一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法

1.本发明涉及猕猴桃基因工程技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法。


背景技术：

2.随着现代生物科技的不断发展，利用转基因手段对园艺作物进行遗传改良将成为重要的发展趋势。果树作物基因型高度杂合，童期长，造成传统的育种方式存在群体大，工作量大和耗时长等缺点。
3.在育种实践过程中，如何保持亲本优良性状且对个别劣质性状采用基因工程的手段加以修饰，快速选育出符合选育标准的优良品种成为育种家关注的热点问题。通过基因过表达和沉默表达技术对基因进行定向编辑是实现快速育种的重要手段之一。如何提高遗传转化效率成为基因编辑成功与否的关键因素。然而，研究表明，多年生木本植物普遍存在遗传转化效率低的棘手问题。
4.随着研究技术的发展，一些难转化的果树作物如葡萄、柑橘和苹果等转化效率已经得到显著提升。但猕猴桃的遗传转化效率仍然普遍较低(一般都在1％以下)，主要是因为猕猴桃的离体再生能力较差，转化体系还不健全，大大阻碍了转基因技术在猕猴桃上的应用。
5.遗传转化体系包括稳定转化和瞬时转化，稳定转化多见于组培苗植株，常用的方法为叶盘转化法，但该方法应用于猕猴桃上的转化效率仍较低，主要原因是猕猴桃属植物再生体系和遗传转化体系尚不完善，因此需要优化传统体系以及开发新的遗传转化体系。
6.下胚轴是具有一定胚性的营养器官，分裂分化比较旺盛，是比较好的遗传传话受体材料，在苹果、桃和番茄等园艺作物上已经被广泛使用，而在猕猴桃上尚未见报道。此外，瞬时转化也是验证基因功能常用的手段之一，由于获得的转基因植株需要渡过童期才可以开花结果，验证基因在果实发育中的功能比较漫长，因此，非常有必要建立一种有效的猕猴桃瞬时转化体系。
7.为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，该方法建立了稳定转化下胚轴体系和瞬时转化果实体系，利用该方法成功实现了稳定转化和果实瞬时转化；且该方法具备操作简单、周期短、转化率高等优点，能够建立一种高效猕猴桃遗传转化体系，有效改变猕猴桃遗传转化再生率普遍低下的现状。
9.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
10.一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，其步骤是：
11.所述猕猴桃转化的方法包括下胚轴稳定转化和果实瞬时转化；所述下胚轴稳定转
化的步骤如下：
12.s1、猕猴桃种子播种：将层积处理后的猕猴桃种子用75％酒精消毒1min，无菌水冲洗3次；然后用2％次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次；再将消毒后的猕猴桃种子播种于ms培养基中，放置于组培室中，待猕猴桃种子萌发生长；所述组培室中的温度为22～25℃，湿度为70％，光照周期为光照16h、黑暗8h；
13.s2、下胚轴去顶保湿：所述ms培养基中长出带有两片子叶的猕猴桃无菌苗后，用无菌手术刀在所述两片子叶的生长点下方切断，获得离体下胚轴；将所述离体下胚轴在培养箱中保湿预培养1～2d；
14.s3、遗传转化载体构建：构建35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅰ，通过无缝克隆技术将gus基因序列构建植物表达载体pri101上，35s启动子驱动其表达；
15.s4、农杆菌转化及侵染：通过所述35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅰ转化农杆菌感受态细胞ⅰ，获得转化成功的35s：gus农杆菌ⅰ；以gus基因作为指示标记，验证下胚轴稳定转化体系；
16.将所述35s：gus农杆菌ⅰ菌液进行离心，分离掉上清液部分，然后将剩余部分重悬，得到侵染用的菌液浓度od600值为0.6～1.0的农杆菌菌液ⅰ；取1～2μl所述农杆菌菌液ⅰ、6-ba和iba添加在所述离体下胚轴的断面处，所述6-ba的浓度为0.2～1.0mg/l，所述iba的浓度为0.2～1.0mg/l；并继续保湿培养直至长出叶片，所述保湿培养的时间为1个月，期间重复2～3次侵染；
17.s5、转基因植株鉴定：提取步骤s4所述叶片的dna和rna，分别在基因组和转录水平进行鉴定；并将所述叶片进行gus染色，在蛋白水平进行鉴定；
18.s6、稳定转化下胚轴体系建立：获得稳定转化的转化效率达到80％以上的猕猴桃。
19.进一步地：步骤s2中，所述离体下胚轴在培养箱中保湿预培养的时间为1d；步骤s4所述的6-ba的浓度为0.8mg/l，所述iba的浓度为0.2mg/l，农杆菌菌液浓度od600值为0.8，所述农杆菌感受态细胞采用gv3101，保湿培养期间重复侵染的次数为2次。
20.进一步地：步骤s4所述的农杆菌感受态为eha105或gv3101。
21.本发明还提供了一种农杆菌介导的猕猴桃果实瞬时转化的方法，所述果实瞬时转化的步骤是：
22.a.遗传转化载体构建：构建35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅱ；
23.b.农杆菌转化：通过所述35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅱ转化农杆菌感受态细胞ⅱ，获得转化成功的35s：gus农杆菌ⅱ；以gus基因作为指示标记，验证果实瞬时转化体系；制备得到菌液浓度od600值为0.4～1.0的农杆菌菌液ⅱ；
24.c.农杆菌菌液转入猕猴桃果实：将步骤b所述的农杆菌菌液ⅱ转入猕猴桃果实中，所述转入的方式为注射转入或抽真空转入，所述注射转入中注射果实菌液量为20μl、40μl或60μl；所述抽真空转入中的抽真空压强为0.06mpa、0.08mpa或者0.1mpa、抽真空时间为2～5min；
25.d.瞬时转化果实体系建立：在28℃条件下放置3～5d，获得瞬时转化果实，通过gus染色和酶活确定瞬时转化果实体系。
26.通过上述技术方案，农杆菌介导转化法具备操作简单、周期短、转化率高等优点，是有效的转基因方法；农杆菌侵染植物伤口进入细胞后，可将t-dna插入到植物基因组中，
并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代；建立猕猴桃遗传转化体系对于猕猴桃转基因以及育种实践具有重要意义；由于获得的转基因植株需要渡过童期才可以开花结果，验证基因在果实发育中的功能比较漫长，因此开发猕猴桃瞬时转化体系对于研究果实发育过程中的基因功能具有重要的现实意义。
27.综上所述，本发明具有以下有益效果：
28.1.该方法建立了稳定转化下胚轴体系和瞬时转化果实体系，利用该方法成功实现了稳定转化和果实瞬时转化。
29.2.该方法具备操作简单、周期短、转化率高等优点，能够建立一种高效猕猴桃遗传转化体系，有效改变猕猴桃遗传转化再生率普遍低下的现状。
附图说明
30.图1是本发明实施例1的猕猴桃下胚轴转化试验流程图；
31.图2是本发明实施例1猕猴桃下胚轴遗传转化转基因验证；
32.图3是本发明实施例1～13的农杆菌菌液及6-ba、iba激素浓度对下胚轴遗传转化效率的影响实验结果图；
33.图4是本发明实施例14和对比例2的猕猴桃果实瞬时转化gus染色图；
34.图5是本发明实施例14和对比例2的金果和徐香猕猴桃的遗传转化差异对比图；
35.图6是本发明实施例14至实施例21与对比例1的菌液及抽真空条件对猕猴桃果实瞬时转化效率的影响；
36.图7是本发明实施例22至实施例28的菌液及注射条件对猕猴桃果实瞬时转化效率的影响。
具体实施方式
37.下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：
38.实施例1：一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，下胚轴稳定转化的步骤如下：
39.s1、猕猴桃种子播种：将层积处理后的红阳猕猴桃种子用75％酒精消毒1min，无菌水冲洗3次；然后用2％次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次；再将消毒后的猕猴桃种子播种于ms培养基中，放置于组培室中，待猕猴桃种子萌发生长；组培室中的温度为22～25℃，湿度为70％，光照周期为光照16h、黑暗8h；
40.s2、下胚轴去顶保湿：ms培养基中长出带有两片子叶的猕猴桃无菌苗后，用手术刀在两片子叶的生长点下方切断，获得离体下胚轴；将离体下胚轴在培养箱中保湿预培养1d；
41.s3、遗传转化载体构建：构建35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅰ，通过无缝克隆技术将gus基因序列构建植物表达载体pri101上，35s启动子驱动其表达；
42.s4、农杆菌转化及侵染：通过35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅰ转化农杆菌感受态细胞ⅰgv3101，获得转化成功的35s：gus农杆菌ⅰ；以gus基因作为指示标记，验证下胚轴稳定转化体系；
43.将35s：gus农杆菌ⅰ菌液进行离心，分离掉上清液部分，然后将剩余部分重悬，得到侵染用的菌液浓度od600值为0.8的农杆菌菌液ⅰ；取2μl农杆菌菌液ⅰ、6-ba和iba添加在离体下胚轴的断面处，6-ba的浓度为0.8mg/l，iba的浓度为0.2mg/l；并继续保湿培养直至长
出叶片，保湿培养的时间为1个月，期间重复2次侵染；
44.s5、转基因植株鉴定：提取步骤s4叶片的dna和rna，分别在基因组和转录水平进行鉴定；并将叶片进行gus染色，在蛋白水平进行鉴定；
45.s6、稳定转化下胚轴体系建立：获得稳定转化的转化效率达到80％以上的猕猴桃。
46.实施例2：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，农杆菌感受态细胞ⅰ为eha105。
47.实施例3：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，侵染用农杆菌菌液ⅰ的菌液浓度od600值为0.6。
48.实施例4：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，侵染用农杆菌菌液ⅰ的菌液浓度od600值为1.0。
49.实施例5：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，6-ba的浓度为0.2mg/l。
50.实施例7：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，6-ba的浓度为0.4mg/l。
51.实施例8：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，6-ba的浓度为0.6mg/l。
52.实施例9：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，6-ba的浓度为1.0mg/l。
53.实施例10：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，iba的浓度为0.4mg/l。
54.实施例11：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，iba的浓度为0.6mg/l。
55.实施例12：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，iba的浓度为0.8mg/l。
56.实施例13：与实施例1的不同之处在于：步骤s4中，iba的浓度为1.0mg/l。
57.实施例14：一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，果实瞬时转化的步骤是：
58.a.遗传转化载体构建：构建35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅱ；
59.b.农杆菌转化：通过35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅱ转化农杆菌感受态细胞ⅱgv3101，获得转化成功的35s：gus农杆菌ⅱ；以gus基因作为指示标记，验证果实瞬时转化体系；制备得到菌液浓度od600值为0.8的农杆菌菌液ⅱ；
60.c.农杆菌菌液转入猕猴桃果实：将步骤b的农杆菌菌液ⅱ转入中华猕猴桃金果的果实中，转入的方式为抽真空转入，将猕猴桃果实浸没于农杆菌菌液ⅱ中进行抽真空，抽真空转入中的抽真空压强为0.08mpa、抽真空时间为2min；
61.d.瞬时转化果实体系建立：在28℃条件下放置3d，获得瞬时转化果实，通过gus染色和酶活确定瞬时转化果实体系，金果猕猴桃果实瞬时转化gus染色结果如图1所示。
62.实施例15：与实施例14的不同之处在于：步骤b中，农杆菌感受态细胞ⅱ为eha105。
63.实施例16：与实施例14的不同之处在于：步骤b中，农杆菌菌液ⅱ的菌液浓度od600值为0.4。
64.实施例17：与实施例14的不同之处在于：步骤b中，农杆菌菌液ⅱ的菌液浓度od600值为0.6。
65.实施例18：与实施例14的不同之处在于：步骤b中，农杆菌菌液ⅱ的菌液浓度od600值为1.0。
66.实施例19：与实施例14的不同之处在于：步骤c中，抽真空压强为0.06mpa。
67.实施例20：与实施例14的不同之处在于：步骤c中，抽真空压强为0.1mpa。
68.实施例21：与实施例14的不同之处在于：步骤c中，抽真空时间为3min。
69.对比例1：与实施例14的不同之处在于：步骤c中，抽真空时间为1min。
70.对比例2：与实施例14的不同之处在于：步骤c所用的猕猴桃果实品种为美味猕猴
桃徐香。
71.实施例22：一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，果实瞬时转化的步骤是：
72.a.遗传转化载体构建：构建35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅱ；
73.b.农杆菌转化：通过35s：gus(pri101-gus)过表达载体ⅱ转化农杆菌感受态细胞ⅱgv3101，获得转化成功的35s：gus农杆菌ⅱ；以gus基因作为指示标记，验证果实瞬时转化体系；制备得到菌液浓度od600值为0.6的农杆菌菌液ⅱ；
74.c.农杆菌菌液转入猕猴桃果实：将步骤b的农杆菌菌液ⅱ转入中华猕猴桃金果的果实中，转入的方式为注射转入，注射转入中注射果实菌液量为40μl；
75.d.瞬时转化果实体系建立：在28℃条件下放置5d，获得瞬时转化果实，通过gus染色和酶活确定瞬时转化果实体系。
76.实施例23：与实施例15的不同之处在于：步骤b中，农杆菌感受态细胞ⅱ为eha105。
77.实施例24：与实施例15的不同之处在于：步骤b中，农杆菌菌液ⅱ的菌液浓度od600值为0.8。
78.实施例25：与实施例15的不同之处在于：步骤b中，农杆菌菌液ⅱ的菌液浓度od600值为1.0。
79.实施例26：与实施例15的不同之处在于：步骤b中，农杆菌菌液ⅱ的菌液浓度od600值为0.4。
80.实施例27：与实施例15的不同之处在于：步骤c中，注射果实菌液量为20μl。
81.实施例28：与实施例15的不同之处在于：步骤c中，注射果实菌液量为60μl。
82.如图1所示，图为猕猴桃下胚轴转化试验流程图。
83.如图2所示，图(a)为下胚轴转化dna鉴定；(b)为下胚轴转化后转录水平鉴定。
84.如图3所示，图(a)为gv3101和eha105对下胚轴遗传转化的影响；图(b)为gv3101浓度对下胚轴遗传转化的影响；图(c)为6-ba浓度对下胚轴遗传转化的影响；图(d)为iba浓度对下胚轴遗传转化的影响。图中数值为平均值 标准差(n＝3)，显著性分析依据邓肯新复极差检测，同一小写字母表示在p《0.05水平无差异。根据student’s t tests来计算统计学上的显著差异(**p《0.01,*p《0.05)。图7表明：农杆菌感受态采用gv3101，菌液浓度od600为0.8，取1-2μl菌液添加在下胚轴断面处，在截面上添加0.8mg/l6-ba和0.2mg/l iba，重复侵染2次，转化效率达到80％以上。
85.图4和图5表明：中华猕猴桃金果gus染色情况好于美味猕猴桃徐香，金果gus酶活显著高于徐香果实，易于瞬时转化，适合作为瞬时转化材料。
86.如图6所示，其中图(a)为gv3101和eha105对猕猴桃果实瞬时转化的影响(抽真空)；图(b)为gv3101浓度对猕猴桃果实瞬时遗传的影响(抽真空)；图(c)为抽真空压强对猕猴桃果实瞬时遗传的影响；图(d)为抽真空时间对猕猴桃果实瞬时遗传的影响。图中数值为平均值 标准差(n＝3)，显著性分析依据邓肯新复极差检测，同一小写字母表示在p《0.05水平无差异。根据student’s t tests来计算统计学上的显著差异(**p《0.01，*p《0.05)。
87.如图7所示，其中图(a)为gv3101和eha105对猕猴桃果实瞬时转化的影响(注射)；图(b)为gv3101浓度对猕猴桃果实瞬时遗传的影响(注射)；图(c)为注射菌液量对猕猴桃果实瞬时遗传的影响。图中数值为平均值 标准差(n＝3)，显著性分析依据邓肯新复极差检测，同一小写字母表示在p《0.05水平无差异。根据student’s t tests来计算统计学上的显
著差异(**p《0.01,*p《0.05)。
88.在本发明的上述实施例中，该方法建立了稳定转化下胚轴体系和瞬时转化果实体系，利用该方法成功实现了稳定转化和果实瞬时转化；且该方法具备操作简单、周期短、转化率高等优点，能够建立一种高效猕猴桃遗传转化体系，有效改变猕猴桃遗传转化再生率普遍低下的现状。
89.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。