非重复基因组基因座的活细胞成像的制作方法

技术特征：
1.一种方法，其包括：(a)对活细胞成像，所述活细胞包含：无催化活性的核糖核酸(rna)指导的核酸酶；由单个独特指导rna(grna)结合的非重复基因组基因座，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列；和(b)在所述活细胞中检测所述puf结构域的所述可检测分子，所述puf结构域已结合至所述grna的所述puf结构域结合序列。2.一种方法，其包括：(a)对活细胞成像，所述活细胞包含：无催化活性的核糖核酸(rna)指导的核酸酶；多个非重复基因组基因座，其中每个非重复基因组基因座由单个独特指导rna(grna)结合，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座之一互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列；和(b)在所述活细胞中的多个非重复基因组基因座共同检测所述puf结构域的所述可检测分子，所述puf结构域已结合至所述grna的所述puf结构域结合序列。3.一种方法，其包括：(a)将活细胞与以下接触无催化活性的核糖核酸(rna)指导的核酸酶或编码rna指导的核酸酶的多核苷酸，多个指导rna(grna)、编码多个grna的多核苷酸或编码grna的多个多核苷酸，其中每个所述grna包含：(i)与在所述活性胞中单个非重复基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和与puf结构域连接的荧光蛋白或编码与puf结构域连接的荧光蛋白的多核苷酸，所述puf结构域结合每个所述grna的所述puf结构域结合序列；和(b)在所述活细胞中共同检测与puf结构域连接的所述荧光蛋白，所述puf结构域已结合至所述grna的所述puf结构域结合序列。4.一种用于对染色质结构成像的方法，其包括：在活细胞中使用以下标记第一非重复染色质锚定基因座：(a)单个独特指导rna(grna)，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和(b)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列；在所述活细胞中标记多个其他非重复染色质基因座，每个基因座标记有：(a)单个独特grna，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列，和(b)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列，其中所述多个其他非重复基因座位
于与所述锚定基因座越来越远的距离；和在一段时间内在所述活细胞中对所述可检测分子成像，从而在所述活细胞中对染色质结构成像。5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是1kb至5kb。6.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是1kb至200kb。7.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是10kb至200kb。8.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是至少1kb、至少5kb、至少10kb或至少20kb。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述共同检测包括对所述活细胞的延时成像。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可检测分子是荧光蛋白。11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述活细胞与至少两个puf结构域接触，每个puf结构域连接至不同可检测分子，任选地其中所述可检测分子是相对于彼此具有不同发射波长的荧光蛋白。12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中所述活细胞包含至少两个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。13.根据权利要求2-12中任一项所述的方法，其中所述活细胞包含至少五个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活细胞不包含grna的混合物。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的rna指导的核酸酶是dcas9核酸酶。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一个所述grna包含所述puf结构域结合序列的至少一个拷贝。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述非重复基因组基因座包含染色质。18.一种包含活细胞的体外组合物，所述活细胞包含：无催化活性的核糖核酸(rna)指导核酸酶；多个非重复基因组基因座，其中每个非重复基因座由单个独特指导rna(grna)结合，其中所述grna包含(i)与所述非重复基因组基因座之一互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)pumilio-fbf(puf)结构域结合序列，和与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述grna的所述puf结构域结合序列。19.根据权利要求18所述的组合物，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是1kb至5kb。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是1kb至200kb。21.根据权利要求18所述的组合物，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是10kb至200kb。22.根据权利要求18所述的组合物，其中在至少两个所述非重复基因组基因座之间的所述距离是至少1kb、至少5kb、至少10kb或至少20kb。23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可检测分子是荧光蛋白。24.根据权利要求2-10中任一项所述的组合物，其中所述活细胞包含至少两个puf结构域，每个puf结构域连接至不同可检测分子，任选地其中所述可检测分子是相对于彼此具有不同发射波长的荧光蛋白。25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述活细胞包含至少三个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述活细胞包含至少五个grna，其中每个所述grna包含(i)仅与在所述活细胞中的单个非重复基因组基因座互补的dna靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)puf结构域结合序列。27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述活细胞不包含grna的混合物。28.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述无催化活性的rna指导的核酸酶是dcas9核酸酶。29.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中至少一个所述grna包含所述puf结构域结合序列的至少一个拷贝。30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述非重复基因组基因座包含染色质。31.一种方法，其包括：(a)在活细胞中对多个非重复基因组基因座成像，其中每个非重复基因组基因座由单个独特指导rna(grna)结合，其中所述grna包含(i)与所述非重组基因组基因座互补的脱氧核糖核酸(dna)靶向序列，(ii)rna指导的核酸酶结合序列，和(iii)rna结合蛋白(rbp)结构域结合序列，和与rbp结构域连接的可检测分子，所述rbp结构域结合所述grna的所述rbp结构域结合序列；和(b)在所述活细胞中检测所述rbp结构域的所述可检测分子，所述rbp结构域已结合至所述grna的所述rbp结构域结合序列。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述非重复基因组基因座是染色质。33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述rna指导的核酸酶结合序列结合至dcas9核酸酶。34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述可检测分子是荧光蛋白。35.一种用于检测细胞中的染色体重排的方法，其包括：向活细胞递送以下：(a)无催化活性的rna指导的核酸酶，(b)第一单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在核酸酶切割位点附近和上游结合，(c)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第一grna的所述puf结构域结合序列，(d)第
二单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在核酸酶切割位点附近和下游结合，和(e)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第二grna的所述puf结构域结合序列，其中每个grna还包含rna指导的核酸酶结合序列和puf结构域结合序列；和在所述活细胞中对所述第一grna和所述第二grna之间的距离成像，以确定是否存在染色体重排。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述染色体重排是易位、倒位或重复。37.一种用于鉴定细胞中的基因异常的方法，其包括：向活细胞递送以下：(a)无催化活性的rna指导的核酸酶，(b)第一单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在基因异常附近和上游结合，(c)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第一grna的所述puf结构域结合序列，(d)第二单个独特grna，所述grna包含dna靶向序列，将该序列设计为在基因异常附近和下游结合，和(e)与puf结构域连接的可检测分子，所述puf结构域结合所述第二grna的所述puf结构域结合序列，其中每个grna还包含rna指导的核酸酶结合序列和puf结构域结合序列；在所述活细胞中对所述第一grna和所述第二grna之间的距离成像，以确定是否存在染色体重排。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述基因异常是染色体重排。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述染色体重排是易位、倒位或重复。

技术总结
本文提供了使用独特指导核糖核酸(gRNA)、RNA指导的核酸酶和可检测缀合物对非重复基因组基因座成像的方法。组基因座成像的方法。组基因座成像的方法。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：杰克逊实验室
技术研发日：2020.08.13
技术公布日：2022/5/31