烟草镉转运基因NtPLA1及应用的制作方法

烟草镉转运基因ntpla1及应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体来说，涉及烟草镉转运相关ntpla1基因及应用。


背景技术：

2.烟草具有较强的镉富集能力，烟草植株吸收过多的镉会增加烟气中的镉浓度而危害吸烟人群健康。此外，镉做为植物生长非必需元素之一，土壤中较高浓度的镉会影响烟草根系生长、叶绿体形成，进而影响其生物学产量和品质。植物中镉的积累涉及到镉的吸收、转运、分配等诸多过程，其调控网络及分子机制仍待进一步解析。
3.目前，烟草中发现的镉转运基因较匮乏，已报道的主要有nthma2/4，ntnramp5等少数几个，因此，发掘和鉴定新的烟草镉转运基因，进而通过基因编辑等手段获得低镉富集新品种，对保障烟叶安全性具有重要意义。
4.磷脂酶a(pla)是参与磷脂水解的一类重要的酶，其家族成员众多，plas在拟南芥、水稻等植物的生长发育，脂信号转导，以及胁迫响应方面发挥着重要作用。本发明提供了一个新的烟草镉转运相关pla基因及应用，为烟草镉积累分子机制研究及育种提供了新的靶标。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供烟草ntpla1基因及其编码的蛋白质。
6.本发明的另一目的是提供烟草ntpla1基因的应用。
7.本发明烟草ntpla1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，基因全长1239bp。
8.本发明提供的烟草ntpla1基因，其为编码如下蛋白质(a)的基因：
9.(a)由seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
10.本发明提供所述烟草ntpla1基因或突变该基因在降低植物镉离子富集中的应用。
11.本发明还提供所述烟草ntpla1基因或突变该基因的生物材料在植物育种中的应用。所述育种的目的为降低植物镉离子吸收和转运。
12.优选地，将所述烟草ntpla1基因进行突变，使烟草ntpla1基因产生突变以降低烟草植株对镉的富集能力，或通过杂交等方式获得携带ntpla1基因突变的材料。
13.本发明还提供用于扩增烟草ntpla1基因的特异性pcr引物对，所述引物对的核苷酸序列如seq id no:3和4所示。
14.本发明还提供一种降低植物镉离子吸收和转运的方法，所述方法为：
15.使烟草ntpla1基因发生突变，所述方法包括但不限于基因编辑、诱变、杂交。
16.本发明首次从烟草中克隆得到磷脂酶家族基因ntpla1，并通过酵母实验和基因编辑验证了该基因的生物学功能，将ntpla1基因转入镉敏感酵母突变株δycf后的重组酵母具有镉敏感特性，编辑所得突变体的镉含量相比野生型对照显著降低。因此，本发明提供的烟草ntpla1基因具有镉转运的功能。
附图说明
17.图1为本发明实施例1中酵母功能互补实验结果。其中，a：培养基中镉离子浓度为0μm，b：培养基中镉离子浓度为20μm。图中，δycf pyes2为阴性对照组(转入空载体)，δycf ntpla1为转入烟草ntpla1基因的重组酵母，δycf ntnramp5为阳性对照组(转入烟草ntnramp5基因)的重组酵母；从左到右依次为10倍稀释液、100倍、1000倍、10000倍稀释液在培养基上的生长结果。
具体实施方式
18.一、烟草ntpla1基因克隆
19.烟草k326播种后，温室培养至5～6片真叶时，取新鲜叶片使用axygen公司的植物总rna提取试剂盒提取总rna，使用takara公司反转录试剂盒进行反转录合成cdna。
20.以genbank数据库中的pla基因(登录号:xm_016598298.1)为参考序列，使用primer 5设计正向引物和反向引物。所述的正向引物核苷酸序列为seq no:3：5
’‑
atgggaaggttattattctt-3’，所述反向引物核苷酸序列为seq no:4：5
’‑
tcagttggtgtatcgaagct-3’。
21.以烟草
‘
k326’的cdna模板，使用neb公司的kod fx neo高保真酶进行烟草pla1基因扩增。反应体系为50μl：2
×
pcr buffer 25μl，dntps 10μl，kod fx neo 1μl，正向引物2μl，反向引物2μl，烟草cdna 2μl，dd h2o 8μl；
22.扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；60℃退火30s；68℃延伸30s；35个循环；72℃延伸15min；4℃保温。
23.利用胶回收试剂盒对pcr产物进行胶回收后，连入pgem-t载体，将连接产物转化大肠杆菌dh5α，接种于加有氨苄青霉素的lb平板上进行筛选培养获得阳性克隆。采用菌落pcr的方法来验证阳性克隆，菌落pcr的正向引物为seq no:5：5
’‑
gcttcgtgcataggatattca-3’，反向引物为seq no:6：5
’‑
aactttacacacattaacgg-3’。
24.菌落pcr的反应体系为20μl，包括premix ex taq10μl，正向引物1μl，反向引物1μl，dd h2o 7μl，菌液1μl。然后从已验证的阳性克隆中随机选取3个独立的阳性克隆送到生物公司进行测序，经测序得到烟草pla1基因的序列如seq id no:1所示。
25.二、烟草ntpla1基因酵母遗传转化及表型鉴定
26.1.酵母感受态制备
27.1)酵母菌株为δycf1(mata；his3δl；leu2δ0；lys2δ0；ura3δ0；ydrl35c::kan mx4)的镉敏感性菌株。挑酵母菌株(δycf)在ypda固体培养基上划板，30℃倒置培养，待菌生长至适宜大小。挑单菌落接种于含有3ml ypda液体培养基的离心管中，30℃，250rpm摇菌8
–
12小时。吸取5μl菌液转入含有50ml ypda液体培养基的250ml三角瓶中。30℃，250rpm继续摇16
–
20小时，期间测od值，od600达到0.15
–
0.3的时候停止摇菌。
28.2)室温下，700g离心5min收集菌体，弃上清，加入100ml ypda液体培养基重悬菌体。30℃，250rpm摇3
–
5小时至od600为0.4
–
0.5。取50ml菌液，700g离心5min收集菌体。加入30ml无菌超纯水，重悬菌体。700g离心5min收集菌体。弃上清，加入1.5ml 1.1xte/liac重悬菌体。
29.3)将菌液转至1.5ml离心管中，高速离心15s。弃上清，加入600ul 1.1xte/liac，重
悬菌体，获得酵母感受态细胞。
30.2.重组酵母表达载体构建及转化
31.1)将连接有实施案例1种所述的pal1基因的t载体与酵母表达载体pyes2分别进行smalⅰ和bamhⅰ双酶切，回收目的基因和表达载体pyes2，然后用连接酶连接。获得含有目的基因的重组表达载体ntpla1-pyes2，之后进行pcr扩增和测序验证，测序正确的质粒即重组酵母表达载体。
32.2)将6μl重组质粒、10μl变性的yeast maker宿主dna，加入预冷的离心管中(1.5ml)，混合均匀。加入100μl酵母感受态细胞和500μl peg/liac，轻轻混匀。置于30℃恒温箱孵化30min后加20μl dmso，轻柔混匀。
33.3)在42℃水浴锅中温浴15min。高速离心1min收集菌体。弃上清，加入1ml ypd plus液体培养基。30℃，150rpm震荡培养30min。高速离心1min收集菌体。弃上清，加入1ml 0.9％(w/v)nacl溶液重悬菌体。
34.4)涂板，30℃恒温箱倒置培养2-3天。
35.3.酵母镉胁迫表型鉴定
36.1)从酵母转化平板中挑单克隆至sd-ura培养基中，30℃180rpm过夜摇菌。
37.2)用2ml离心管收集菌液，每次1.5ml，12000rpm离心60s，收集两次，用无菌水洗菌体2-3次，离心，弃上清，加1ml无菌水，吸打混匀，取200μl测定od600的吸光值，测定三次重复。
38.3)按od600吸光值为10-1
、10-2
、10-3
和10-4
进行梯度稀释，在分别含有0μm和20μm镉的固体培养基上进行点样。
39.4)30℃倒置培养3-7天，观察拍照。
40.实施案例结果表明，转入空载的对照组酵母(δycf pyes2)，转入烟草ntpla1基因的重组酵母(δycf ntpla1)，转入烟草ntnramp5基因的阳性对照组酵母(δycf ntnramp5)，在不含镉的培养基上生长状态一致(图1a)，而在含镉的培养基上(图1b)，相比转入空载的对照组酵母(δycf pyes2)，转入烟草ntpla1基因的重组酵母(δycf ntpla1)和转入烟草ntnramp5基因的阳性对照组酵母(δycf ntnramp5)的生长受到明显抑制，证明烟草pla1基因具有镉吸收及转运功能。
41.三、烟草ntpla1基因编辑及镉含量测定
42.1)ntpla1基因的sgrna设计及载体构建
43.设计特异性sgrna为：ccattcaagttgtacaacctcca，将sgrna通过gateway的方法连接到载体上得到重组载体，获得重组crispr/cas9载体。
44.2)烟草遗传转化及突变检测
45.将构建的重组crispr/cas9载体通过热激转至农杆菌感受态gv3101，获得阳性克隆，通过烟草遗传转化实验将重组crispr/cas9载体转入栽培烟草k326中，在抗性培养基上长出的抗性芽转移到生根培养基中，待根长出后，洗去根部培养基，转移至烟草育苗基质中，放入人工气候室进行培养20天后提取基因组dna测序鉴定靶标序列的突变情况，经检测，pla-n株系的突变形式为：taactttgttagtgaccattca
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tacaacctccaat，野生型k326的序列为taactttgttagtgaccattcaagttgtacaacctccaat证明该株系发生了突变。
46.3)烟草镉含量测定
47.将编辑纯合株系pla-n和野生型k326同时播种，待幼苗长至6-8叶期移栽至水培装置中，采用1/2的horgland营养液培养2周后，使用含有30μm的cdcl2溶液进行处理，处理15天后分别进行取样，105度杀青15分钟，65度烘干至恒重后，采用gc-ms方法测定样品中镉含量。
48.结果表明，野生型对照k326的叶片镉含量为80.32mg/kg，而编辑株系叶片的镉含量为55.07mg/kg，烟草ntpla1基因的突变可显著降低烟草叶片镉含量。