一种有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺。


背景技术：

2.随着生物药的不断发展，治疗性抗体，尤其是双特异性抗体已经成为癌症、自身免疫、炎症和各种其他疾病患者的主要选择药物。双特异性抗体(bispecific antibody，biab)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够特异性识别和结合两个不同的抗原或抗原表位，其可以在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，将特定的免疫细胞重新定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，或者同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能。
3.目前研发的抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体带有两个不同的可变区，其中一个识别结合肿瘤抗原gpc3，另一个用于结合t细胞，双特异性抗体起一个“连接臂”的作用，将t细胞召集到肿瘤部位。同时该抗体采用共同轻链的结构设计，针对两个靶点的抗体重链拥有相同的轻链，在抗体表达配对上不会导致轻重链错配出现。
4.虽然共同轻链双特异性抗体在成药性和生产工艺的控制上具有很大的优势，但是，因采用两个不同重链，其结构比单克隆抗体更加复杂，在制备双特异性抗体的过程中，也更易产生各种不同的同源二聚体。因此，对含有目标抗体培养物进行分离纯化是其生产过程中必不可少的步骤。但是在现有技术中，很少有关于共轻链的双特异性抗体的纯化方法的报道。
5.专利cn108472360a虽然公开了从亲代同源二聚体抗体种类中纯化异源二聚多特异性抗体的方法，但是其洗脱液包括n环己基-3-氨基丙磺酸(caps)、n-环己基-2-氨基乙磺酸(ches)、n-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(taps)、n-(2-羟乙基)哌嗪-n
′-
(2-羟基丙磺酸)(heppso)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸钠盐、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、乙酸、甲酸及nacl，其洗脱液成分复杂，分析方法繁琐。
6.因此，需要提供一种新的且简单有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺，能够提高双特异性抗体药物制备过程中去除同源二聚体的效率，为双特异性抗体药物纯化工艺提供更加可靠的选择。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺。
8.本发明所述的一种去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺，包括以下步骤：
9.步骤1，处理层析填料，上样；所述层析填料为diamond sp mustang；
10.步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；
11.步骤3，使用含有添加剂的洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。
12.进一步的，所述双特异性抗体为抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体。
13.进一步的，所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液a和洗脱缓冲液b；所述洗脱缓冲液a为naac-hac，所述洗脱缓冲液b为naac-hac和盐的组合物。
14.进一步的，所述盐为nacl。
15.进一步的，所述洗脱缓冲液通过所述洗脱产品时产生线性盐梯度。
16.进一步的，所述洗脱缓冲液还含有添加剂。
17.进一步的，所述添加剂为醇、糖或氨基酸。
18.进一步的，所述醇为乙醇、甘露醇或山梨糖醇。
19.进一步的，所述糖为蔗糖、海藻糖或右旋糖酐40。
20.进一步的，所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸。优选的，所述精氨酸为l-精氨酸。
21.进一步的，所述添加剂的浓度为5-500mm，优选10-300mm，20-200mm，30-150mm，更优选40-100mm，进一步优选50-70mm。
22.进一步的，所述步骤1的具体操作方法为：
23.1a，层析填料装柱，用3-50倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱；
24.1b，用2-4倍柱体积的1m naoh溶液进行层析柱消毒；
25.1c，用3-6倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱；
26.1d，上样，保留时间5
±
1min；
27.进一步的，所述步骤2的平衡缓冲液为3-6倍柱体积。
28.进一步的，所述平衡缓冲液为naac-hac；优选的，所述naac-hac的浓度为10-200mm；更优选的，所述naac-hac的浓度为20-100mm；进一步优选的，所述naac-hac的浓度为50mm。
29.进一步的，所述步骤3的洗脱缓冲液为10-100倍的柱体积。
30.因此，本发明涉及以下实施方案：
31.1.一种去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
32.步骤1，处理层析填料，上样；所述层析填料为diamond sp mustang；
33.步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；
34.步骤3，使用含有添加剂的洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。
35.2.根据方案1所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述双特异性抗体为抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体。
36.3.根据方案1或2所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液a和洗脱缓冲液b；所述洗脱缓冲液a为naac-hac，所述洗脱缓冲液b为naac-hac和盐的组合物。
37.4.根据权利要求3所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述盐为nacl。
38.5.根据方案4所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述洗脱缓冲液通过所述洗脱产品时产生线性盐梯度。
39.6.根据方案1-5所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述洗脱缓冲液还含有添加
剂。
40.7.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂为醇、糖或氨基酸。
41.8.根据方案7所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述醇为乙醇、甘露醇或山梨糖醇。
42.9.根据方案7所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述糖为蔗糖、海藻糖或右旋糖酐40。
43.10.根据方案7所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸。
44.11.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂的浓度为5-500mm。
45.12.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂的浓度为10-300mm。
46.13.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂的浓度为20-200mm。
47.14.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂的浓度为30-150mm。
48.15.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂的浓度为40-100mm。
49.16.根据方案6所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述添加剂的浓度为50-70mm。
50.17.根据方案1或2所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述步骤1的具体操作方法为：
51.1a，层析填料装柱，用3-50倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱；
52.1b，用2-4倍柱体积的1m naoh溶液进行层析柱消毒；
53.1c，用3-6倍柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱；
54.1d，上样，保留时间5
±
1min。
55.18.根据方案1或2所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述步骤2的平衡缓冲液为3-6倍柱体积。
56.19.根据方案1或2所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述平衡缓冲液为naac-hac；优选的，所述naac-hac的浓度为10-200mm；更优选的，所述naac-hac的浓度为20-100mm；进一步优选的，所述naac-hac的浓度为50mm。
57.20.根据方案1所述的层析纯化工艺，其特征在于，所述步骤3的洗脱缓冲液为10-100倍的柱体积。
58.术语
[0059]“共同轻链”或“共轻链”指含有轻链可变区的多肽，所述轻链可变区能够稳定且独立地与至少两种不同的重链多肽配对且由此在各独立的情况下生成包含每种重链多肽的重链可变区及轻链可变区的抗原结合结构域。因此，两个拷贝的共同轻链各自能够与第一重链多肽和第二重链多肽稳定地配对，以使得双特异性抗体呈天然形式，如igg同种型形式，如igg1形式、igg2形式、igg3形式和/或igg4形式，其中对两种不同抗原具有特异性。
[0060]“同源二聚体”是指包含两个相同的具有两种抗原特异性中的一种的重链，在某些实施例中，指抗gpc3的特异性抗体，或者指抗cd3的特异性抗体。
[0061]“氨基酸”以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、
色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。
[0062]“缓冲液”是通过它的酸-碱共轭物组分的作用而抵抗ph的变化的缓冲溶液。
[0063]“平衡缓冲液”在本文中是用于准备层析固相的缓冲液。
[0064]“洗脱缓冲液”用于从层析基质洗脱蛋白，即将目标蛋白从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液的电导率和/或ph能使目标蛋白从离子交换树脂上洗脱下来。
[0065]“线性洗脱”是指这样的方法，例如在某些实施例中，在整个洗脱过程中，洗脱缓冲液a和洗脱缓冲液b的总体积不变，洗脱缓冲液b的体积分数跟时间呈线性关系，即洗脱缓冲液b的体积随着时间的延长呈线性增加。
[0066]“梯度洗脱”是指这样的方法，其中例如引起洗脱(即从材料分离出结合的化合物)的物质浓度立即上升或下降，即在单步骤中直接从起始值/水平到终值/水平。
[0067]“盐”是通过酸和碱的相互作用而形成的化合物。
[0068]
本发明的有益效果
[0069]
本发明提供了一种新的且简单有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺，能够提高双特异性抗体药物制备过程中去除同源二聚体的效率，为双特异性抗体药物纯化工艺提供更加可靠的选择。
具体实施方式
[0070]
以下结合具体的实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0071]
实施例1抗体的制备
[0072]
从液氮中取出105-102-7号细胞株，37℃水浴快速融化，将细胞转移至摇瓶中培养，细胞接种密度为0.4～1.2
×
106个细胞/ml。
[0073]
细胞在摇瓶中进行扩增培养，每2天传代一次。根据培养体积更换不同规格摇瓶，摇床参数为37℃、5％co2、115rpm。当最终细胞密度达3～6
×
106个细胞/ml，细胞活力大于90％，转移至发酵罐中培养。
[0074]
发酵罐的接种密度为0.8～1.2
×
106个细胞/ml，温度37℃，转速180～250rpm，ph6.8～7.2、溶氧(po2)50％。当细胞密度≥10
×
106个细胞/ml时，将培养温度降为32℃。为了使细胞有足够的营养维持其较高活率并产生目的蛋白，在培养第4、6、8、10天均补初始培养体积3％补料培养基。为避免葡萄糖含量过低对细胞活率产生明显影响，向反应器中补加30％(m/v)葡萄糖溶液，使培养液中葡萄糖含量维持在4g/l。待细胞活率下降至80％左右时，收获细胞发酵液。
[0075]
将收获的发酵液8000～12000rpm离心30分钟，0.45um滤膜过滤后进行蛋白a亲和层析(博格隆at proteina)得到抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体(同源二聚体杂质15％左右)。
[0076]
实施例2不同填料的线性洗脱
[0077]
在此对比实施例中，描述了使用强阳离子填料capto s impact、diamond sp mustang，强阳离子 疏水填料capto mmc，在线性洗脱条件下进行交换层析。
[0078]
层析条件：
[0079]
柱体积：6.18ml
[0080]
流速：1.2ml/min
[0081]
样品：抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体，同源二聚体杂质15％左右
[0082]
平衡缓冲液：50mm naac-hac，ph5.0
[0083]
洗脱缓冲液a：50mm naac-hac，ph5.0
[0084]
洗脱缓冲液b：50mm naac-hac，1m nacl，ph5.0
[0085]
用抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体(同源二聚体杂质15％左右)进行上样，在上样步骤后用3倍柱体积的平衡缓冲液以1.2ml/min的流速洗涤柱子。用线性洗脱法洗脱抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体中同源二聚体，其中使流动相中的ph值保持恒定。方案1和方案2中使洗脱缓冲液b的体积分数由0％线性升至50％，方案3中使洗脱缓冲液b的体积分数由0％线性升至100％。
[0086]
结果发现，当使用capto s impact、diamond sp mustang、capto mmc中的任一填料，其分离效果都不好。纯度≥98％的产品为合格样品，计算合格样品的回收率，结果如表1所示。
[0087]
表1通过不同填料的线性洗脱法的纯化结果
[0088][0089]
由结果可知，当在洗脱缓冲液中只添加nacl，而未添加添加剂时，使用capto s impact、diamond sp mustang、capto mmc中的任一填料，对双特异性抗体进行纯化，目标产品和同源二聚体的分离效果都不好。
[0090]
实施例3不同填料的多步梯度洗脱
[0091]
在此对比实施例中，描述了使用强阳离子填料capto s impact、弱阳离子填料fractogel coo-m，在梯度洗脱条件下进行离子交换层析。
[0092]
层析条件：
[0093]
柱体积：6.18ml
[0094]
流速：1.2ml/min
[0095]
样品：抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体，同源二聚体杂质15％左右
[0096]
平衡缓冲液：50mm naac-hac，ph5.0
[0097]
洗脱缓冲液a：50mm naac-hac，ph5.0
[0098]
洗脱缓冲液b：50mm naac-hac，1m nacl，ph5.0
[0099]
用抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体(同源二聚体杂质15％左右)进行上样，在上样步骤后用3倍柱体积的平衡缓冲液以1.2ml/min的流速洗涤柱子。用多步梯度洗脱法(梯度洗脱法为将洗脱盐的浓度立即从起始值改变至终值的方法)洗脱抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体中同源二聚体，其中使流动相中的ph值保持恒定，使洗脱缓冲液b的体积分数由10％多步升至50％。多步梯度流程如表2所示。
[0100]
表2多步梯度流程
[0101][0102]
分管收集洗脱样品测定纯度，纯度≥98％的产品为合格样品，计算合格样品的回收率，结果如表3所示。
[0103]
表3通过不同填料的多步梯度洗脱法的纯化结果
[0104][0105]
由结果可知，当在洗脱缓冲液中只添加nacl，而未添加添加剂时，使用capto s impact、fractogel coo-m中的任何填料对双特异性抗体进行纯化，目标产品和同源二聚体的分离效果都不好。
[0106]
实施例4不同添加剂的考察
[0107]
通过在添加有nacl的洗脱缓冲溶液中添加不同的添加剂，来考察添加剂对抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体中同源二聚体的纯化效果的影响。
[0108]
层析条件：
[0109]
填料：diamond sp mustang
[0110]
柱体积：6.18ml
[0111]
流速：1.2ml/min
[0112]
样品：抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体，同源二聚体杂质15％左右
[0113]
平衡缓冲液：50mm naac-hac，ph5.0
[0114]
洗脱缓冲液a：50mm naac-hac，ph5.0
[0115]
洗脱缓冲液b：50mm naac-hac，1m nacl，ph5.0
[0116]
用抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体(同源二聚体杂质15％左右)进行上样，在上样步骤后用3倍柱体积的平衡缓冲液以1.2ml/min的流速洗涤柱子。用线性洗脱法洗脱抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体中同源二聚体，其中使流动相中的ph值保持恒定。方案6使洗脱缓冲液b的体积分数由5％线性升至50％，方案7使洗脱缓冲液b的体积分数由0％线性升至50％，方案8和方案9使洗脱缓冲液b的体积分数由20％线性升至60％。
[0117]
分管收集洗脱样品测定纯度，纯度≥98％的产品为合格样品，计算合格样品的回收率，结果如表4所示。
[0118]
表4使用添加剂的线性梯度法的纯化结果
[0119][0120][0121]
由结果可知，当在洗脱缓冲溶液中添加5％(体积分数)的乙醇或5％(质量分数)的蔗糖时，目标产品和同源二聚体的分离效果都比较好，但是，产品的回收率比较低。当在洗脱缓冲液中添加50mm的l-精氨酸或100mm的l-精氨酸时，不但目标产品和同源二聚体的分离效果好，而且目标产品的回收率也很高。
[0122]
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。