一种复合菌剂及其在拮抗水稻病菌中的应用

1.本发明属于农业病害防治领域，具体涉及一种复合菌剂及其在拮抗水稻病菌中的应用。


背景技术：

2.水稻是世界上最重要的粮食作物。水稻常见的病菌对水稻品质以及安全有着巨大影响。水稻白叶枯病是由稻生黄单胞菌水稻致病变种引起的，是细菌植物病原体，会影响水稻的产量和品质。当前，仅有少数水稻品种对该病具有抗性，而且品种也不能抵抗多种病害。此外还有一些常见病菌例如条斑病对水稻的质量以及安全影响深重。
3.目前，防治病菌的主要措施包括选育抗病品种、生物防治和化学药剂防治。化学药剂具有防效高、防治低、操作方便等优点，是防治水稻病的有效方法，但也存在病原菌抗药性、农田疾病、环境污染等问题。植物病原物在生长发育以及致病过程中均受到来自于寄主植物、环境条件的影响，利用有益微生物来控制病害发生发展的方法称之为植物病害生物防治，而这些有益微生物则称为植物病害生防菌。生物防治因其成本低、来源广、对环境友并可获得长期效益等特点，成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点。筛选和构建具有综合优良性能的生防菌株、开展生防菌剂研发已成为植物病害生物防治的重要发展方向。随着人们生活增长逐步提高方向，意识不断，生物防治已成为植物病害防治研究的一个重点。


技术实现要素：

4.本发明的目的是抑制水稻病菌，如水稻白叶枯病菌、水稻条斑病菌。
5.本发明首先保护一种复合菌剂，由链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3、链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1、链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1和链霉菌(streptomyces sp.)f-6组成；所述复合菌剂的功能可为抑制水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌；
6.链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.22839；
7.链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.22840；
8.链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.22837；
9.链霉菌(streptomyces sp.)f-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.22838。
10.链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3cgmcc no.22839简称链霉菌iii-2-3。
11.链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1cgmcc no.22840简称链霉菌iv-1-1。
12.链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1cgmcc no.22837简称链霉菌v-1-1。
13.链霉菌(streptomyces sp.)f-6cgmcc no.22838简称为链霉菌f-6。
14.上述复合菌剂中，链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3、链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1、链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1和链霉菌(streptomyces sp.)f-6的活菌数比例具体可为2:1:2:3。
15.上述任一所述的复合菌剂中，链霉菌的活菌数可为2
×
108cfu/ml以上。
16.上述任一所述的复合菌剂中，链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3、链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1、链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1和链霉菌(streptomyces sp.)f-6的活菌数比例可为(0.2-0.6)
×
108cfu/ml：(0.2-0.6)
×
108cfu/ml：(0.2-0.6)
×
108cfu/ml：0.8
×
108cfu/ml(如0.2
×
108cfu/ml：0.2
×
108cfu/ml：0.2
×
108cfu/ml：0.8
×
108cfu/ml、0.4
×
108cfu/ml：0.4
×
108cfu/ml：0.4
×
108cfu/ml：0.8
×
108cfu/ml或0.6
×
108cfu/ml：0.6
×
108cfu/ml：0.6
×
108cfu/ml：0.8
×
108cfu/ml)。
17.上述任一所述的复合菌剂中，链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3、链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1、链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1和链霉菌(streptomyces sp.)f-6均可以菌液的方式加入。所述菌液可为向菌剂液体培养基中接种链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3、链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1、链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1或链霉菌(streptomyces sp.)f-6培养获得。所述菌剂液体培养基的溶质及其浓度可为可溶性淀粉18-22g、黄豆饼粉0.8-1.2g、氯化钠0.4-0.6g、硫酸镁0.4-0.6g、磷酸氢二钾0.4-0.6g和硫酸亚铁0.008-0.012g，溶剂可为水，ph值可为7.2-7.4。
18.本发明还保护上述任一所述复合菌剂的应用，可为a1)-a4)中的至少一种：
19.a1)抑制水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌；
20.a2)制备用于抑制水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌的产品；
21.a3)防治水稻白叶枯病菌引起的病害和/或水稻条斑病菌引起的病害；
22.a4)制备用于防治水稻白叶枯病菌引起的病害和/或水稻条斑病菌引起的病害的产品。
23.上述应用中，所述水稻白叶枯病菌引起的病害可为水稻白叶枯病。所述水稻条斑病菌引起的病害可为水稻细菌性条斑病。
24.本发明还保护一种拮抗水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌的方法，可为向水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌中加入上述任一所述复合菌剂，从而抑制水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌。
25.本发明还保护一种防治水稻白叶枯病菌引起的病害和/或水稻条斑病菌引起的病害的方法，为向水稻白叶枯病菌和/或水稻条斑病菌中加入上述任一所述复合菌剂，从而防治水稻白叶枯病菌引起的病害和/或水稻条斑病菌引起的病害。
26.上述任一所述水稻白叶枯病菌引起的病害可为水稻白叶枯病。
27.上述任一所述水稻条斑病菌引起的病害可为水稻细菌性条斑病。
28.实验证明，本发明提供的复合菌剂可抑制水稻白叶枯病菌、水稻条斑病菌，可用于防治水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病。本发明具有重要的应用价值。
29.保藏说明
30.菌种名称：链霉菌
31.拉丁名：streptomyces sp.
32.菌株编号：iii-2-3
33.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
34.保藏机构简称：cgmcc
35.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
36.保藏日期：2021年07月07日
37.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22839
38.菌种名称：链霉菌
39.拉丁名：streptomyces sp.
40.菌株编号：iv-1-1
41.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
42.保藏机构简称：cgmcc
43.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
44.保藏日期：2021年07月07日
45.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22840
46.菌种名称：链霉菌
47.拉丁名：streptomyces sp.
48.菌株编号：v-1-1
49.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
50.保藏机构简称：cgmcc
51.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
52.保藏日期：2021年07月07日
53.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22837
54.菌种名称：链霉菌
55.拉丁名：streptomyces sp.
56.菌株编号：f-6
57.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
58.保藏机构简称：cgmcc
59.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
60.保藏日期：2021年07月07日
61.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22838
附图说明
62.图1为链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6的菌落的生长状态。
63.图2为链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6两两之间的拮抗效果。
具体实施方式
64.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术
人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
65.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
66.mh肉汤液体培养基为青岛高科园海博生物技术有限公司的产品，产品编号为hb6231)。
67.mh肉汤固体培养基：将牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1.5g和酸水解酪蛋白17.5g溶于适量蒸馏水，之后加入琼脂20g(北京博奥拓达科技有限公司，货号：a6190)，用蒸馏水定容至1l，121℃灭菌15min。
68.高氏1号液体培养基为青岛高科园海博生物技术有限公司的产品，产品编号为hb8550-1。
69.高氏1号固体培养基：将可溶性淀粉20g、kno31 g、k2hpo40.5 g、mgso4·
7h2o 0.5g、nacl 0.5g和feso4·
7h2o 0.01g溶于适量蒸馏水，之后加入琼脂20g，用蒸馏水定容至1l，调节ph值至7.4-7.6，121℃灭菌15min。
70.菌剂液体培养基：将可溶性淀粉20g、黄豆饼粉1g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾0.5g和硫酸亚铁0.01g溶于适量水，然后用水定容至1l，调节ph值至7.2-7.4；121℃高压灭菌20min。
71.水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae)和水稻条斑病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzicola)均由宁夏医科大学微生物与生化药学实验室提供。
72.下述实施例中的土壤样品均采自宁夏回族自治区西夏区枸杞研究所。
73.实施例1、链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3cgmcc no.22839的分离、鉴定和保藏
74.一、分离
75.1、在9ml无菌水中加入1g土壤样品和适量玻璃珠，振荡10min，静置30s，制成土壤原液(此时稀释度记为10-1
)。吸取1ml土壤原液的上清液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀(此时稀释度为10-2
)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成稀释液(稀释度为10-4
)。
76.2、用移液枪分别吸取100μl不同稀释度的稀释液均匀涂布在高氏1号固体培养基上，28℃培养5-7d，观察菌落的生长状态。
77.3、完成步骤2后，分别将各个菌落接种至高氏1号液体培养基，培养，获得相应的菌液。
78.4、将水稻条斑病菌接种于mh肉汤固体培养基，37℃静置培养24h；然后向所述mh肉汤固体培养基上加入0.2ml无菌水，用无菌接种铲刮取水稻条斑病菌，获得水稻条斑病菌菌悬液(水稻条斑病菌的浓度约为108cfu/ml)。
79.5、将50μl步骤4得到的水稻条斑病菌菌悬液均匀涂布在mh肉汤固体培养基，放置滤纸片，在每个滤纸片上分别滴加10μl步骤3得到的菌液，28℃培养5-7d。观察可以形成抑菌圈的菌落。可以形成抑菌圈的菌落在高氏1号固体培养基进行菌种纯化。
80.将筛选到的一株细菌命名为细菌iii-2-3。
81.细菌iii-2-3的菌落的生长状态见图1中左上。
82.二、分子鉴定
83.细菌iii-2-3的16s rdna如seq id no:1所示。
84.将seq id no:1所示的序列进行同源性比对分析，挑选同源性高的菌株和细菌iii-2-3进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，最终确定细菌iii-2-3的属种。
85.结果表明，细菌iii-2-3与链霉菌(streptomyces sp.)遗传距离最近。因此，细菌iii-2-3被鉴定为链霉菌(streptomyces sp.)。
86.三、保藏
87.步骤一分离的细菌iii-2-3已于2021年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22839。细菌iii-2-3的全称为链霉菌(streptomyces sp.)iii-2-3cgmcc no.22839，简称为链霉菌iii-2-3。
88.实施例2、链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1cgmcc no.22840的分离、鉴定和保藏
89.一、分离
90.1、在9ml无菌水中加入1g土壤样品和适量玻璃珠，振荡10min，静置30s，制成土壤原液(此时稀释度记为10-1
)。吸取1ml土壤原液的上清液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀(此时稀释度为10-2
)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成稀释液(稀释度为10-4
)。
91.2、用移液枪分别吸取100μl不同稀释度的稀释液均匀涂布在高氏1号固体培养基上，28℃培养5-7d，观察菌落的生长状态。
92.3、完成步骤2后，分别将各个菌落接种至高氏1号液体培养基，培养，获得相应的菌液。
93.4、将水稻条斑病菌接种于mh肉汤固体培养基，37℃静置培养24h；然后向所述mh肉汤固体培养基上加入0.2ml无菌水，用无菌接种铲刮取水稻条斑病菌，获得水稻条斑病菌菌悬液(水稻条斑病菌的浓度约为108cfu/ml)。
94.5、将50μl步骤4得到的水稻条斑病菌菌悬液均匀涂布在mh肉汤固体培养基，放置滤纸片，在每个滤纸片上分别滴加10μl步骤3得到的菌液，28℃培养5-7d。观察可以形成抑菌圈的菌落。可以形成抑菌圈的菌落在高氏1号固体培养基进行菌种纯化。
95.将筛选到的一株细菌命名为细菌iv-1-1。
96.细菌iv-1-1的菌落的生长状态见图1中右上。
97.二、分子鉴定
98.细菌iv-1-1的16s rdna如seq id no:2所示。
99.将seq id no:2所示的序列进行同源性比对分析，挑选同源性高的菌株和细菌iv-1-1进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，最终确定细菌iv-1-1的属种。
100.结果表明，细菌iv-1-1与链霉菌(streptomyces sp.)遗传距离最近。因此，细菌iv-1-1被鉴定为链霉菌(streptomyces sp.)。
101.三、保藏
102.步骤一分离的细菌iv-1-1已于2021年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22840。细菌iv-1-1的全称为链霉菌(streptomyces sp.)iv-1-1cgmcc no.22840，简称为链霉菌iv-1-1。
103.实施例3、链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1cgmcc no.22837的分离、鉴定和保藏
104.一、分离
105.1、在9ml无菌水中加入1g土壤样品和适量玻璃珠，振荡10min，静置30s，制成土壤原液(此时稀释度记为10-1
)。吸取1ml土壤原液的上清液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀(此时稀释度为10-2
)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成稀释液(稀释度为10-4
)。
106.2、用移液枪分别吸取100μl不同稀释度的稀释液均匀涂布在高氏1号固体培养基上，28℃培养5-7d，观察菌落的生长状态。
107.3、完成步骤2后，分别将各个菌落接种至高氏1号液体培养基，培养，获得相应的菌液。
108.4、将水稻条斑病菌接种于mh肉汤固体培养基，37℃静置培养24h；然后向所述mh肉汤固体培养基上加入0.2ml无菌水，用无菌接种铲刮取水稻条斑病菌，获得水稻条斑病菌菌悬液(水稻条斑病菌的浓度约为108cfu/ml)。
109.5、将50μl步骤4得到的水稻条斑病菌菌悬液均匀涂布在mh肉汤固体培养基，放置滤纸片，在每个滤纸片上分别滴加10μl步骤3得到的菌液，28℃培养5-7d。观察可以形成抑菌圈的菌落。可以形成抑菌圈的菌落在高氏1号固体培养基进行菌种纯化。
110.将筛选到的一株细菌命名为细菌v-1-1。
111.细菌v-1-1的菌落的生长状态见图1中左下。
112.二、分子鉴定
113.细菌v-1-1的16s rdna如seq id no:3所示。
114.将seq id no:3所示的序列进行同源性比对分析，挑选同源性高的菌株和细菌v-1-1进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，最终确定细菌v-1-1的属种。
115.结果表明，细菌v-1-1与链霉菌(streptomyces sp.)遗传距离最近。因此，细菌v-1-1被鉴定为链霉菌(streptomyces sp.)。
116.三、保藏
117.步骤一分离的细菌v-1-1已于2021年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22837。细菌v-1-1的全称为链霉菌(streptomyces sp.)v-1-1cgmcc no.22837，简称为链霉菌v-1-1。
118.实施例4、链霉菌(streptomyces sp.)f-6cgmcc no.22838的分离、鉴定和保藏
119.一、分离
120.1、在9ml无菌水中加入1g土壤样品和适量玻璃珠，振荡10min，静置30s，制成土壤原液(此时稀释度记为10-1
)。吸取1ml土壤原液的上清液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀(此时稀释度为10-2
)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成稀释液(稀释度为10-4
)。
121.2、用移液枪分别吸取100μl不同稀释度的稀释液均匀涂布在高氏1号固体培养基上，28℃培养5-7d，观察菌落的生长状态。
122.3、完成步骤2后，分别将各个菌落接种至高氏1号液体培养基，培养，获得相应的菌液。
123.4、将水稻条斑病菌接种于mh肉汤固体培养基，37℃静置培养24h；然后向所述mh肉汤固体培养基上加入0.2ml无菌水，用无菌接种铲刮取水稻条斑病菌，获得水稻条斑病菌菌悬液(水稻条斑病菌的浓度约为108cfu/ml)。
124.5、将50μl步骤4得到的水稻条斑病菌菌悬液均匀涂布在mh肉汤固体培养基，放置滤纸片，在每个滤纸片上分别滴加10μl步骤3得到的菌液，28℃培养5-7d。观察可以形成抑菌圈的菌落。可以形成抑菌圈的菌落在高氏1号固体培养基进行菌种纯化。
125.将筛选到的一株细菌命名为细菌f-6。
126.细菌f-6的菌落的生长状态见图1中右下。
127.二、分子鉴定
128.细菌f-6的16s rdna如seq id no:4所示。
129.将seq id no:4所示的序列进行同源性比对分析，挑选同源性高的菌株和细菌f-6进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，最终确定细菌f-6的属种。
130.结果表明，细菌f-6与链霉菌(streptomyces sp.)遗传距离最近。因此，细菌f-6被鉴定为链霉菌(streptomyces sp.)。
131.三、保藏
132.步骤一分离的细菌f-6已于2021年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22838。细菌f-6的全称为链霉菌(streptomyces sp.)f-6cgmcc no.22838，简称为链霉菌f-6。
133.实施例5、微生物液体菌剂的制备
134.一、链霉菌菌剂的制备
135.1、链霉菌iii-2-3菌剂的制备
136.将链霉菌iii-2-3单菌落接种至150ml菌剂液体培养基，28℃、180r/min培养5d；之后用麦氏比浊法调整，得到链霉菌iii-2-3浓度为108cfu/ml的链霉菌iii-2-3菌剂。
137.2、链霉菌iv-1-1菌剂的制备
138.将链霉菌iv-1-1单菌落接种至150ml菌剂液体培养基，28℃、180r/min培养5d；之后用麦氏比浊法调整，得到链霉菌iv-1-1浓度为108cfu/ml的链霉菌iv-1-1菌剂。
139.3、链霉菌v-1-1菌剂的制备
140.将链霉菌v-1-1单菌落接种至150ml菌剂液体培养基，28℃、180r/min培养5d；之后用麦氏比浊法调整，得到链霉菌v-1-1浓度为108cfu/ml的链霉菌v-1-1菌剂。
141.4、链霉菌f-6菌剂的制备
142.将链霉菌f-6单菌落接种至150ml菌剂液体培养基，28℃、180r/min培养5d；之后用麦氏比浊法调整，得到链霉菌f-6浓度为108cfu/ml的链霉菌f-6菌剂。
143.二、微生物液体菌剂的制备
144.制备1l微生物液体菌剂甲、1l微生物液体菌剂乙和1l微生物液体菌剂丙。
145.微生物液体菌剂甲中，链霉菌iii-2-3菌剂、链霉菌iv-1-1菌剂、链霉菌v-1-1菌剂和链霉菌f-6菌剂的体积比为2:1:2:3。
146.微生物液体菌剂乙中，链霉菌iii-2-3菌剂、链霉菌iv-1-1菌剂、链霉菌v-1-1菌剂和链霉菌f-6菌剂的体积比为1:3:3:3。
147.微生物液体菌剂丙中，链霉菌iii-2-3菌剂、链霉菌iv-1-1菌剂、链霉菌v-1-1菌剂和链霉菌f-6菌剂的体积比为3:1:3:2。
148.实施例6、链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6的拮抗性检测
149.分别将链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6中的任意两个两两交叉划线接种到高氏1号固体培养基，28℃培养5d，观察菌种间交叉点生长情况。
150.结果见图2。结果表明，链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6中的任意两个生长良好，互不拮抗。由此可见，链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6四个菌株可以共存，互不拮抗，可以混合培养。
151.实施例7、分别检测链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6的发酵产物对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌的最低抑菌浓度
152.1、将链霉菌(链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1或链霉菌f-6)单菌落接种至5ml高氏1号液体培养基，28℃、180r/min培养10d，过滤，得到链霉菌发酵产物。
153.2、取96孔板(8行，每行12个孔)，每行的第1个孔加入180μl mh肉汤液体培养基，第2个孔—第11个孔加入100μl mh肉汤液体培养基，第12个孔加入200μl mh肉汤液体培养基。
154.3、完成步骤2后，向第1个孔加入20μl链霉菌发酵产物，混匀，用移液枪吸取100μl加至第2个孔；将第2个孔中液体混匀，用移液枪吸取100μl加至第3个孔；以此类推，直至第10个孔。将第10个孔中液体混匀，用移液枪吸取100μl，丢弃。
155.此时第1个孔—第11个孔中的液体均为100μl。第12个孔中的液体为200μl。
156.其中第1个孔—第10个孔中的液体含有不同浓度的链霉菌发酵产物。经检测第1个孔—第10个孔中链霉菌发酵产物的浓度依次为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39和0.19mg/ml。
157.4、完成步骤3后，向第1个孔—第11个孔中接种100μl待测菌(水稻白叶枯病菌或水稻条斑病菌)菌悬液，混匀，37℃培养24h，以小孔内完全抑制菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度，观察并记录结果。
158.待测菌菌悬液的制备方法为：将待测菌单菌落接种至5ml mh肉汤液体培养基，37℃、180r/min振荡培养24h，得到菌液；之后向1ml菌液中加入mh肉汤液体培养基进行稀释，得到待测菌菌悬液(待测菌的浓度约为106cfu/ml)。
159.检测结果见表1。结果表明，链霉菌iii-2-3发酵产物能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为12.50mg/ml，能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为12.50mg/ml；链霉菌iv-1-1发酵产物能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为25.00mg/ml，能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为100.00mg/ml；链霉菌v-1-1发酵产物能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为3.12mg/ml，能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为12.50mg/ml；链霉菌f-6发酵产物能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为3.12mg/ml，能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为3.12mg/ml。由此可见，链霉菌iii-2-3、链霉菌iv-1-1、链霉菌v-1-1和链霉菌f-6的发酵产
物均可以抑制水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌。
160.表1
[0161] 水稻条斑病菌水稻白叶枯病菌链霉菌iii-2-312.50mg/ml12.50mg/ml链霉菌iv-1-125.00mg/ml100.00mg/ml链霉菌v-1-13.12mg/ml12.50mg/ml链霉菌f-63.12mg/ml3.12mg/ml
[0162]
实施例8、实施例5制备的微生物液体菌剂对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌的最低抑菌浓度
[0163]
微生物液体菌剂为微生物液体菌剂甲、微生物液体菌剂乙或微生物液体菌剂丙。
[0164]
1、取96孔板(8行，每行12个孔)，每行的第1个孔加入180μlmh肉汤液体培养基，第2个孔—第11个孔加入100μl mh肉汤液体培养基，第12个孔加入200μl mh肉汤液体培养基。
[0165]
2、完成步骤1后，向第1个孔加入20μl微生物液体菌剂，混匀，用移液枪吸取100μl加至第2个孔；将第2个孔中液体混匀，用移液枪吸取100μl加至第3个孔；以此类推，直至第10个孔。将第10个孔中液体混匀，用移液枪吸取100μl，丢弃。
[0166]
此时第1个孔—第11个孔中的液体均为100μl。第12个孔中的液体为200μl。
[0167]
其中第1个孔—第10个孔中的液体含有不同浓度的微生物液体菌剂。经检测第1个孔—第10个孔中微生物液体菌剂的浓度依次为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020mg/ml。
[0168]
3、完成步骤2后，向第1个孔—第11个孔中接种100μl待测菌(水稻白叶枯病菌或水稻条斑病菌)菌悬液，混匀，37℃培养24h，以小孔内完全抑制菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。
[0169]
待测菌菌悬液的制备方法为：将待测菌单菌落接种至5mlmh肉汤液体培养基，37℃、180r/min振荡培养24h，得到菌液；之后向1ml菌液中加入mh肉汤液体培养基进行稀释，得到待测菌菌悬液(待测菌的浓度约为106cfu/ml)
[0170]
检测结果见表2。结果表明，微生物液体菌剂甲能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为0.625mg/ml，能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为0.625mg/ml；微生物液体菌剂乙能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为0.625mg/ml，能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为1.250mg/ml；微生物液态菌剂丙能够抑制水稻条斑病菌的最低浓度为1.250mg/ml,能够抑制水稻白叶枯病菌的最低浓度为2.500mg/ml。
[0171]
表2
[0172] 水稻条斑病菌水稻白叶枯病菌微生物液体菌剂甲0.625mg/ml0.625mg/ml微生物液体菌剂乙0.625mg/ml1.250mg/ml微生物液体菌剂丙1.250mg/ml2.500mg/ml
[0173]
因此，微生物液体菌剂甲、微生物液体菌剂乙和微生物液体菌剂丙均可以显著抑制水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌，其中微生物液体菌剂甲的抑制效果最佳。
[0174]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。