在酵母中表达β-葡糖苷酶以提高乙醇生产的制作方法

在酵母中表达
β-葡糖苷酶以提高乙醇生产
技术领域
1.本发明的组合物和方法涉及用于工业乙醇生产的酵母中β-葡糖苷酶的表达。该酵母证明可增加乙醇生产和减少不需要的副产物(包括乙酸盐)的生产。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。
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背景技术：

4.第一代基于酵母的乙醇生产将糖转化为燃料乙醇。全世界酵母的年度燃料乙醇生产为约900亿升(gombert,a.k.和van maris.a.j.(2015)curr.opin.biotechnol.[生物技术新见]33:81-86)。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为生产量如此之大，所以甚至小的产率提升也会对整个行业产生巨大的经济影响。
[0005]
可再生燃料标准(renewable fuel standard，rfs)是一项联邦计划，要求将最少量的可再生燃料共混到在美国销售的运输燃料中。rfs源自《2005年能源政策法案》(energy policy act of 2005)，并在《2007年能源独立和安全法案》(energy independence and security act of 2007)中进行了拓展和延伸。2010年，美国国家环境保护局(environmental protection agency，epa)建立了一项流程，要求公司申请新的燃料途径，以符合(rfs)计划的资格。燃料途径是(1)原料、(2)生产工艺以及(3)燃料类型的特定组合，其中三个组成部分的每种组合代表一种单独的燃料途径。为符合资格的燃料途径分配一个或多个d码，该一个或多个d码与它们有资格生成的可再生识别号(rin)类型相对应。常规的可再生燃料(例如，来自玉米)是d6，先进生物燃料是d5，生物柴油是d4，并且纤维素生物燃料是d3或d7。纤维素生物燃料(d码为3和7)必须是产自纤维素、半纤维素或木质素。
[0006]
rin是可交易的监管积分(credit)，代表一定数量的符合资格的可再生燃料。rin是在生产者向epa报告生产一加仑燃料后分配的。一旦将该一加仑燃料共混到运输燃料中，执行共混者(blender)就会通过将rin移交至epa来证明符合rfs。因为随着时间的推移rfs要求增加量的先进生物燃料(包括纤维素生物燃料)，所以rin具有不同的价值，这取决于生成rin的燃料途径。例如，目前d3 rin的价值高于d6 rin。
[0007]
sluiter,a.等人((2008)nrel laboratory analytical procedure[nrel实验室分析程序]nrel/tp-510-42618.golden,co:national renewable energy laboratory[科罗拉多州戈尔登市：国家可再生能源实验室])描述了当前用于确定生物质中结构性碳水化合物和木质素的国家可再生能源实验室(nrel)的实验室分析程序(lap)。该方法基于两步酸水解，其中首先使用72wt％硫酸在30℃水解生物质1h，随后稀释到4wt％硫酸在高压灭菌条件下在121℃进一步水解1h。一种更快的一步法已有描述，其中将生物质在4wt％硫酸中
水解，以在高压灭菌条件下在121℃进一步水解1h(gao,x.等人(2014)biotechnology and bioengineering[生物技术和生物工程]111:1088-96)。在两种方法中，水解的产物均通过hplc进行分析。这些方法的局限性在于它们不能区分衍生自淀粉的葡萄糖与衍生自纤维素的葡萄糖，因此不能用于确定淀粉-纤维素混合原料中衍生自纤维素的葡萄糖的分数。epa在2014年7月18日将玉米粒纤维确立为符合资格的作物残余物。
[0008]
随着玉米乙醇生产者尝试利用玉米纤维以及玉米淀粉来生产乙醇，将尽可能多的乙醇表征为d3生物燃料是有经济动机的。然而，epa对核算的准确性有要求，并且没有准确表征其生物燃料的生产者可能会受到处罚。据此，当使用淀粉和纤维素组分的混合原料来生产生物燃料时，需要准确的方法用于确定乙醇的来源。


技术实现要素：

[0009]
本发明的组合物和方法涉及表达β-葡糖苷酶的经修饰的酵母。这些组合物和方法的各方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
[0010]
1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，这些经修饰的细胞包含遗传改变，该遗传改变引起这些经修饰的细胞与这些亲本细胞相比产生增加量的β-葡糖苷酶多肽，其中与由在其他方面相同的亲本酵母细胞产生的乙醇和乙酸盐的量相比，这些经修饰的细胞在发酵期间产生更多的乙醇和/或更少的乙酸盐。
[0011]
2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，该遗传改变包括将核酸引入这些亲本细胞中，该核酸能够指导β-葡糖苷酶多肽以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
[0012]
3.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，该遗传改变包括引入用于表达β-葡糖苷酶多肽的表达盒。
[0013]
4.在如段落1-3中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，这些细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
[0014]
5.在一些实施例中，如段落1-4中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含pkl途径。
[0015]
6.在一些实施例中，如段落1-5中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶a途径中的改变。
[0016]
7.在一些实施例中，如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的替代途径。
[0017]
8.在如段落1-7中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，这些经修饰的细胞与在其他方面相同的亲本细胞相比，进一步产生减少量的dp2和/或dp3。
[0018]
9.在如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，该β-葡糖苷酶多肽衍生自禾生小丛壳(gomerella graminicola)。
[0019]
10.在如段落1-9中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，该β-葡糖苷酶多肽具有：(a)seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列，(b)与seq id no:1或seq id no:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，(c)由seq id no:11-16中的任一个编码的成熟多肽的氨基酸序列，(d)由与seq id no:11-16中的任一个具有至少80％核酸同一性的核酸编码的成熟多肽的氨基酸序列，或(e)由如下核酸编码的成熟多肽的氨基酸序列，该核
酸在严格条件下与seq id no:11-16中的任一个或其互补序列杂交。
[0020]
11.在如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，这些细胞属于酵母属(saccharomyces)物种。
[0021]
12.在另一方面，提供了用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的醇生产和/或减少这些酵母细胞的乙酸盐生产的方法，该方法包括：向亲本酵母细胞中引入与这些亲本细胞中生产的量相比使β-葡糖苷酶多肽的生产增加的遗传改变。
[0022]
13.在如段落12所述的方法的一些实施例中，具有引入的遗传改变的细胞是经修饰的细胞，这些经修饰的细胞是如段落1-11中任一项所述的细胞。
[0023]
14.在如段落12或13所述的方法的一些实施例中，醇的生产增加至少0.5％、至少1.0％、至少2.0％、或至少3.0％。
[0024]
15.在如段落12-14中任一项所述的方法的一些实施例中，乙酸盐的生产减少至少1.0％、至少2.0％、至少4.0％或至少6.0％。
[0025]
16.在如段落12-15中任一项所述的方法的一些实施例中，具有引入的遗传改变的细胞包含外源pkl途径。
[0026]
根据包括任何附图/图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
[0027]
序列简述
[0028]
seq id no:1表示abg54的预测的成熟氨基酸序列。
[0029]
seq id no:2表示fab的预测的成熟氨基酸序列，其与wo 2012125951(kaper等人)的seq id no:135相同。
[0030]
seq id no:3表示mg3a的预测的成熟氨基酸序列。
[0031]
seq id no:4表示trbgl1的预测的成熟氨基酸序列。
[0032]
seq id no:5表示abg54的预测的天然信号序列。
[0033]
seq id no:6表示fab的预测的天然信号序列。
[0034]
seq id no:7表示mg3a的预测的天然信号序列。
[0035]
seq id no:8表示trbgl1的预测的天然信号序列。
[0036]
seq id no:9表示预测的mfα信号序列。
[0037]
seq id no:10表示预测的suc2信号序列。
[0038]
seq id no:11表示编码pykh1127、gkh-0464、g3020、g3014、gkh-0737和gkh-0732中的天然abg54的核苷酸序列。
[0039]
seq id no:12表示编码pykh1139和gkh-0459中的mfα-abg54的核苷酸序列。
[0040]
seq id no:13表示编码gkh-0484中的suc2-abg54的核苷酸序列。
[0041]
seq id no:14表示编码pykh1135和gkh-0455中的天然fab的核苷酸序列。
[0042]
seq id no:15表示编码pykh1095和gkh-0450中的mfα-fab的核苷酸序列。
[0043]
seq id no:16表示编码gkh-0466中的suc2-fab的核苷酸序列。
[0044]
seq id no:17表示编码pykh1097中的天然mg3a的核苷酸序列。
[0045]
seq id no:18表示编码pykh1096中的mfα-mg3a的核苷酸序列。
[0046]
seq id no:19表示编码pykh1099中的天然trbgl1的核苷酸序列。
[0047]
seq id no:20表示编码pykh1098中的mfα-trbgl1的核苷酸序列。
具体实施方式
[0048]
i.定义
[0049]
在详细地描述本发明的酵母和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合这些术语在相关领域中所用的普通含义。
[0050]
如本文所使用的，术语“醇”是指其中羟基官能团(-oh)与饱和碳原子键合的有机化合物。
[0051]
如本文所使用的，术语“酵母细胞”、“酵母菌株”、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(ascomycota)和担子菌门(basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的特定实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(s.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
[0052]
如本文所使用的，短语“工程化的酵母细胞”、“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”、或相似短语是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
[0053]
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从n末端到c末端方向进行呈现。聚合物可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。这些定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
[0054]
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关蛋白”或“同源物”。这样的蛋白质可以衍生自不同属和/或物种的生物，或不同纲的生物(例如，细菌和真菌)，或者是人工设计的蛋白质。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的、或通过他们的功能确定的同源物。
[0055]
如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不旨在意味着同源物必定是进化上相关的。因此，该术语旨在涵盖从不同生物获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有相似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
[0056]
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何合适的方法确定(参见，例如，smith和waterman(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志],48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(wisconsin genetics software package)(遗传学计算机组公司(genetics computer group)，威斯康星州麦迪逊(madison,wi))中的程序，如gap、bestfit、fasta和tfasta；以及devereux等人(1984)nucleic acids res.[核酸研究]12:387-95)。
[0057]
例如，pileup是确定序列同源性水平的有用程序。pileup使用渐进的、两两比对创
建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建该比对的聚类关系的树。pileup使用feng和doolittle的渐进比对方法的简化(feng和doolittle(1987)j.mol.evol.[分子进化杂志]35:351-60)。该方法类似于higgins和sharp描述的方法((1989)cabios[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的pileup参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是blast算法，由以下描述：altschul等人((1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-10)和karlin等人((1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的blast程序是wu-blast-2程序(参见，例如，altschul等人(1996)meth.enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“w”、“t”、以及“x”确定了该比对的灵敏度与速度。该blast程序使用字长(w)为11、blosum62得分矩阵(参见，例如，henikoff和henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(b)为50、期望值(e)为10、m'5、n'-4、以及两条链的比较作为默认值。
[0058]
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的clustal w算法计算序列同一性百分比。参见thompson等人(1994)nucleic acids res.[核酸研究]22:4673-4680。clustal w算法的默认参数是：
[0059][0060][0061]
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，相差保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，例如在多肽与第二多肽仅
相差保守取代的情况下，这两种肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格性的范围内)彼此杂交。
[0062]
如本文所使用的，术语“杂交”是指如在印迹杂交技术和pcr技术期间发生的，一条核酸链与互补链形成双链体(即碱基对)的过程。严格杂交条件通过在以下条件下杂交来例证：65℃和0.1x ssc(其中1x ssc＝0.15m nacl、0.015m柠檬酸三钠，ph 7.0)。杂交的双链核酸的特征在于熔融温度(tm)，其中一半杂交的核酸与互补链不配对。双链体内错配的核苷酸降低tm。与seq id no:2的核苷酸和其同一的互补序列之间形成的双链体相比，编码变体α-淀粉酶的核酸可以具有降低了1℃-3℃或更多的tm。
[0063]
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或rna表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予指定表型。当生物含有多于一个相似基因时，术语“等位基因”通常是优选的，在这种情况下，每个不同的相似基因被称为不同的“等位基因”。
[0064]
如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
[0065]
如本文所使用的，“表达盒”是指包括启动子、和氨基酸编码区与终止子(即，启动子::氨基酸编码区::终止子)以及允许在细胞中产生编码的多肽所需的其他核酸序列的dna片段。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。
[0066]
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然”可互换地使用，并且是指在自然界中发现的基因、蛋白质或菌株，或者不是为了目前所述酵母的优势而有意修饰的基因、蛋白质或菌株。
[0067]
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、可选择标记、信号转导子、受体、转运蛋白、转录因子、翻译因子、辅因子等，并且可以被表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
[0068]
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
[0069]
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性特性、信号转导子、受体、转运蛋白、转录因子、翻译因子、辅因子等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
[0070]
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，这些破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
[0071]
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以防止产生呈现出野生型蛋白的活性特征的功能性蛋白/多肽，则对这些酵母细胞已经进行了“修饰以防止产生指定蛋白”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码
的多肽缺乏前述活性的基因的修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因的修饰、及其组合。
[0072]
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在存在氧的情况下的生长。
[0073]
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
[0074]
如本文所使用的，表述“发酵结束”是指就固定和可变成本而言，当连续发酵产生少量额外的醇的经济优势被连续发酵的成本超过时的发酵阶段。在更一般的意义上，“发酵结束”是指发酵将不再产生大量额外的醇，即不超过约1％的额外的醇，或无更多的用于进一步醇生产的底物剩余的点。
[0075]
如本文所使用的，短语“聚合度”(dp)是指给定的糖类中脱水吡喃葡萄糖单元的数目。dp1的实例是单糖葡萄糖。dp2的实例是二糖麦芽糖和异麦芽糖。
[0076]
如本文所使用的，表达“碳通量”是指碳分子通过代谢途径的周转率。碳通量是由代谢途径中涉及的酶调节的，如葡萄糖代谢途径和麦芽糖代谢途径。
[0077]
如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“该/所述(the)”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
[0078]
℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摄氏度
[0079]
aa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
α-淀粉酶
[0080]
aadh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙醛脱氢酶
[0081]
adh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
醇脱氢酶
[0082]
bp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
碱基对
[0083]
dna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
脱氧核糖核酸
[0084]
ds或ds
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
干固体
[0085]
dp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合度
[0086]
ec
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
酶学委员会
[0087]
etoh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙醇
[0088]
g或gm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
克
[0089]
g/l
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
克/升
[0090]
ga
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
葡糖淀粉酶
[0091]
hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
高效液相色谱法
[0092]
hr或h
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
小时
[0093]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摩尔
[0094]
mg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫克
[0095]
min
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
分钟
[0096]
ml或ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫升
[0097]
mm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫摩尔
[0098]nꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
当量浓度
[0099]
n/a
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
不适用
[0100]
n/d
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无数据
[0101]
nm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
纳米
[0102]
pcr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合酶链式反应
[0103]
pkl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸转酮酶
[0104]
ppm
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百万分率
[0105]
pta
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸转乙酰酶
[0106]
rpm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
转数/分钟
[0107]
δ
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
与缺失有关
[0108]
μg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微克
[0109]
μl和μl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微升
[0110]
μm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微摩尔
[0111]
ii.表达β-葡糖苷酶的经修饰的酵母细胞
[0112]
描述了表达β-葡糖苷酶的经修饰的酵母细胞及其使用方法。该酵母产生增加量的乙醇、减少量的乙酸盐，并提供与常规酵母相比额外的优势。额外的乙醇是由于使用了非淀粉衍生的β-d
连接的葡聚糖底物，例如纤维二糖和其他纤维寡糖底物，并且可能有资格获得d3 rin积分。β-葡糖苷酶在酵母中的表达受到以下观察结果的启发：与富含不同糖基水解酶的混合物相比，使釜馏物与八种糖基水解酶的且富含β-葡糖苷酶的混合物接触释放出更多葡萄糖。
[0113]
酵母在表达外源蛋白的能力方面可以具有选择性，且β-葡糖苷酶的表达也不例外。β-葡糖苷酶在酵母中的表达并不简单，也不容易获得合适的酵母。同样令人惊讶的是，由产乙醇微生物表达β-葡糖苷酶(到目前为止，在初始淀粉液化的下游)将产生在乙醇和乙酸盐生产中观察到的益处。还发现β-葡糖苷酶的表达与外源pkl途径组合以及与葡糖淀粉酶表达组合有利于乙醇和乙酸盐的产生。
[0114]
在一些实施例中，经修饰的细胞产生的乙醇的增加是与由在相同条件下生长的亲本细胞产生的乙醇的量相比，至少0.5％、至少0.7％、至少0.9％、至少1.2％、至少1.5％、至少2.0％、至少3.0％或更多的增加。
[0115]
在一些实施例中，经修饰的细胞产生的乙酸盐的减少是与由在相同条件下生长的亲本细胞产生的乙酸盐的量相比，至少0.5％、至少1.0％、至少2.0％、至少3.0％、至少4.0％、至少5.0％、至少6.0％、或更多的减少。
[0116]
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现了β-葡糖苷酶表达的增加，该遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
[0117]
在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及向酵母细胞中引入能够指导β-葡糖苷酶多肽表达或过表达的核酸。特定的方法包括但不限于(i)将用于产生多肽的外源表达盒引入宿主细胞中，任选地还有内源表达盒，(ii)用允许产生增加量的多肽的内源盒取代外源表达盒，(iii)对内源表达盒的启动子进行修饰以增加表达，(iv)增加用于β-葡糖苷酶过表达的相同或不同盒的拷贝数，和/或(v)对宿主细胞的任何方面进行修饰以增加多肽在宿主细胞中的半衰期。
[0118]
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，如编码可选择标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将目的基因引入经修饰的细胞中。
[0119]
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括增加乙醇生产的工程化的目的途径(如pkl途径)，或增加醇生产的任何其他途径。
[0120]
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，在经修饰的酵母细胞中表达的β-葡糖苷酶多肽的氨基酸序列与seq id no:1或seq id no:2具有至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
[0121]
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，β-葡糖苷酶多肽具有由如下核酸编码的成熟多肽的氨基酸序列，该核酸与seq id no:11-16中的任一个具有至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性核酸同一性，或具有由如下核酸编码的成熟多肽的氨基酸序列，该核酸在严格条件下与seq id no:11-16中的任一个或其互补序列杂交。
[0122]
iii.具有与外源pkl途径的基因组合的增加的β-葡糖苷酶表达的经修饰的酵母细胞
[0123]
可以将β-葡糖苷酶的增加的表达与pkl途径中的基因表达组合以进一步增加乙醇生产。wo 2015148272中先前已经描述了具有异源pkl途径的工程化的酵母细胞(miasnikov等人)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(pkl)、磷酸转乙酰酶(pta)、和乙酰化乙酰脱氢酶(aadh)，任选地具有其他酶，以使碳通量远离甘油途径并且朝向乙酰辅酶a的合成，然后该乙酰辅酶a转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，这样的经修饰的细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。
[0124]
iv.增加的β-葡糖苷酶生产与影响醇生产的其他突变的组合
[0125]
在一些实施例中，除了表达增加量的β-葡糖苷酶多肽(任选地与引入外源pkl途径组合)之外，本发明的经修饰的酵母细胞还包括额外的有益修饰。
[0126]
经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径和/或再利用甘油途径减弱的突变，已知这些突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并且包括例如通过破坏基因gpd1、gpd2、gpp1和/或gpp2中的一个或多个来降低或消除内源nad依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(gpd)或磷酸甘油磷酸酶(gpp)活性。参见例如美国专利号9,175,270(elke等人)、8,795,998(pronk等人)以及8,956,851(argyros等人)。methods to enhance the reuse glycerol pathway by over expression of glycerol dehydrogenase(gcy1)and dihydroxyacetone kinase(dak1)to convert glycerol to dihydroxy acetone phosphate[通过过表达甘油脱氢酶(gcy1)和二羟基丙酮激酶(dak1)将甘油转化为磷酸二羟基丙酮以增强再利用甘油途径的方法](zhang等人(2013)j.ind.microbiol.biotechnol.[工业微生物学和生物技术杂志]40:1153-60)。
[0127]
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶a合酶(也称为乙酰辅酶a连接酶)活性(ec 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为乙酰辅酶a。这部分地降低了乙酸盐对酵母细胞生长的不希望的影响，并且可以进一步有助于醇产率的提高。增加乙酰辅酶a合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶a合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶a合酶基因的表达等来实现。
[0128]
在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有nad

依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利
号8,795,998(pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的这样的基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺乏编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。
[0129]
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达糖转运蛋白样(stl1)多肽以增加甘油的摄入(参见，例如，ferreira等人(2005)mol.biol.cell.[细胞分子生物学]16:2068-76；等人(2015)mol.microbiol.[分子微生物学]97:541-59和wo 2015023989 a1)以增加乙醇生产和减少乙酸盐。
[0130]
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括丁醇生物合成途径。在一些实施例中，丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，异丁醇生物合成途径包含编码如下多肽的多核苷酸，该多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸盐脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
[0131]
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：pdc1、pdc5、pdc6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代，这些内源多核苷酸编码fra2、ald6、adh1、gpd2、bdh1、dls1、dpb3、cpr1、mal23c、mnn4、pab1、tmn2、hac1、ptc1、ptc2、osm1、gis1、crz1、hug1、gds1、cyb2p、sfc1、mvb12、ldb10、c5sd、gic1、gic2和/或ymr226c。
[0132]
v.增加的β-葡糖苷酶表达与其他有益突变的组合
[0133]
在一些实施例中，除β-葡糖苷酶多肽的增加的表达之外，任选地与有益于醇生产和/或乙酸盐减少的其他遗传修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括任何数量的编码目的蛋白的额外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入额外的目的基因，这些遗传操作导致β-葡糖苷酶多肽的生产增加。目的蛋白包括可选择标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自由以下组成的组的酶：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化并以其他方式修饰。
[0134]
vi.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途
[0135]
本发明的组合物和方法包括在发酵反应中用于增加醇生产和/或减少甘油生产的方法。这样的方法不限于特定的发酵工艺。预期本发明的工程化的酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“普适性(drop-in)”替代品。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。
[0136]
vii.适合修饰的酵母细胞
[0137]
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子
菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(kluyveromyces)、拉茜斯酵母属(lachancea)和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已被基因工程化以产生异源酶，如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。
[0138]
viii.底物和产物
[0139]
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与这样的底物和条件完全相容。
[0140]
醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-oh)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
[0141]
鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制这些组合物和方法。
[0142]
实例
[0143]
实例1：将β-葡糖苷酶添加到釜馏物中
[0144]
使用96孔密理博(millipore)滤板通过过滤去除细胞团来制备来自表达八种不同的糖基水解酶(包括abg54β-葡糖苷酶)的深层发酵培养物的发酵液，以用于分析。过滤后，使用96孔zeba
tm
脱盐离心板(spin desalting plate)(赛默飞世尔公司(thermofisher)，目录号：89807)，将培养液中的每种酶交换到20mm乙酸钠溶液(ph 5.0，0.005％)中。
[0145]
使用安捷伦(agilent)hplc 1290 infinity
tm
系统，使用沃特斯(waters)acquityc4beh 300柱(1.7μm，1x 50mm)，对获得自每种培养物的蛋白质进行定量。使用六分钟程序，起始于在0.5分钟内从5％至33％乙腈(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))的初始梯度，随后采用在4.5分钟内从33％至48％乙腈的梯度，然后采用至90％乙腈的分级梯度。使用基于纯化的里氏木霉(trichoderma ressei)bgl1(下文称为trbgl1)的蛋白质标准曲线对酶样品制剂进行定量。在hplc系统上运行酶样品之前，首先使用内切糖苷酶h对所有蛋白质进行去糖基化。
[0146]
将取样于谷物乙醇生产设备的全釜馏物离心，并使所得的上清液通过0.2μm膜滤器。将20％体积的100mm乙酸钠缓冲液(ph 5.0，含0.005％tween 80)添加到全釜馏物底物中用于酶活性测定。将糖基水解酶添加到经过滤的全釜馏物上清液中，以鉴定能够从可溶性难解(recalcitrant)寡糖中释放葡萄糖的酶。
[0147]
在含有150μl缓冲的全釜馏物上清液(3μg的所有八种糖基水解酶的蛋白质共混物和6μg的与该蛋白质共混物组合的每种单独的糖基水解酶)的96孔微量滴定板中，进行糖基水解酶与可溶性难解寡糖底物的反应。将反应板密封，并伴随250rpm混合在32℃孵育18小时。孵育后立即将板解封，并将150μl的0.1n硫酸混合到孔内容物中以淬灭水解反应。使用用于葡萄糖的abts测定对由难解寡糖的酶水解产生的葡萄糖产物的量进行测量。
[0148]
在50mm磷酸钠缓冲液(ph 7)中制备含有以下的abts储备溶液：2.88mg/ml的2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(西格玛奥德里奇公司)、0.11u/ml的辣根过
氧化物酶(西格玛奥德里奇公司)和1.05u/ml的葡萄糖氧化酶(oxygo
tm
hp 5000l，杜邦公司(dupont))。将95μl的abts储备溶液转移到96孔微量滴定板的孔中。将淬灭的反应板的5μl移液到含有abts溶液的测定板中。将测定板装载到微量滴定板读取器中，设置为在405nm的吸光度设置下进行3分钟的动力学测量，采用9秒的读取间隔和60秒的延迟。在动力学测量之前使用5秒振荡步骤以进行混合并消除测定板孔中的任何气泡。使用利用葡萄糖标准品生成的标准曲线和相同的abts测定，对每个样品反应产生的葡萄糖的量进行计算。结果在表1中示出。富含酶h(β-葡糖苷酶abg54)的酶组合物从釜馏物底物中产生最多的葡萄糖。
[0149]
表1.从全釜馏物的难解可溶性寡糖中的葡萄糖生产
[0150]
酶生产的葡萄糖(mm)蛋白质共混物(pb)7.99pb 酶a8.37pb 酶b8.16pb 酶c8.17pb 酶d8.15pb 酶e8.22pb 酶f8.08pb 酶g8.10pb 酶h9.65
[0151]
实例2：实例2-8的材料和方法
[0152]
液化物制备
[0153]
通过添加600ppm尿素、0.124sapu/g ds fermgen
tm 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33gau/g ds变体木霉属(trichoderma)葡糖淀粉酶(trga)以及1.46sscu/g ds曲霉属(aspergillus)α-淀粉酶(akaa)、调整至ph 4.8来制备液化物(磨细的玉米浆料)。为了评估表达葡糖淀粉酶的菌株，将葡糖淀粉酶的剂量减少至0.1gau/g ds。在某些实验中，还将5g/l纤维二糖添加到液化物中。
[0154]
血清小瓶测定
[0155]
向在24孔板中的2ml ypd接种酵母细胞，并且使细胞生长过夜。将5ml制备的液化物等份加入血清小瓶(chemglass公司，目录号：cg-4904-01)中，并且将酵母添加到每个小瓶中，达到约0.2-0.4的最终od。旋拧小瓶的盖子，并且用针(bd公司，目录号：305111)刺穿以用于通风(以释放co2)，然后伴随振荡(200rpm)在32℃孵育55小时。
[0156]
摇瓶测定
[0157]
将100μl浓缩的酵母过夜培养物添加到填充有50g制备的液化物的多个摇瓶中的每个，以达到0.3的最终od。将这些烧瓶伴随振荡(200rpm)在32℃孵育55小时。
[0158]
hplc分析
[0159]
将来自血清小瓶和摇瓶实验的样品通过0.2μm ptfe过滤器过滤，并在65℃使用bio-rad aminex hpx-87h柱(其在0.01n h2so4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过hplc(沃特斯e2695系列)分析滤液中乙酸盐、乙醇、甘油、葡萄糖、dp2、dp3和dp4 的含量。使用2.5μl样品注射体积。使用校准标准品对乙酸盐、乙醇、甘油和葡萄糖进行定量。值以g/l表示。
[0160]
用于β-葡糖苷酶活性确定的菌株的生长
[0161]
将酵母菌株接种到24孔板中的2ml缺乏尿嘧啶的合成完全培养基(sc-ura)或ypd培养基中，并使细胞生长过夜。使培养物通过0.2μm滤板(pall acroprep advance，ghp膜)过滤，并对所得的滤液进行β-葡糖苷酶活性的测定。
[0162]
β-葡糖苷酶活性测定
[0163]
通过将0.006g pnpg溶解于20ml 0.05m乙酸钠缓冲液(0.05m乙酸钠，0.1％(v/v)聚乙烯甘油8000，ph 4.8)中来制备4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)底物溶液。将100μl pnpg底物溶液与20μl经过滤的培养物上清液或β-葡糖苷酶标准品混合，并在30℃孵育45min。通过添加50μl 1m碳酸钠并在室温孵育1min来终止反应，然后测量405nm处的吸光度。通过与使用连续稀释的β-葡糖苷酶标准品产生的标准曲线进行比较，计算培养物上清液中的β-葡糖苷酶活性。
[0164]
信号序列预测
[0165]
使用具有默认参数的signalp版本4.1(petersen,t.n.等人(2011)nature methods[自然方法],8:785-86)预测信号序列裂解位点的确定。应当理解，实际的信号序列裂解位点以及因此成熟的分泌的多肽的n末端可能相差几个氨基酸残基，或者可能在分泌的多肽的群体内有所不同。
[0166]
实例3：对酿酒酵母中β-葡糖苷酶的表达的筛选
[0167]
将编码四种不同的β-葡糖苷酶(seq id no:1-4)的基因(针对酿酒酵母进行密码子优化)在pjt257中的spei和noti限制性酶切位点之间克隆(描述于美国专利号9,181,566)。在所得的质粒中，β-葡糖苷酶的表达在来自酿酒酵母的fba1启动子和fba1终止子的控制之下(参见，例如，wo 2018/111792)。构建了第二组质粒，其含有编码相同的四种β-葡糖苷酶但去除了天然信号序列(seq id no:5-8)并用来自酿酒酵母交配因子α(mfα；seq id no:9)的信号序列替换的基因。如表2所示命名质粒。注意，fab是衍生自来自轮枝镰孢菌(fusarium vesticilloies)、埃默森罗萨氏菌(rasamsonia emersonii)和红褐肉座菌(hypocrea jecorina)(木霉属)的β-葡糖苷酶部分的杂交酶，其在wo 2012125951(kaper等人)中描述为seq id no:135。
[0168]
表2.β-葡糖苷酶表达质粒
[0169]
[0170]
将表2所列的质粒转化到菌株fg-ura3中，并通过在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基(sc-ura)上生长来选择转化体。fg-ura3是fermax
tm gold(以下简称“fg”)的衍生物，其中ura3基因已缺失。fg-ura3的构建描述于wo 2018111792 a1中。还用缺乏β-葡糖苷酶编码序列的对照质粒ppol00040对fg-ura3进行了转化。如实例2所述，使转化体在sc-ura液体培养基中生长过夜，并测量培养基中的β-葡糖苷酶活性。来自两项这样的实验的结果在表3中示出。
[0171]
表3.在用β-葡糖苷酶表达质粒转化的fg-ura3中测量的β-葡糖苷酶活性
[0172][0173]
与用ppol00040转化的对照菌株相比，含有编码abg54或fab的质粒的菌株的a
405
更高。这表明编码abg54或fab的菌株表达β-葡糖苷酶活性。对表达具有其天然信号序列或mfα信号序列的abg54或fab的菌株的β-葡糖苷酶活性进行检测。相比之下，含有编码mg3a或trbgl1的质粒的菌株似乎没有产生比用ppol00040转化的阴性对照菌株所测量的更高的β-葡糖苷酶活性。
[0174]
实例4：具有abg54或fab的整合表达盒的菌株
[0175]
使用将具有同源性的区域并入酿酒酵母中pam1基因座处的靶位点的引物，通过pcr分别从质粒pykh1127、pykh1139、pykh1135或pykh1095扩增编码以下的表达盒：具有其天然信号序列的abg54、具有mfα信号序列的abg54、具有其天然信号序列(seq id no:6)的fab或具有mfα信号序列(seq id no:9)的fab。将每一个扩增的dna片段用作供体dna，用于fg中pam1基因座处的crispr介导的整合。通过菌落pcr对β-葡糖苷酶表达盒的整合进行确认，并如表4所示对所得的菌株命名。
[0176]
还构建了菌株，其中将abg54或fab的天然信号序列用来自酿酒酵母转化酶基因的信号序列suc2(seq id no:10)替换。通过用两个重叠的dna片段(其中一个片段含有连接到suc2信号序列的酿酒酵母fba1启动子，另一个片段含有连接到fba1终止子的abg54或fab编码序列(无天然信号序列))转化fg来构建这些菌株。使用程序将这些片段在pam1基因座处组装与整合，该程序描述于eauclaire等人(2016)j.ind.microbiol.biotechnol.[工业微生物学和生物技术杂志]43:1001-15。通过菌落pcr对β-葡糖苷酶表达盒的正确组装与整合进行确认。如表4所示对所得的菌株命名。
[0177]
如实例2所述，使每个菌株的四个克隆与亲本菌株fg一起在ypd液体培养基中生长过夜，并测量所得的培养基中的β-葡糖苷酶活性。结果在表4中示出。
[0178]
表4.编码abg54或fab的菌株相对于fg分泌的β-葡糖苷酶活性
[0179][0180][0181]
与亲本fg菌株相比，具有整合的β-葡糖苷酶表达盒的新菌株的a
405
更高。这表明菌株gkh-0464、gkh-0459、gkh-0484、gkh-0455、gkh-0450和gkh-0466均表达β-葡糖苷酶活性。
[0182]
实例5.小瓶测定中表达β-葡糖苷酶的酿酒酵母菌株的乙醇生产
[0183]
相对于亲本菌株fg，对表4所列的每个菌株的四个克隆进行筛选用于乙醇生产。如实例2所述，使菌株在血清小瓶中的玉米液化物中生长，并在发酵55h后对乙醇生产进行分析。结果在表5中示出。
[0184]
表5.小瓶测定中表达β-葡糖苷酶的酵母菌株相对于fg的性能
[0185][0186]
与亲本fg菌株相比，表达β-葡糖苷酶的菌株gkh-0464、gkh-0459、gkh-0484、gkh-0455和gkh-0466实现了高达1.5％增加的乙醇生产。
[0187]
实例6：摇瓶测定中表达β-葡糖苷酶的酿酒酵母菌株的乙醇生产
[0188]
为了进一步检验β-葡糖苷酶表达的益处，使用摇瓶测定更精确地分析了菌株gkh-0464和gkh-0484的性能。如实例2所述，使菌株gkh-0464、gkh-0484或亲本菌株fg在玉米液化物中生长55h，并分析它们的发酵产物。在第二组烧瓶中，添加大约5g/l纤维二糖，之后接种酵母。结果在表6中示出。
[0189]
表6.在具有或不具有纤维二糖的摇瓶测定中表达β-葡糖苷酶的酵母菌株相对于fg的性能
[0190][0191]
与亲本fg菌株相比，表达β-葡糖苷酶的菌株gkh-0464和gkh-0484实现了高达3.3％增加的乙醇生产。与亲本菌株相比，gkh-0464和gkh-0484还实现了高达6.3％减少的乙酸盐，以及减少的dp2和减少的dp3。对于使用fg的发酵，在接种酵母之前将大约5g/l纤维二糖添加到液化物中使发酵结束时dp2相应增加。这表明用fg发酵期间添加的纤维二糖未被消耗。相比之下，对于gkh-0464和gkh-0484，发酵结束时具有或不具有添加的纤维二糖的液化物的dp2浓度是相似的。这表明在用gkh-0464和gkh-0484发酵期间可以将纤维二糖消耗。
[0192]
实例7：具有pkl途径和葡糖淀粉酶的表达β-葡糖苷酶的菌株
[0193]
将侧翼是酿酒酵母fba1启动子和gpd1终止子的abg54编码序列(与质粒pykh1127中的序列具有同一性)整合至酿酒酵母中的jip5基因座处。将扩增的dna片段用作供体dna，用于两种亲本菌株：(i)fg-pkl和(ii)fg-pkl-ga中jip5基因座处的crispr介导的整合。fg-pkl是工程化的fg酵母，其具有异源磷酸转酮酶(pkl)途径，该途径涉及磷酸转酮酶(pkl)、磷酸转乙酰酶(pta)和乙酰化乙酰脱氢酶(aadh)的表达，如wo 2015148272中所述。fg-pkl-ga是被进一步工程化以表达木霉属葡糖淀粉酶的变体的fg-pkl菌株。
[0194]
通过菌落pcr对abg54表达盒在这些菌株中的整合进行确认。如实例2所述，使所得的菌株与缺乏abg54表达盒的亲本菌株一起在血清小瓶的玉米液化物中生长，并分析它们的发酵产物。结果在表7中示出。
[0195]
表7：小瓶测定中表达β-葡糖苷酶的菌株g3020和g3014相对于亲本菌株的性能
[0196][0197]
与它们相对应的亲本菌株相比，表达β-葡糖苷酶的菌株g3020和g3014实现了稍微增加的乙醇生产(《0.5％)。然而，与它们各自的亲本菌株相比，g3020和g3014实现了高达几乎13％减少的乙酸盐，以及减少的dp2和减少的dp3。
[0198]
实例8：表达β-葡糖苷酶的杂交酵母菌株
[0199]
使用将具有同源性的区域并入酿酒酵母中jen1基因座处的靶位点的引物，通过pcr扩增来自质粒pykh1127的abg54表达盒。将扩增的dna片段用作供体dna，用于在两种亲本菌株：(i)dgy1-δ和(ii)dgy1-δ-ga中jen1基因座处的crispr介导的整合。dgy1-δ是杂交酵母菌株，该菌株通过将两种可商购的亲本酵母菌株交配产生并通过缺失编码dls1的yjl065c基因进一步修饰(参见，例如，wo 2018089333)。dgy1-δ-ga是被进一步修饰以表达葡糖淀粉酶的dgy1-δ菌株。
[0200]
通过菌落pcr对abg54表达盒在这些菌株中的整合进行确认。如实例2所述，使所得的菌株与缺乏abg54表达盒的亲本菌株一起在摇瓶的玉米液化物中生长，并分析它们的发酵产物。结果在表8中示出。
[0201]
表8.表达β-葡糖苷酶的杂交菌株相对于亲本菌株的性能
[0202][0203]
与它们相对应的亲本菌株相比，表达β-葡糖苷酶的菌株gkh-0737和gkh-0732实现
了高达约0.9％增加的乙醇生产，并且与它们各自的亲本菌株相比，实现了高达超过7％减少的乙酸盐，以及减少的dp3。
[0204]
实例9：abg54和fab与其他β-葡糖苷酶的体外比较
[0205]
观察到abg54和fab是在酵母中表达最好的β-葡糖苷酶(实例3)之后，进行与实例1中所述实验类似的实验，以对上述全釜馏物测定中abg54和fab与其他β-葡糖苷酶的活性进行比较。
[0206]
如实例1所示，abg54是性能最好的糖基水解酶，用于从全釜馏物中的可溶性难解寡糖中释放葡萄糖，从而推动了β-葡糖苷酶在酵母中的表达。如实例3所示，表明abg54和fab是在酵母中表达最好的β-葡糖苷酶。
[0207]
在由表9所示结果总结的基本上完整的实验中，证明abg54和fab是比mg3a和trbgl1两者(在酵母中测试的其他两种β-葡糖苷酶)性能更好的β-葡糖苷酶，并且优于其他gh-15和gh-3分子的共混物。值得注意且不足为奇的是，本文选择和测试的所有酶都被认为是同类最好的，否则不会将它们用于测试。
[0208]
无论如何，与mg3a和trbgl1(特别地)相比，abg54和fab的可测量的优越性能并不能解释在酵母中表达的显著差异。β-葡糖苷酶表达的差异比酶体外性能的差异大几个数量级(ordinals of magnitude)。这些数据证实了此原则，即外源酶在酵母中的表达经常是有问题的，但abg54和fab尤其表达良好且在它们的类别中具有额外的优越性。这些结果在表9中示出。
[0209]
表9.在酵母中表达的β-葡糖苷酶的体外性能的比较
[0210]
酶组合生产的葡萄糖(mm)pb abg545.99pb fab5.61pb mg3a4.92pb trbgl15.49gh15 gh3共混物3.61