encsr110joo，michael snyder实验室)中选择了两个染色质相互作用，基因组分隔为50kb和362kb，并使用chia-pet2、jackie和cas-offinder的组合为每个相互作用对设计了一对单拷贝grna{li,2017#24；zhu,2020#25；bae,2014#26}(图9a-9g)。用双色casilio探针对转染的arpe-19细胞的活细胞显微镜检查显示在第二个时间尺度上具有高度动态的染色质相互作用(图9b-9g)，表明casilio具有以高空间和时间分辨率对非重复序列元件的成对相互作用进行成像的能力。
[0124]
实施例5：五个连续基因座的casilio活细胞成像
[0125]
虽然对非编码元件(如增强子和启动子)的特定相互作用进行成像将提供有关基因调控的大量信息，但可视化基因组区域的连续片段将告知我们结构折叠动力学并阐明染色质环形成的过程。鉴于casilio对grna的要求较低，允许使用一个sgrna对每个非重复基因座进行成像，我们接下来探索了同时对多个非重复基因座成像的可能性，特别是用于跟踪连续基因组区域的结构。我们将这种在一段基因组dna上部署连续casilio探针的技术称为“具有casilio发射信号序列的可编程结构成像”——pisces。为了减少用于转染的质粒数量，我们首先构建了一个质粒，其具有五个grna阵列，靶向位置0、28kb、44kb、58.5kb和74kb，交替使用15xpbsc或15xpbs9r支架(图4a)。在使用五聚体grna阵列转染的hek293t细胞(图4b和4c)和arpe-19细胞(图4d和4e)中观察到了五个聚集的荧光灶(三个绿色加上两个洋红色)。这些结果表明使用双色代码对casilio成像探针序列进行编码，以阐明活细胞中》70kb基因组区域的动态折叠。
[0126]
在这项研究中，我们提出了一种基于crispr/cas的非重复基因组基因座的活细胞荧光成像方法，该方法具有低grna要求(1个grna/位点)和高时空分辨率，在第二个时间尺度上允许《28kb的分辨率。我们应用casilio来可视化原生未修饰染色体中两对凝聚(cohesion)结合元件的相互作用。使用两种荧光蛋白(pisces)的二进制代码，我们表明可以随着时间的推移对连续的dna片段的折叠进行成像。这些工具揭示了染色质折叠和相互作用的高度异质性和动态性，进一步支持了研究具有高时空分辨率的4d核组的需要。与之前发表的基于crispr的方法相比，grna需求的减少不仅将显著降低应用活细胞成像研究难以转染细胞中染色质相互作用的技术挑战，而且还将简化未来全基因组成像grna文库的设
计。
[0127]
材料和方法
[0128]
克隆
[0129]
指导序列受到人u6启动子的控制。通过bbsi将其克隆到grna-pbs表达载体pac1372-px-grna-15xpbsa(addgene#71889)或pac1373-px-grna-25xpbsa(addgene#71890)或pac1430-px-grna-15xpbsc(addgene#71930)中。此前描述了dcas9表达质粒pac1445-pmax-dcas9(addgene#73169)。使用表达载体pac1446(clover_pufa)(addgene#73688)、pac1447(clover_pufc)(addgene#73689)和pac1448(mruby2_pufa)(addgene#73690)生产具有puf rna结合结构域的clover和mruby2。
[0130]
细胞培养
[0131]
将人骨肉瘤u2os细胞(htb-96
tm
)和人胚胎肾hek293t细胞(crl-3216
tm
)在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)(sigma)中培养，培养基中含有10％胎牛血清(lonza)、4％谷氨酰胺(gibco)、1％丙酮酸钠(gibco)和青霉素-链霉素(gibco)。将人视网膜色素上皮arpe-19细胞(crl-2302
tm
)在dmem/f12(gibco)中培养，培养基中含有10％胎牛血清(lonza)和1％青霉素-链霉素(gibco)。培养箱条件为加湿下37℃和5％co2。通过从lenti-dcas9-blast质粒制备的慢病毒转导细胞，然后进行blast选择，生成表达组成型dcas9的细胞系。
[0132]
使用质粒dna转染
[0133]
在转染前24小时，在35mm 4-室cellview细胞培养皿(greiner bio-one)中，以55,000-130,000个细胞/室的密度接种u2os/dcas9细胞。使用0.5-1.2μl attractene(qiagen)或1μl lipofectamine 3000(invitrogen)，用75-300ng含有15个pumilio结合位点(pbs)的sgrna质粒dna、10-25ng clover-puf融合质粒dna和15-25ng mruby2-puf融合质粒转染细胞。在转染后24小时更换培养基。
[0134]
在转染前18-19小时，在35mm 4-室cellview细胞培养皿(greiner bio-one)中，以200,000-225,000个细胞/室的密度接种hek293t/dcas9细胞。使用0.75μl lipofectamine 3000(invitrogen)，用50-300ng sgrna-15xpbs质粒dna、5-10ng clover-puf融合质粒dna和40-75ng mruby2-puf融合质粒dna转染细胞。
[0135]
在转染前6-28小时，在35mm 4-室cellview细胞培养皿(greiner bio-one)中，以50,000-110,000个细胞/室的密度接种arpe-19/dcas9细胞。使用1.5-1.7μl lipofectamine ltx(invitrogen)，用200-600ng sgrna-15xpbs质粒、和5-40ng clover-pum融合质粒dna和30-700ng puf-mruby2融合质粒dna转染细胞。在转染后24小时更换培养基。
[0136]
使用质粒dna、dcas9蛋白和ivt grna的转染
[0137]
在转染前一天，在35mm 4-室cellview细胞培养皿(greiner bio-one)中，以80,000-120,000个细胞/室的密度接种细胞。使用1μl lipofectamine 3000(invitrogen)，用10-15ng puf-荧光融合质粒dna转染u2os细胞。随后立即使用lipofectamine crisprmax(invitrogen)，用500ng alt-r s.p.dcas9蛋白v3(idt)和130ng含有15个puf结合位点的grna转染细胞。
[0138]
核染色
[0139]
成像之前，用细胞培养基中制备的0.5-1.0μg/ml hoechst将细胞染色30-60分钟，然后使用培养基洗涤两次。
[0140]
共聚焦显微镜
[0141]
在转染后48-72小时进行成像。使用dragonfly高速共聚焦平台505(andor)获取图像，使用zyla scmos相机和leica hc pl apo63x/1.47na oil corr tirf物镜，安装在配备活细胞环境室(okolab)的leica dmi8倒置显微镜上，加湿37℃和5％co2。成像模式是共聚焦40μm。使用200mw固态405nm激光器和450/50nm bp发射滤光片获得hoechst图像。使用150mw固态488nm激光器和525/50nm bp发射滤光片获得clover图像。使用150mw固态561nm激光器和620/60nm bp发射滤光片获得mruby2图像。以0.13-1.0μm步长获得覆盖整个细胞核的z系列。对于延时成像，z系列以0.3-4.1μm的步长获得。图像是z系列的最大强度投影。
[0142]
图像处理
[0143]
使用fusion软件耐用(迭代)反卷积算法处理多个非重复序列位点的原始4d图像，预锐化滤波器为50，去噪滤波器尺寸为0.7，迭代次数为24。
[0144]
图像分析
[0145]
将imaris(bitplane)图像分析软件用于测量点距离。使用以0.19μm或0.5μm步长获得的z-系列。对于每个通道，根据3d体积中的最大强度对点进行分割。将测量点设置为与点对象的中心相交。将线模式设置为对，从一个通道中的点到另一个通道中最近的点测量3d体积中基因座对之间的距离。
[0146]
序列表
[0147]
[0148]
[0149][0150]
参考文献
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[0172]
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用的方式并入每一个所引用的主题，在一些情况下，该主题可涵盖整个文件。
[0173]
在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”，除非有明确相反指示，否则应理解为“至少一个”。
[0174]
还应当理解的是，除非有明确的相反指示，否则在本文要求保护的任何包括一个以上步骤或动作的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于记载所述方法的步骤或动作的顺序。
[0175]
在上述权利要求以及说明书中，所有过渡短语，如“包含/包括(comprising)”、“包含/包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“包含(containing)”、“涉及(involving)”、“持有(holding)”、“包含/包括(composed of)”等应被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由
……
组成(consisting of)”和“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”应分别为封闭或半封闭过渡短语。
[0176]
在数值之前的术语“约”和“基本上”是指所列举数值的
±
10％。
[0177]
在提供数值范围的情况下，该范围的上限和下限之间的每个值在本文中被具体考虑和描述。