用于预测非小细胞肺癌患者对PD-1或PD-L1免疫检查点抑制剂的响应的激酶活性签名的制作方法

用于预测非小细胞肺癌患者对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的响应的激酶活性签名
发明领域
1.本发明涉及用于确定或预测诊断患有非小细胞肺癌的患者对特定药物的响应的方法和装置。更具体地，本发明提供了测量所述患者血液样品中激酶活性的方法。
2.发明背景
3.目前认为肺癌是最重要的死亡原因之一，尤其是在50至69岁的成年人中。长期暴露于吸烟环境是90％的肺癌病例的原因。在男性吸烟者中，发展成肺癌的终生风险为约17％；在女性吸烟者中，风险为约11％。对于非吸烟者，发展成肺癌的风险约为1％。非吸烟者患肺癌的主要原因是遗传因素、氡气、石棉、空气污染和被动吸烟。肺癌有两种主要类型：非小细胞肺癌(nsclc)(约80％的病例)和小细胞肺癌(约17％的病例)。nsclc可以进一步根据癌细胞的生长类型和扩散进行分类。因此，nsclc可以分为鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。腺癌在女性、亚洲人和非吸烟者中更常见。其他不太常见的nsclc类型是多形性、类癌瘤、唾液腺癌和未分类癌。
4.为了诊断nsclc，进行肺组织活检。根据初步活检诊断，可以对附近的淋巴结进行活检，以查看癌症是否已经扩散。nsclc的分期基于美国癌症联合委员会(ajcc)tnm系统。t代表肿瘤(它在肺内生长的程度和其他因素)。根据肿瘤的大小为t类别分配数字(从0到4)。n代表扩散到附近的淋巴结(豆大小的免疫系统细胞集合，癌症通常首先扩散到此)。根据nsclc细胞是否已经扩散到淋巴结或是否在连接淋巴结的淋巴通道中发现，为n类别分配数字(从0到3)。m类别基于nsclc是否已经转移(扩散)到远处器官，它已经到达哪些器官。众所周知，大多数类型的肺癌预后较差。根据tnm标准，美国的不同分期和生存如下：
5.·
ia期：5年生存率约为49％。
6.·
ib期：5年生存率约为45％。
7.·
iia期：5年生存率约为30％。
8.·
iib期：5年生存率约为30％。
9.·
iiia期：5年生存率约为14％。
10.·
iiib期：5年生存率约为5％。
11.·
iv期：5年生存率约为1％-2％。
12.nsclc治疗选择基于疾病的分期，并且可以包括：手术、化学疗法、靶向疗法、免疫疗法和放射疗法。早期nsclc通常可以仅通过手术治愈，但更晚期的nsclc可能更难治疗，因为标准的癌症治疗(诸如化学疗法)不是很有效。但近年来，新型免疫疗法和靶向疗法已经改变了这种疾病的治疗，并且许多新治疗在治疗晚期nsclc中显示出巨大的希望。
13.分子靶向治疗(例如小分子和单克隆抗体)的开发显著改善了nsclc患者的转移环境中的结果，这些患者的肿瘤携带活化的癌基因诸如表皮生长因子受体(egfr)和易位基因如间变性淋巴瘤激酶(alk)。此外，免疫检查点抑制剂已经成功用于治疗nsclc。该疗法基于t淋巴细胞对抗肿瘤免疫至关重要的事实，并且这种抗肿瘤免疫需要在共刺激激活的情况下由抗原特异性t细胞受体激活。导致负共刺激分子(“检查点”)表达的天然存在的反馈机
制正在防止过度的免疫激活。此类检查点的实例是细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)、程序性死亡1(pd-1)、t细胞免疫球蛋白3和淋巴细胞激活基因3。针对这些检查点的抗体可以恢复或增强抗肿瘤免疫应答并在晚期或转移性nsclc患者中产生肿瘤响应。此类抗体的实例是针对pd-1的抗体(诸如纳武单抗(例如opdivo
tm
)、派姆单抗(例如keytruda
tm
)或度伐鲁单抗(例如imfinzi
tm
))或针对pd-l1的抗体(诸如阿特朱单抗(例如tecentriq
tm
)、阿维鲁单抗(例如bacencio
tm
)和西米普利单抗(例如libtayo
tm
))。
14.特别是iv期nsclc很难治愈，因为它们已经扩散到远处的淋巴结或身体的其他区域。虽然通常可以通过手术除去或通过放射疗法治疗肺部肿瘤，但无法除去的内部器官转移可以通过放射、免疫疗法、靶向治疗或化学疗法进行治疗。检查点抑制剂可以单独使用或组合使用。不过，并非所有患者均对这些疗法有响应。约20-50％用检查点抑制剂治疗的患者对这种药物有响应。
15.不幸的是，大多数抗肿瘤治疗与不期望副作用，诸如严重的恶心、呕吐或严重乏力相关联。此外，虽然抗肿瘤治疗已经成功，但它们并没有在所有接受它们的患者中产生显著的临床响应，从而导致不期望副作用、延误和与无效治疗相关的成本。因此，非常需要可以用于在施用抗肿瘤剂之前预测受试者对抗肿瘤剂的响应的生物标志物。
16.鉴于nsclc的高发生率和当前治疗的有限疗效，需要免疫肿瘤疗法预测nsclc生物标志物和免疫肿瘤疗法预测nsclc生物标志物的测定法。
17.此外，作为治疗响应的准确早期指标的nsclc生物标志物测定法通常需要进行肺组织活检，这被认为对患者来说非常不愉快。
18.鉴于上述情况，仍然迫切需要改良方法，以快速且准确地预测诊断患有nsclc的患者对靶向药物疗法，以及特别是免疫肿瘤学的响应。


技术实现要素：

19.个体之间的药物响应不同。药物可以或多或少会其作用；但也可以诱发不良药物反应、毒性和副作用。
20.本发明提供了能够通过测量来自诊断患有nsclc的患者的样品的激酶活性来确定所述患者对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂(ici)的响应的方法和装置。
21.第一个方面提供了用于确定或预测诊断患有非小细胞肺癌(nsclc)的患者对药物的响应的方法，其包括以下步骤：
22.(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0023]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0024]-src激酶家族的至少一种激酶；和
[0025]-syk激酶家族的至少一种激酶，的激酶活性，从而提供所述血液样品的激酶活性谱；和
[0026]
(b)从所述激酶活性谱确定所述患者对所述药物的响应；
[0027]
其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂；并
[0028]
其中所述血液样品包括外周血单核细胞。
[0029]
在特定实施方案中，
[0030]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶选自flt1、flt3、flt4、csf-1r、kit、
pdgfralpha(即pdgfrα)、pdgfrbeta(即pdgfrβ)和kdr；优选选自flt1、flt3和flt4；
[0031]-src激酶家族的至少一种激酶选自src、blk、lck、fyn、yes、brk、fgr、hck、lyn、frk和srms；优选选自src、blk、lck、fyn和yes；和/或
[0032]-syk激酶家族的至少一种激酶选自syk和zap70。
[0033]
在特定实施方案中，所述方法进一步包括测量jak2、her4和/或trkb的激酶活性。
[0034]
在特定实施方案中，所述方法包括测量flt1、flt3、flt4、src、blk、lck、fyn、yes、syk、zap70、jak2、her4和trkb的激酶活性。
[0035]
在特定的实施方案中，所述药物选自纳武单抗、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗和西米普利单抗，优选选自纳武单抗和派姆单抗。
[0036]
在特定实施方案中，步骤(b)包括步骤(i)从所述激酶活性谱计算分类器参数；以及步骤(ii)基于所述分类器参数确定所述患者对所述药物的响应。
[0037]
在特定实施方案中，步骤(b)包括步骤(i)将所述激酶活性谱与第一和第二参考激酶活性谱进行比较；所述第一参考激酶活性谱代表对所述药物的良好响应者，并且所述第二参考激酶活性谱代表对所述药物的不良响应者；以及步骤(ii)基于所述激酶活性谱与所述第一和所述第二参考激酶活性谱的比较来确定所述患者对所述药物的响应。
[0038]
在特定实施方案中，在步骤(a)中，通过使样品与至少一种蛋白激酶底物接触来确定所述激酶活性，从而提供所述样品的磷酸化谱，所述磷酸化谱包括表2中所列的所有93个肽标志物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
[0039]
在特定实施方案中，所述激酶活性谱或所述分类器参数指示所述患者对所述药物的良好响应、不良响应或未确定的响应。
[0040]
在特定实施方案中，所述非小细胞肺癌是iii期或iv期非小细胞肺癌。
[0041]
进一步的方面提供了如本文教导的方法用于评估患有非小细胞肺癌的患者对药物的易感性的用途，其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂。
[0042]
一个另外的方面提供了如本文教导的方法用于评估药物的药学或临床价值的用途，其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂。
[0043]
一个另外方面提供了用于确定诊断患有非小细胞肺癌的患者对药物的响应的试剂盒，其包括用于测量从诊断患有非小细胞肺癌(nsclc)的所述患者获得的血液样品中的
[0044]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；优选选自flt1、flt3、flt4、csf-1r、kit、pdgfrα、pdgfrβ和kdr；更优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0045]-src激酶家族的至少一种激酶；优选选自src、blk、lck、fyn、yes、brk、fgr、hck、lyn、frk和srms；更优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；和
[0046]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶的激酶活性的工具；以及
[0047]
计算机可读存储介质，其上记录有用于执行本文教导的方法的一个或多个程序；
[0048]
其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂；并且
[0049]
其中所述血液样品包括外周血单核细胞。
[0050]
在特定实施方案中，用于测量
[0051]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0052]-src激酶家族的至少一种激酶；和
[0053]-syk激酶家族的至少一种激酶的激酶活性的工具是包含表2中所列的所有93种肽标志物的至少一个阵列。
[0054]
一个另外的方面提供了计算机程序产品，其与具有处理器和连接到所述处理器的存储器的计算机结合使用，所述计算机程序产品包括其上编码有计算机程序机制的计算机可读存储介质，其中所述计算机程序机制被加载到所述计算机的存储器并且引起所述计算机执行如本文所教导的方法。
[0055]
这些和进一步的方面和实施方案在以下部分和权利要求中描述。
附图说明
[0056]
图1.在抗pd1免疫检查点抑制剂(ici)治疗时早期进展患者与晚期/无进展患者之间的差异激酶活性谱。该图显示了每个肽的早期进展组和晚期/无进展组之间的差异delta。误差线指示该差异的95％置信区间。delta》0表示晚期/无进展组的底物磷酸化较高，而delta《0表示早期进展组的底物磷酸化较高。肽标志物的名称(“肽id”)是指相关的蛋白质以及氨基酸序列的起始和结束位置。
[0057]
图2.(a)个体患者激酶活性谱的类别预测分析。使用r中的弹性网建模(glmnet)来训练预测模型，以将患者分配到早期进展或晚期/无进展类别。显示的是通过20倍交叉验证获得的每个包括的患者属于晚期/无进展类别的预测可能性p(l/n)。条的填充颜色表示如图例所示的已知的患者类别。可以看出，实际早期进展的患者(“黑色条”)倾向于具有比实际晚期/无进展的患者(“白色条”)更低的属于晚期/无进展组的预测可能性p(l/n)。(b).显示“预测的低风险”组中的患者(虚线，p(l/n)》0.5)相对“预测的高风险”组中的患者(实线，p(l/n)≤0.5)的无进展生存(pfs)的kaplan meier图。“预测的高风险”组显示出显著较差的pfs(中位pfs 56相对246天，p＝0.02)。
[0058]
图3.鉴定负责早期进展组和晚期/无进展组之间的图1的肽的差异磷酸化的推定上游激酶的分析。x轴上的正值指示在分析中，相关激酶的活性在晚期/无进展组中更高。星号指示表1中所列的激酶。
[0059]
图4.比较早期进展与晚期/无进展的患者的nsclc队列的系统发育树构建。圆圈的大小代表效应大小。
[0060]
发明详述
[0061]
在描述本发明中使用的本方法和装置之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法、组分或装置，因为这些方法、组分或装置当然可以变化。还应理解，本文使用的术语并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
[0062]
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
[0063]
在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。
[0064]
如本文所用，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包容性或开放式的，不排除额外的、非列举的成员、元素或方法步骤。
[0065]
术语“包含”还包括术语“由...组成”。
[0066]
如本文所用，术语“约”当指可测量的值诸如参数、量、时距等，意指涵盖相比指定值 /-10％或更小、优选地 /-5％或更小，更优选地 /-1％或更小，并且还更优选地 /-0.1％或更小的变化，只要此类变化适合在所公开的发明中执行。应当理解，修饰语“约”所指的值本身也具体地且优选地公开。
[0067]
由端点所列举的数值范围包括包含在相应范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。
[0068]
本发明提供了能够通过测量从诊断患有nsclc的患者获得的血液样品的激酶活性来确定所述诊断患有nsclc的患者对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的响应的方法和装置。本发明进一步显示了可以如何使用该方法和装置来预测诊断患有nsclc的患者对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的响应和/或抗性，尤其是响应。因此，本发明的方法增加了目前用于在nsclc患者中选择疗法的现有测定法。
[0069]
可以使用根据本发明的方法以预测或评估对药物的原发性和继发性抗性，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的抗性。原发性抗性意指对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂从不响应的nsclc患者中的抗性。继发性抗性意指首先对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂有响应，但在几个月或几年后出现抗性的nsclc患者中的抗性。
[0070]
出于本发明的目的，并且如本文所用，术语“激酶活性”或“蛋白激酶活性”是指在测定过程中通过作用于底物的一定量的激酶或蛋白激酶形成一种或多种反应产物。
[0071]
蛋白激酶活性是指蛋白激酶的活性。蛋白激酶是将磷酸转移到蛋白质上的所有酶的通用名称。约2％的人基因组含有用于形成蛋白激酶的转录信息。目前，有约518种已知的不同蛋白激酶。然而，由于3％到4％的人基因组是形成蛋白激酶的密码，因此人体中可能有更多的不同激酶。
[0072]
蛋白激酶是一种通过将磷酸基团与其它蛋白质共价偶联来修饰该其它蛋白质的激酶。该过程或活性也称为磷酸化。因此，磷酸化可以视为将磷酸基团添加到底物上的过程。磷酸化通常通过改变激酶活性、细胞位置或与其他蛋白质的缔合而导致底物的功能变化。高达30％的所有蛋白质可以经激酶活性修饰，并且已知激酶调节大多数细胞途径，尤其是参与信号转导(细胞内信号传递)的途径。激酶的化学活性涉及从atp或gtp中除去磷酸基团，并将其共价附接至具有游离羟基的氨基酸诸如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸。大多数已知的激酶作用于丝氨酸和苏氨酸两者，其他激酶作用于酪氨酸，还有一些作用于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
[0073]
用本发明的方法监测的蛋白激酶活性优选针对作用于丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸，优选作用于丝氨酸和苏氨酸两者，作用于酪氨酸或作用于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的蛋白激酶，并且如果优选地针对作用于酪氨酸的蛋白激酶，则更优选本发明的方法。
[0074]
蛋白激酶通过它们在离散序列上磷酸化底物的能力来区分。这些序列已经通过对磷酸化位点附近的氨基酸进行测序来确定，并且对于每种蛋白激酶通常是不同的。每种底物上的识别序列对每种激酶催化剂具有特异性。
[0075]
因为蛋白激酶对细胞具有深远的影响，它们的活性受到高度调节。通过例如磷酸化、通过激活蛋白或抑制蛋白或小分子的结合、或通过控制激酶在细胞中相对于它们的底
物的位置来打开或关闭激酶。去调节的活性是疾病尤其是癌症的常见原因，其中激酶调节控制细胞生长、运动和死亡的许多方面。激酶还在免疫系统细胞的激活中发挥重要作用(例如参见weiss a.,kinases and phosphatases of the immune system,immunological reviews 2009,vol.228:5-8)。因此，监测组织中的蛋白激酶活性可能非常重要，并且在比较不同组织样品的激酶活性时可以获得大量信息。
[0076]
如本发明所述，发明人惊讶地发现诊断患有nsclc的患者对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的响应，可以基于从所述诊断患有nsclc的患者采集的血液样品的激酶活性，优选蛋白激酶活性的测量进行预测和/或确定。根据本发明的方法能够提供关于靶向药物疗法治疗的功效的信息，并且更具体地提供对nsclc患者最合适治疗的早期确定。优选地，激酶活性的测量通过将来自诊断患有nsclc的患者的血液样品与一种或多种激酶底物，优选蛋白激酶底物接触，从而生成一种或多种磷酸化谱来进行。如本文所用，所述蛋白激酶底物优选是肽、蛋白质或肽模拟物。蛋白激酶底物各自包含，优选地一个或多个，可以被样品中存在的蛋白激酶磷酸化的磷酸化位点。因此，将蛋白激酶底物暴露于包含蛋白激酶的样品导致蛋白激酶底物的磷酸化位点中的一个或多个的磷酸化。可以使用本领域已知的技术测量这种磷酸化活性。因此，在特定实施方案中，在测量方法期间，样品中存在的激酶将磷酸化一种或多种蛋白激酶底物上的磷酸化位点，优选该磷酸化位点中的一个或多个。
[0077]
本发明人已经观察到对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂具有不同响应的nsclc肿瘤的激酶活性之间的本质差异。更具体地，本发明人惊讶地发现，
[0078]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的至少一种激酶；
[0079]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的至少一种激酶；
[0080]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk的至少一种激酶；和
[0081]-任选地选自jak2、her4和trkb的至少一种激酶，的异常活性可以特别用于预测诊断患有nsclc的患者对药物，更特别是对pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的响应。
[0082]
例如，来自患有nsclc的患者的血液样品中存在的
[0083]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的至少一种激酶；
[0084]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的至少一种激酶；和
[0085]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的至少一种激酶
[0086]
将不同地磷酸化蛋白激酶底物，这取决于对患者预期治疗或正在治疗的药物的响应。因此，血液样品之间的磷酸化信号不同，导致磷酸化模式取决于对药物的响应而不同。
[0087]
出于本发明的目的，如本文所用，术语“药物疗法”或“药物治疗学”或“药物治疗”是指使用药品，也称为药物或药剂，其中所述药物疗法旨在用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防。
[0088]
从诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0089]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的至少一种
激酶；
[0090]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的至少一种激酶；和
[0091]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的至少一种激酶的激酶活性可以充当受试者治疗响应的准确早期指标，以测量候选nsclc抑制剂，更特别是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的有效性。
[0092]
因此，第一方面提供了用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法，其包括以下步骤：
[0093]
(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0094]-血管内皮生长因子受体(vegfr)或血小板衍生生长因子受体(pdgfr)激酶家族的至少一种激酶；
[0095]-src激酶家族的至少一种激酶；和
[0096]-脾酪氨酸激酶(syk)激酶家族的至少一种激酶，的激酶活性，从而提供所述血液样品的激酶活性谱；和
[0097]
(b)从所述激酶活性谱确定所述患者对所述药物的响应；
[0098]
其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂；和
[0099]
其中所述血液样品包括外周血单核细胞。
[0100]
换言之，本文提供了用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的敏感性(其也可以表示为响应性或易感性)或抗性(其也可以表示为无响应性或不易感性)的方法，其包括以下步骤：
[0101]
(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0102]-血管内皮生长因子受体(vegfr)或血小板衍生生长因子受体(pdgfr)激酶家族的至少一种激酶；
[0103]-src激酶家族的至少一种激酶；和
[0104]-脾酪氨酸激酶(syk)激酶家族的至少一种激酶，的激酶活性，从而提供所述血液样品的激酶活性谱；和
[0105]
(b)从所述激酶活性谱确定所述患者对所述药物的敏感性或抗性；
[0106]
其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂；和
[0107]
其中所述血液样品包括外周血单核细胞。
[0108]
在某些实施方案中，本文教导的方法或用途可用于预测在诊断患有nsclc的患者中用pd-1或pd-l1 ici治疗的结果。
[0109]
短语“确定响应”和“预测响应”在本文中可以互换使用。
[0110]
如本文所用，术语“预测”、“预测”或“预测性”具有它们普遍接受的含义，并且优选地是指患者对疗法的响应或反应的预先声明、指示或预示，优选地其中所述患者没有(尚未)用该疗法治疗。例如，预测患者对药物治疗的敏感性(或响应性或易感性)可能表明，例如在特定时间段内，受试者将对治疗有响应或反应，例如，使得患者将具有来自治疗的临床益处(例如，将显示肿瘤负荷减少，或将显示完全或部分响应，将显示疾病稳定至少90天的时间，将显示晚期(140天后)或无疾病进展)。在诊断患有nsclc的患者中对药物治疗的不敏感性(或无响应性或不易感性或抗性)的预测可以表明，例如在特定时间段内该患者将对治
疗有最小或无响应或反应，例如，使得患者将不具有来自治疗的临床益处(例如，将不显示出治疗上有意义的肿瘤负荷减少，将显示疾病进展，将显示早期(140天内)疾病进展)。
[0111]
在某些实施方案中，所述诊断患有nsclc的患者对所述药物的响应是在用所述药物治疗后疾病进展的时间，其中良好响应者在用所述药物治疗后具有疾病的晚期进展(例如，在用所述药物治疗后超过140天)或无进展，不良响应者在用所述药物治疗后具有疾病的早期进展(例如，在用所述药物治疗后小于140天)。
[0112]
术语“敏感性”、“响应性”或“易感性”在本文中可以互换使用，具有其普遍接受的含义，优选指使诊断患有nsclc的患者偏向于对pd-1或pd-l1 ici治疗敏感或反应的特质。优选地，如果受试者将具有来自治疗的临床益处，则患者对用pd-1或pd-l1 ici的治疗是“敏感的”、“有响应的”或“易感的”(这些术语可以互换使用)。优选地，如果与不存在与pd-1或pd-l1 ici接触的情况下赘生性组织的增殖率相比，赘生性组织的增殖率由于与治疗有效量的pd-1或pd-l1 ici接触而受到抑制，则赘生性组织，诸如肿瘤，对用抗赘生剂的治疗是“敏感的”、“有响应的”或“易感的”。
[0113]
术语“不敏感性”、“无响应性”、“不易感性”或“抗性”在本文中可以互换使用，具有它们普遍接受的含义，并且优选地是指使诊断患有nsclc的患者偏向于对pd-1或pd-l1 ici治疗有最小(例如临床上不显著)或无响应的特质。优选地，如果患者将不具有来自治疗的临床益处，则患者对pd-1或pd-l1ici治疗是“不敏感的”、“无响应的”、“不易感的”或“抗性的”(这些术语可以互换使用)。优选地，如果与不存在与pd-1或pd-l1 ici接触的情况下的赘生性组织的增殖率相比，赘生性组织的增殖率由于与pd-1或pd-l1 ici接触而未受到抑制或在非常低(例如治疗上不显著)程度上受到抑制，则赘生性组织，包括肿瘤，对用pd-1或pd-l1 ici的治疗是“不敏感的”、“无响应的”、“不易感的”或“抗性的”。
[0114]
如本文所公开的方法可以允许对诊断患有nsclc的患者将对pd-1或pd-l1 ici的治疗有响应或将对pd-1或pd-l1 ici的治疗无响应做出预测。在某些实施方案中，这可以包括预测患有nsclc的患者将具有相对低的对pd-1或pd-l1 ici治疗有响应的可能性(例如，小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％)；或者患有nsclc的患者将具有相对高的对pd-1或pd-l1 ici治疗有响应(或成为响应者)的可能性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。
[0115]
目前评估激酶活性以提供有关患者对pd-1或pd-l1 ici响应性的信息的方法通常在体外对从患者获得的血液样品进行。术语“体外”具有其普遍接受的含义并且优选地表示在动物或人体外部或之外。术语“离体”具有其普遍接受的含义并且优选地是指从动物或人体移除并在体外，例如在培养容器中维持或繁殖的组织或细胞。优选地，如本文所用，术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“体内”具有其普遍接受的含义并且优选地表示动物或人体内部、之上或之内。
[0116]
如本文所用，术语“vegfr激酶家族”是指跨膜蛋白家族，即受体酪氨酸激酶，其将信号从细胞外环境转导至细胞质和细胞核。
[0117]
如本文所用，术语“pdgfr激酶家族”是指跨膜蛋白家族，即受体酪氨酸激酶，其将信号从细胞外环境转导至细胞质和细胞核。
[0118]
如本文所用，术语“src激酶家族”是指家族蛋白质，即非受体酪氨酸激酶，其在细胞质中转导信号。
[0119]
如本文所用，术语“syk激酶家族”是指蛋白质家族，即非受体酪氨酸激酶，其在细胞质中转导信号。
[0120]
vegfr或pdgfr激酶家族的激酶的示例性人(智人)成员包括：
[0121]-具有uniprotid p17948的fms样酪氨酸激酶1(flt1)(即vegfr家族)，
[0122]-具有uniprotid p36888的fms样酪氨酸激酶3(flt3)(即pdgfr家族)，
[0123]-具有uniprotid p35916的fms样酪氨酸激酶4(flt4)(即vegfr家族)，
[0124]-具有uniprotid p07333的巨噬细胞集落刺激因子1受体(csf-1r)(即pdgfr家族)，
[0125]-具有uniprotid p10721的肥大/干细胞生长因子受体kit(kit)(即pdgfr家族)，
[0126]-具有uniprotid p16234的血小板衍生生长因子受体α(pdgfrα)(即pdgfr家族)，
[0127]-具有uniprotid p09619的血小板衍生生长因子受体β(pdgfrβ)(即pdgfr家族)，以及
[0128]-具有uniprotid p35968的激酶插入域受体(kdr)(即vegfr家族)。
[0129]
此外，src激酶家族的激酶的示例性人(智人)成员包括：
[0130]-具有uniprotid p12931的原癌基因酪氨酸蛋白激酶src(src)，
[0131]-具有uniprotid p51451的b淋巴细胞激酶(blk)，
[0132]-具有uniprotid p06239的白细胞c端src激酶(lck)，
[0133]-具有uniprotid p06241的原癌基因c-fyn(fyn)，
[0134]-具有uniprotid p07947的酪氨酸蛋白激酶yes(yes)，
[0135]-具有uniprotid q13882的乳腺肿瘤激酶(brk)，
[0136]-具有uniprotid p09769的fgr，
[0137]-具有uniprotid p08631的造血细胞激酶(hck)，
[0138]-具有uniprotid p07948的lyn，
[0139]-具有uniprotid p42685的fyn相关激酶(frk)，和
[0140]-具有uniprotid q9h3y6的srms。
[0141]
此外，syk激酶家族的激酶的示例性人(智人)成员包括：
[0142]-具有uniprotid p43405的脾酪氨酸激酶(syk)，和
[0143]-具有uniprotid p43403的70kdaζ链相关蛋白(zap70)。
[0144]
在特定实施方案中，
[0145]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶选自fms样酪氨酸激酶1(flt1)、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、fms样酪氨酸激酶4(flt4)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(csf-1r)、肥大/干细胞生长因子受体kit(kit)、血小板衍生生长因子受体α(pdgfrα)、血小板衍生生长因子受体β(pdgfrβ)和激酶插入域受体(kdr)；优选地，vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶选自flt1、flt3和flt4；
[0146]-src激酶家族的至少一种激酶选自原癌基因酪氨酸蛋白激酶src(src)、b淋巴细胞激酶(blk)、白细胞c端src激酶(lck)、原癌基因c-fyn(fyn)、酪氨酸蛋白激酶yes(yes)、乳腺肿瘤激酶(brk)、fgr、造血细胞激酶(hck)、lyn、fyn相关激酶(frk)和srms；优选地，src激酶家族的至少一种激酶选自src、blk、lck、fyn和yes，和/或
[0147]-syk激酶家族的至少一种激酶选自脾酪氨酸激酶(syk)和70kdaζ链相关蛋白
(zap70)。
[0148]
在特定实施方案中，用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法包括测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0149]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种激酶；优选选自flt1、flt3、flt4、csf-1r、kit、pdgfrα、pdgfrβ和kdr的vegfr或pdgfr激酶家族的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或所有八种激酶；更优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少两种，优选所有三种激酶；
[0150]-src激酶家族的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或至少十一种激酶；优选选自src、blk、lck、fyn、yes、brk、fgr、hck、lyn、frk和srms的src激酶家族的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或所有十一种激酶；更优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少两种、至少三种、至少四种或所有五种激酶；和
[0151]-syk激酶家族的至少一种或至少两种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的两种激酶，
[0152]
的集激酶活性。
[0153]
在更特定的实施方案中，用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法包括测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的flt1、flt3、flt4、src、blk、lck、fyn、yes、syk和zap70的激酶活性。
[0154]
在特定的实施方案中，用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法进一步包括测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的janus激酶2(jak2)、酪氨酸激酶型细胞表面受体her4(her4)和/或原肌球蛋白相关激酶b(trkb)的激酶活性。
[0155]
在特定的实施方案中，用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法包括测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的如表1中所列的flt1、flt3、flt4、src、blk、lck、fyn、yes、syk、zap70、jak2、her4和trkb的激酶活性。
[0156]
在特定的实施方案中，用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法包括测量如表1中所列的至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种，优选所有13种激酶。
[0157]
表1：用于预测诊断患有nsclc的患者对pd-1或pd-1l免疫检查点抑制剂的响应的13种激酶的列表。
[0158]
激酶flt1flt3flt4jak2her4trkbsrcblk
lckfynyessykzap70
[0159]
表1中所列激酶的示例性人(智人)成员包括：
[0160]-具有uniprotid p17948的fms样酪氨酸激酶1(flt1)，
[0161]-具有uniprotid p36888的fms样酪氨酸激酶3(flt3)，
[0162]-具有uniprotid p35916的fms样酪氨酸激酶4(flt4)，
[0163]-具有uniprotid o60674的janus激酶2(jak2)，
[0164]-具有uniprotid q15303的酪氨酸激酶型细胞表面受体her4(her4)，
[0165]-具有uniprotid q16620的原肌球蛋白相关激酶b(trkb)，
[0166]-具有uniprotid p12931的原癌基因酪氨酸蛋白激酶src(src)，
[0167]-具有uniprotid p51451的b淋巴细胞激酶(blk)，
[0168]-具有uniprotid p06239的白细胞c端src激酶(lck)，
[0169]-具有uniprotid p06241的原癌基因c-fyn(fyn)，
[0170]-具有uniprotid p07947的酪氨酸蛋白激酶yes(yes)，
[0171]-具有uniprotid p43405的脾酪氨酸激酶(syk)，和
[0172]-具有uniprotid p43403的70kdaζ链相关蛋白(zap70)。
[0173]
提及任何标志物，包括任何激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸，对应于在本领域中各自名称下通常已知的标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质、核酸。该术语涵盖发现的任何生物体，特别是动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，还更优选哺乳动物，包括人和非人哺乳动物，更优选人，的此类标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸。该术语特别涵盖具有天然序列的此类标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸，即其一级序列与在自然界中发现或衍生自自然界的标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸的一级序列相同。本领域技术人员理解，不同物种之间的天然序列由于这些物种之间的遗传差异而可能不同。此外，由于给定物种内的正常遗传多样性(变异)，天然序列可能在同一物种的不同个体之间或内部不同。此外，由于转录后或翻译后修饰，天然序列可能在同一物种的不同个体之间甚至内部不同。标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸的任何此类变体或同工型均在本文中意指。因此，认为在自然界中发现或衍生自自然界的标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸的所有序列是“天然的”。术语涵盖当形成活体、器官、组织或细胞的部分时，当形成生物样品的部分时，以及当至少部分地从此类来源分离时的标志物、激酶、肽、多肽、蛋白质或核酸。
[0174]
在特定实施方案中，用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法进一步包括测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的rtk的tam家族的至少一个成员，优选由mer原癌基因、酪氨酸激酶(mertk)、tyro3蛋白酪氨酸激酶(tyro3)和axl受体酪氨酸激酶(axl)组成的rtk的tam家族成员的组中的至少一个，的激酶活性。
[0175]
在特定实施方案中，该方法包括测量
[0176]-选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0177]-选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；
[0178]-选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶；和
[0179]-rtk的tam家族的至少一种成员，优选选自mertk、tyro3和axl的rtk的tam家族的至少一种成员的激酶活性。
[0180]
在特定实施方案中，该方法包括测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0181]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0182]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；
[0183]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶；
[0184]-选自jak2、her4和trkb的至少一种激酶；和
[0185]-rtk的tam家族的至少一种成员，优选选自mertk、tyro3和axl的rtk的tam家族的至少一种成员
[0186]
的激酶活性。
[0187]
如本文所用，术语“受体酪氨酸激酶的tam家族”是指跨膜蛋白家族，即受体酪氨酸激酶，其将信号从细胞外环境转导至细胞质和细胞核。rtk的tam家族与其他rtk家族的区别在于激酶域(胞质区)内的保守氨基酸序列kw(i/l)a(i/l)es。胞外区中的黏附分子样域也具有保守序列。rtk的tam家族成员的非限制性实例包括mertk、tyro-3和也称为ufo的axl。
[0188]
rtk的tam家族的示例性人(智人)成员包括
[0189]-具有swissprot条目或uniprotid p30530的axl受体酪氨酸激酶；
[0190]-具有swissprot条目或uniprotid q12866的mer原癌基因酪氨酸激酶；和
[0191]-具有swissprot条目或uniprotid:q06418的tyro3蛋白酪氨酸激酶。
[0192]
技术人员将理解，当根据本文教导的方法确定其活性的激酶的数量增加时，将增加根据本发明的方法的特异性、精确性和灵敏性。当使用表1中所列的所有激酶，任选地与选自mertk、tyro3和axl的rtk的tam家族的至少一个成员组合的激酶活性时，将获得最高的方法精确性。
[0193]
本领域技术人员将理解以下激酶的激酶活性的测定：
[0194]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0195]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；
[0196]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶；
[0197]-任选地选自jak2、her4和trkb的至少一种激酶；和
[0198]-任选地rtk的tam家族的至少一种成员，优选选自mertk、tyro3和axl的rtk的tam家族的至少一种成员，
[0199]
提供了所述样品的激酶活性谱或激酶活性签名。
[0200]
如本发明中所用，术语“激酶活性谱”或“激酶活性签名”是指代表存在于样品中的
(优选一种或多种)激酶的激酶活性(存在、不存在和/或数量，优选数量)的数据集。当在不同的测试条件下确定如本文教导的测定激酶的活性时，(诸如例如通过在存在和不存在激酶活性调控化合物或药物(例如激酶抑制剂)的情况下比较样品的激酶活性)也可以生成激酶活性谱。更频繁地，将通过在相同实验中或在相继实施的实验中测定本文教导的所有激酶的激酶活性来测量样品的激酶活性谱。
[0201]
如本技术中所述，nsclc是肺癌的主要类型之一，且约占所有肺癌的85％。nsclc可以进一步分为三种亚型，即鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。腺癌是最常见的类型，并开始于在气道内衬的粘液形成腺细胞，鳞状细胞癌在覆盖气道表面的扁平细胞中形成并在肺中心附近生长，大细胞癌在显微镜下看起来大且圆。其他不太常见的nsclc类型是多形性、类癌瘤、唾液腺癌和未分类癌。
[0202]
如本发明中所用，术语“样品”是指从生物体(患者)诸如人或从这种生物体的组分(例如组织或细胞)获得的样品。认为血液是特殊形式的结缔组织。因此，样品可以是血液样品。认为肺组织活检对患者来说是不愉快的。因此，优选nsclc肿瘤组织样品以外的其他样品，诸如血液样品。
[0203]
在特定实施方案中，所述样品衍生自外周血，或从外周血中分离或富集的免疫细胞(例如，外周血单核细胞，pbmc)。在更特定的实施方案中，所述样品是从所述患者获得的包含外周血单核细胞(pbmc)的血液样品。所述样品优选为新鲜或新鲜冷冻样品。更优选地，所述样品是指血液衍生的pbmc的裂解物，其优选通过ficoll-isopaque密度离心或通过本领域已知的任何方法分离。
[0204]
在本发明的优选实施方案中，所述样品是在根据本发明的方法的步骤之前已经经历制备步骤的样品。优选地，所述制备步骤是其中存在于所述样品中的蛋白激酶通过裂解从组织中释放的步骤。另外，样品中的激酶可以是稳定的、维持的、富集的或分离的，并且如步骤(a)中进行的激酶活性的测量发生在富集或分离的蛋白激酶样品上。通过首先富集样品中的蛋白激酶或从样品中分离蛋白激酶，激酶活性的后续测量将以更有效和可靠的方式发生。此外，由于在富集或分离步骤过程中除去了某些污染物，所获得的磷酸化信号的清晰度和强度也会增加。
[0205]
在特定实施方案中，所述样品获得自诊断患有nsclc并且一线疗法(例如基于铂的疗法)难治的患者。
[0206]
在特定实施方案中，所述样品获得自在用二线疗法(例如pd-1免疫检查点抑制剂或pd-l1免疫检查点抑制剂和/或其组合和/或其类似物，优选纳武利尤单抗)开始治疗之前诊断患有nsclc的患者。
[0207]
在特定实施方案中，本文教导的用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法的步骤(b)(即，从所述激酶活性谱确定所述患者对所述药物的响应的步骤)包括步骤(i.1)将所述激酶活性谱与第一和第二参考激酶活性谱进行比较；所述第一参考激酶活性谱代表所述药物的良好响应者，并且所述第二参考激酶活性谱代表所述药物的不良响应者；以及步骤(ii.1)基于所述激酶活性谱与所述第一和所述第二参考激酶活性谱的比较来确定所述患者对所述药物的响应。
[0208]
因此，在具体实施方案中，本发明涉及用于预测诊断患有nsclc癌症的患者对药物的响应的方法，其包括以下步骤：
[0209]
(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0210]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0211]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；和
[0212]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶的激酶活性，从而提供所述血液样品的激酶活性谱；
[0213]
(i.1)将所述激酶活性谱与第一和第二参考激酶活性谱进行比较；所述第一参考激酶活性谱代表所述药物的良好响应者，并且所述第二参考激酶活性谱代表所述药物的不良响应者；以及
[0214]
(ii.1)基于所述激酶活性谱与所述第一和所述第二参考激酶活性谱的比较来确定所述患者对所述药物的响应。
[0215]
在进一步的特定实施方案中，本文教导的用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法包括以下步骤：
[0216]
(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的所述
[0217]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0218]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；和
[0219]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶的激酶活性(即不存在、存在和/或水平，优选水平)，从而提供所述血液样品的激酶活性谱；
[0220]
(i.2)将所述激酶活性谱与参考激酶活性谱进行比较，所述参考激酶活性谱表示代表所述药物的良好响应者或不良响应者的激酶活性谱；
[0221]
(ii.2)发现(a)中确定的激酶活性谱与所述参考激酶活性谱有偏差或无偏差；和
[0222]
(iii.2)将所述偏差或无偏差的发现归因于所述诊断患有nsclc的患者对所述药物的特定响应。
[0223]
在特定实施方案中，从所述激酶活性谱预测所述患者对用所述pd-1或pd-l1 ici治疗的响应的步骤(b)包括步骤(i.3)将所述激酶活性谱与参考激酶谱进行比较；所述参考激酶活性谱表示对所述pd-1或pd-l1 ici的已知敏感性(或响应性或易感性)；以及步骤(ii.3)基于所述激酶活性谱与所述参考激酶活性谱的比较来预测所述患者对所述pd-1或pd-l1 ici的响应。
[0224]
例如，参考激酶活性谱可能代表患者中对pd-1或pd-l1 ici治疗的已知敏感性，诸如患者将对pd-1或pd-l1 ici治疗敏感的测定结果，或患者将对pd-1或pd-l1 ici治疗有抗性的测定结果。在另一个实例中，参考激酶活性谱可以代表对用pd-1或pd-l1 ici治疗的响应者或对用pd-1或pd-l1 ici治疗的无响应者。在又一个实例中，参考激酶活性谱可以代表患者对用pd-1或pd-l1 ici治疗的某种程度的敏感性的测定结果。
[0225]
在特定实施方案中，所述参考激酶活性谱表示参考受试者接受所述pd-1或pd-l1 ici治疗的已知敏感性(或响应性或易感性)。在特定实施方案中，所述参考激酶活性谱可以
对应于来自一个或多个参考受试者的包含外周血单核细胞的血液样品中的激酶活性谱，该参考受试者对用所述pd-1或pd-l1 ici的治疗敏感(或有响应、易感或为良好响应者)。在特定实施方案中，所述参考激酶活性谱可以对应于来自一个或多个参考受试者的包含外周血单核细胞的血液样品中的激酶活性谱，该参考受试者对用所述pd-1或pd-l1 ici的治疗不敏感(或无响应、不易感或为不良响应者)。
[0226]
可以根据已知规程建立参考激酶活性谱。例如，可以在参考受试者或个体或个体群体中建立参考激酶活性谱，所述参考受试者或个体或个体群体的特征在于对用pd-1或pd-l1 ici治疗的敏感性(或响应性)的特定测定(即，对于所述参考受试者或个体或个体群体来说，对用pd-1或pd-l1 ic i治疗的敏感性(或响应性)的所述测定适用)。这样的群体可以包括但不限于2个或更多、10个或更多、100个或更多、或甚至数百或更多个个体。在某些实施方案中，参考受试者是患有相同类型的赘生性疾病(即nsclc)的受试者，例如不比较不同类型的赘生性疾病，和/或具有相同nsclc分期且已经使用相同赘生药剂或包括pd-1或pd-l1 ici在内的赘生药剂治疗的受试者。
[0227]
第一值与第二值的“偏差”通常可以涵盖任何方向(例如，增加：第一值》第二值；或减少：第一值《第二值)和任何程度的改变。
[0228]
例如，相对于与之进行比较的第二值，偏差可以涵盖第一值降低但不限于至少约10％(约0.9倍或更小)，或至少约20％(约0.8倍或更小)，或至少约30％(约0.7倍或更少)，或至少约40％(约0.6倍或更少)，或至少约50％(约0.5倍或更少)，或至少约60％(约0.4倍或更少)，或至少约70％(约0.3倍或更少)，或至少约80％(约0.2倍或更少)，或至少约90％％(约0.1倍或更少)。
[0229]
例如，相对于与之进行比较的第二值，偏差可以涵盖第一值增加但不限于至少约10％(约1.1倍或更多)，或至少约20％(约1.2倍或更多)，或至少约30％(约1.3倍或更多)，或至少约40％(约1.4倍或更多)，或至少约50％(约1.5倍或更多)，或至少约60％(约1.6倍或更多)，或至少约70％(约1.7倍或更多)，或至少约80％(约1.8倍或更多)，或至少约90％(约1.9倍或更多)，或至少约100％(约2倍或更多)，或至少约150％(约2.5倍或更多)，或至少约200％(约3倍或更多)，或至少约500％(约6倍或更多)，或至少约700％(约8倍或更多)或类似。
[0230]
优选地，偏差可以指统计学上显著的观察到的变化。例如，偏差可以是指观察到的变化，其超出给定群体中参考值的误差边缘(例如，通过标准偏差或标准误差或通过其预定倍数表示，例如
±
1xsd或
±
2xsd或
±
3xsd，或者
±
1xse或
±
2xse或
±
3xse)。偏差也可以指超出给定群体中的值所限定的参考范围的值(例如，超出包含所述群体中的值的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥75％或≥80％或≥85％或≥90％或≥95％或甚至≥100％的范围)。
[0231]
在特定实施方案中，如果所述偏差具有p＜0.05的统计学显著性，则可以推断为偏差。
[0232]
在进一步的实施方案中，如果观察到的改变超出给定阈或截断值，则可以推断出偏差。可以如本领域一般已知的那样选择此类阈或截断值，以提供预测方法的选定灵敏性和/或特异性，例如至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％的灵敏性和/或特异性。
[0233]
在特定实施方案中，如本文教导的用于预测诊断患有nsclc的患者对药物的响应的方法的步骤(b)(即，从所述激酶活性谱确定所述患者对所述药物的响应的步骤)包括步骤(i.4)从所述激酶活性谱计算分类器参数；以及步骤(ii.4)基于所述分类器参数确定所述患者对所述药物的响应。
[0234]
因此，在特定实施方案中，本发明涉及用于预测诊断患有nsclc癌症的患者对药物的响应的方法，其包括以下步骤：
[0235]
(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0236]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0237]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；和
[0238]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶的激酶活性，从而提供所述血液样品的激酶活性谱。
[0239]
(i.4)从所述激酶活性谱计算分类器参数；和
[0240]
(ii.4)基于所述分类器参数确定所述患者对所述药物的响应。
[0241]
通过建立用于确定预测nsclc患者的药物疗法响应的分类器参数，本发明的方法提供了用于分析从本发明的方法获得的结果的标准。该标准使人们能够基于单个或有限数量的数据提供预测或预后。提供预测或预后的人不必解释整套数据，而是根据单个或有限数量的标准得出他的结论。
[0242]
如本文所用，术语“分类器参数”是已经通过建立从患有nsclc的患者获得的样品的激酶活性谱和/或磷酸化谱而确定的鉴别值。所述鉴别值鉴定nsclc患者对药物疗法的响应的预测。分类器参数包括关于若干激酶的活性和/或若干蛋白激酶底物的磷酸化水平的信息。分类是其中基于项目固有的一个或多个特征的定量信息(例如样品的激酶活性谱和/或样品的磷酸化水平或谱)并且基于先前标记的项目的训练集(对药物疗法的临床响应)将单个项目分组的规程。分类器参数是通过将“分类器”应用于所测量的样品的激酶活性和/或磷酸化水平来计算的。基于分类参数，将样品分配(或预测属于)至类别(预测所述患者的药物疗法响应)。先前已经通过比较已知属于各个相关类别的样品来确定分类器。本领域已知若干用于开发分类器的方法，其包括神经网络(多层感知器)、支持向量机、k-最近邻、高斯混合模型、朴素贝叶斯、决策树、rbf分类器、随机森林、判别分析、线性判别分析、二次判别分析、判别分析-主成分分析、偏最小二乘判别分析、广义距离回归和弹性网分类。以这种方式确定的分类器参数对于未来的单个测试中的相同实验设置是有效的。
[0243]
为分类器参数给出准确的阈值是不相关的。可以通过关联任何阈值的灵敏性和特异性以及灵敏性/特异性来获得相关阈值。导致高灵敏性的阈值导致较低的特异性，且反之亦然。如果想提高测试的阳性预测值以确定nsclc患者是否将对靶向药物疗法有响应，那么可以改变测试的阈值，而由此将降低确定nsclc患者是否将对靶向药物疗法无响应的测试的阴性预测值。如果想增加测试的阴性预测值以确定nsclc患者是否对靶向药物疗法无响应，那么可以以相反方向改变阈值，而由此将降低确定nsclc患者是否对靶向药物疗法有响应的测试的阳性预测值。
[0244]
因此，由诊断工程师决定哪个水平的阳性预测值/阴性预测值/灵敏性/特异性是
可取的，以及阳性或阴性预测值损失多少是可以容忍的。选择的阈值水平可以取决于诊断工程师结合本方法使用的其他诊断参数。
[0245]
在又一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中如果所述分类器参数高于第一预定阈值水平，则所述分类器参数预测所述患者对所述药物的响应，并且其中如果所述分类器参数低于第二预定阈值水平，则所述分类器参数指示所述患者对所述药物无响应。
[0246]
根据另一个实施方案，本发明涉及本发明的方法，其中所述差异激酶活性水平或所述分类器参数指示所述药物的响应、无响应或未确定或中间预测或所述患者的靶向药物疗法的效果。
[0247]
在更特定的实施方案中，(a)中测定的激酶活性谱表明所述患者对所述药物的良好响应，如果
[0248]-flt3、flt1、flt4、her4、jak2和/或trkb的激酶活性与代表不良响应者的所述激酶的参考激酶活性相比更高；和/或
[0249]-blk、fyn、lck、src、syk和/或zap70的激酶活性与代表不良响应者的所述激酶的参考激酶活性相比更低。
[0250]
或者，在更特定的实施方案中，(a)中测定的激酶活性谱表明所述患者对所述药物的不良响应，如果
[0251]-flt3、flt1、flt4、her4、jak2和/或trkb的激酶活性与代表良好响应者的所述激酶的参考激酶活性相比更低；和/或
[0252]-blk、fyn、lck、src、syk和/或zap70的激酶活性与代表良好响应者的所述激酶的参考激酶活性相比更高。
[0253]
如本技术中所用，nsclc患者对靶向药物疗法的响应的预测通常分为无响应者和响应者两种类型，以及另外一些未确定或中间响应者。对靶向药物疗法响应者将因该治疗而存活更长的时间或具有额外的临床益处(例如提高生活质量、延长无进展生存期等)，而无响应者或对靶向药物疗法形成抗性的患者将不从靶向药物疗法受益。本发明的方法特别能够在靶向药物疗法的响应者(例如完全响应(cr)、部分响应(pr)、疾病稳定(sd))和无响应者(例如疾病进展(pd))之间或用靶向药物疗法后具有疾病的早期(例如开始治疗后《140天)和晚期(例如开始治疗后》140天)进展的患者之间区分开。
[0254]
表1所列的激酶中的至少一种和/或rtk的tam家族的至少一种成员的激酶活性可以通过本领域已知的测定激酶活性的任何方法测定。
[0255]
本领域已知多种方法和格式用于测量样品的激酶活性。
[0256]
可以使用例如宏阵列、微阵列、基于抗体的阵列、质谱(ms)、反相蛋白质阵列、激酶组谱的激酶活性测定(kayak)方法、kinativ平台、珠阵列(例如kinobeads)、pamchip方法、pepscan presto方法、elisa和多重elisa技术、印迹方法、表面等离子共振、毛细管电泳和基于facs的细胞分选来测量激酶和/或整个激酶组的相当大一部分的活化状态。更特别地，可以使用基于抗体的阵列以确定磷酸化蛋白和蛋白激酶的水平；可以使用基于质谱(ms)的方法以研究激酶组的活性；反相蛋白质阵列包括使用细胞裂解物的阵列，这些细胞裂解物固定在阵列平台上，然后用特异性磷酸化抗体进行探测；激酶组谱的激酶活性测定(kayak)方法可以使用由磷酸化位点周围的基序决定的各种蛋白激酶的已知底物偏好；kinativ平
台可以使用特异性珠而拉下可以与ms结合的激酶；kinobeads(即与激酶抑制剂相连的珠)可以充当样品中存在的活化激酶的陷阱；pamchip方法可以使用流通肽微阵列平台分析激酶的活性；pepscanpresto方法可以使用固定在玻璃表面的肽，并使用基于激酶活性的放射性33p掺入进行检测；elisa格式可以允许使用激酶抑制剂中的固定化磷酸特异性抗体对激酶的活性进行高通量筛选；基于facs的细胞分选结合细胞内探针可以鉴定磷酸化蛋白和蛋白激酶。
[0257]
在特定实施方案中，通过使样品与至少一种蛋白激酶底物接触来确定所述激酶活性，从而提供所述样品的磷酸化谱。在更特定的实施方案中，通过使样品与至少一种蛋白激酶底物接触来确定所述激酶活性，从而提供所述样品的磷酸化谱，所述磷酸化谱包括存在于如在表2中所列的所有93个肽标志物中的磷酸化位点的磷酸化水平。
[0258]
如在本发明中使用的，术语“磷酸化谱”是指代表蛋白激酶底物上存在的(优选一个或多个)磷酸化位点的磷酸化水平的数据集。如果本文教导的激酶的激酶活性通过使样品与至少一种蛋白激酶底物接触来确定，则获得特定的磷酸化谱。通过样品中存在的蛋白激酶磷酸化蛋白激酶底物而生成磷酸化谱，磷酸化谱包括所用蛋白激酶底物上存在的磷酸化位点的磷酸化水平。因此，当在不同的测试条件下使用至少一种蛋白激酶底物时，诸如例如通过比较在存在和不存在磷酸酶调节化合物或药物的情况下样品在一种肽或蛋白质(蛋白激酶底物)上的磷酸化，可以生成磷酸化谱。更频繁地，在相同或相继实施的实验中，使用若干蛋白激酶底物测量样品的磷酸化谱。优选地，本发明测定酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸激酶活性水平或谱。
[0259]
应当注意，本领域技术人员将理解本发明的方法可以使用磷酸化谱作为确定蛋白激酶活性的基础。然而，个别蛋白激酶底物的磷酸化水平也可以用作确定蛋白激酶活性的基础。
[0260]
本领域技术人员将理解如何从所述样品的所述磷酸化谱确定反映以下激酶的激酶活性的激酶活性谱：
[0261]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶，优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0262]-src激酶家族的至少一种激酶，优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种激酶；和
[0263]-syk激酶家族的至少一种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的至少一种激酶。
[0264]
例如，可以使用上游激酶分析从所述样品的所述磷酸化谱确定激酶活性谱。这可以通过使用来自知识数据库(例如hrpd、phosphosite、reactome和phosphonet)的信息实现。
[0265]
与本文教导的从激酶活性计算的分类器参数类似，分类器参数也可以从样品的磷酸化水平计算。从样品的磷酸化水平计算的这些分类器参数可以用于根据磷酸化谱确定激酶活性。
[0266]
应该注意的是，为了测量蛋白激酶活性，当样品与蛋白激酶底物接触时，需要将atp或任何其他磷酸源添加到样品中。atp的存在将导致蛋白激酶底物的磷酸化。或者，蛋白激酶底物的磷酸化可以在不存在外源性atp的情况下进行。当在样品与蛋白激酶底物温育
期间不添加atp时，内源性atp，即样品中天然存在的atp，将充当atp的主要来源。
[0267]
可以使用本领域已知的任何方法监测每种蛋白激酶底物的磷酸化水平。使用可检测信号确定蛋白激酶底物的响应，所述信号是由样品与蛋白激酶底物的相互作用，或通过例如使用质谱法测量质量差异而产生的。在确定样品与蛋白激酶底物的相互作用时，信号是磷酸化底物与能够与磷酸化底物结合的分子相互作用的结果。可以通过例如表面等离子共振或通过可检测地标记的分子而检测这种结合。对于后者，与感兴趣的底物特异性结合的分子(例如抗体或多核苷酸探针)可以借助含有由于物理或化学性质指示分子的存在的原子(例如放射性核素)、分子(例如荧光素)或酶或颗粒或复合物而被可检测地标记。当分子共价结合至或以其他方式与“报告”分子(例如，诸如酶的生物分子)缔合时，分子也可以被可检测地标记，所述“报告”分子作用于底物以产生可检测原子、分子或其他复合物。
[0268]
用于本发明的可检测标记包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学工具可检测的任何组分。可用于本发明的标记包括用于用经标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合物染色的生物素、磁珠(例如dynabeads')、荧光染料(例如荧光素、荧光素-异硫氰酸(fitc)、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、增强绿色荧光蛋白和具有其他荧光发射波长的相关蛋白质、丽丝胺、藻红蛋白、cy2、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、fluorx[amersham]、ybr green i&ii[分子探针]等)、放射性标记(例如3h、125i、35s、14c或32p)、酶(例如萤光素酶、水解酶，特别是磷酸酶诸如碱性磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶等)、底物、辅因子、化学发光基团、显色剂和比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)、蛋白质颗粒或珠。特别地，本领域技术人员熟知的所有可检测标记均可以用作用于本发明的可检测标记。
[0269]
检测此类标记的方法为本领域技术人员所熟知。因此，例如，可以使用照相胶片或闪烁计数器检测化学发光和放射性标记，并且可以使用光电检测器检测发射光来检测荧光标志物(例如在荧光激活细胞分选中)。通常通过向酶提供底物并检测由酶对底物的作用产生的有色反应产物来检测酶标记。通过简单可视化有色标记来检测比色标记。因此，例如，当标记是放射性标记时，用于检测的工具包括闪烁计数器、如放射自显影中的照相胶片、或贮存磷屏成像。在标记是荧光标记的情况下，它可以通过用适当波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光来检测。可以通过使用电子检测器诸如电荷耦合器件(ccd)或光电倍增管等凭借照相胶片来可视化检测荧光。类似地，可以通过为酶提供适当的底物并检测所得的反应产物来检测酶标记。此外，可以通过观察与标记相关的颜色来检测简单的比色标记。荧光共振能量转移已经适用于检测未标记配体的结合，这可能在阵列上有用。
[0270]
在本发明的特定实施方案中，使用可检测标记的抗体更特别是荧光标记的抗体来确定蛋白激酶底物对样品的响应。在其中底物由蛋白激酶底物组成的本发明的那些实施方案中，使用荧光标记的抗磷酸酪氨酸抗体、荧光标记的抗磷酸丝氨酸抗体、或荧光标记的抗磷酸苏氨酸抗体来确定蛋白激酶底物的响应。在本发明的方法中使用荧光标记的抗磷酸酪氨酸抗体、或荧光标记的抗磷酸丝氨酸抗体、或荧光标记的抗磷酸苏氨酸抗体，允许实时或半实时测定蛋白激酶活性并因此提供了将蛋白激酶活性表示为蛋白激酶的初始速度的可能性，该初始速度衍生自在底物上温育样品的特定时间段内的活性。
[0271]
本发明上下文中，术语“肽标志物”是指根据本发明的方法可以优选使用如表2所列的肽以测量样品中所述标志物的磷酸化位点的磷酸化水平。可以以不同方式测量和比较
所述标志物中存在的单个磷酸化位点的磷酸化水平。因此，本发明不限于使用与表2中所列的任何这些肽标志物相同的肽。技术人员可以容易地基于表2中所列的肽标志物设计与所述表中的特定肽相比的变体肽，并在用于测量如表2中所列的所述肽标志物共有的磷酸化位点的磷酸化水平的方法中使用这些变体肽。这些变体肽可以具有比给定肽更多或更少的一个或多个(2、3、4、5、6、7等)氨基酸，并且还可以具有氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)，只要这些变体肽保留如所述表中所列的所述原始肽的磷酸化位点中的至少一个或多个。此外，本领域技术人员还可以通过使用包含表2中所列的“肽标志物”的氨基酸区域的蛋白质(全长或n或c端截短的)作为研究存在于表2中所列肽的氨基酸区域中的位点的磷酸化的来源，容易地实施根据本发明的方法。技术人员也可以使用肽模拟物。
[0272]
如本文所述的方法中使用的蛋白激酶底物意在包括包含表2的肽标志物的磷酸化位点中的优选一个或多个的肽、蛋白质或肽模拟物。所述一个或多个磷酸化位点由样品中存在的蛋白激酶特异性磷酸化，从而提供磷酸化谱。更优选地，本发明的方法中使用的蛋白激酶底物(肽、蛋白质或肽模拟物)包含表2中所列的所有肽标志物或由其组成。
[0273]
表2：包含用于确定表1中所列激酶的激酶活性的磷酸化位点的93个肽标志物、它们的序列和seq id no的列表。肽标志物的名称是指相关的蛋白质以及氨基酸序列的起始和结束位置。
[0274]
[0275]
[0276][0277]
还应注意，根据本发明的优选实施方案，表2中所列的肽标志物可以照此用于实施根据本发明的方法。然而，本发明还包括使用这些肽标志物的类似物和组合用于根据本发明的方法。肽标志物类似物包括显示大于70％、优选大于80％、更优选大于90％、甚至更优选大于95％的序列同一性的肽标志物。
[0278]
本发明方法中使用的药物是pd-1免疫检查点抑制剂或pd-l1免疫检查点抑制剂。pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂可以是任何种类的化学物质，例如用于治疗、治愈、预防或诊断疾病或用于以其他方式增强身体或精神健康。具体而言，所述药物可以是针对pd-1的免疫治疗抗体(诸如纳武单抗(例如opdivo
tm
)、派姆单抗(例如keytruda
tm
)或度伐鲁单抗(例如imfinzi
tm
))或针对pd-l1的免疫治疗抗体(诸如阿特朱单抗(例如tecentriq
tm
)、阿维鲁单抗(例如bacencio
tm
)和西米普利单抗(例如libtayo
tm
)。
[0279]
在特定实施方案中，本发明方法中使用的药物是pd-1免疫检查点抑制剂或pd-l1免疫检查点抑制剂，其联合不同于pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂，诸如ctla-4免疫检查点抑制剂使用。这种联合治疗的实例包括纳武单抗(pd-1免疫检查点抑制剂)和伊匹单抗(ipilimumab)(ctla-4免疫检查点抑制剂)。
[0280]
如本文所用，术语“免疫治疗抗体”是指一类抗体，优选单克隆抗体，其结合至特定细胞或蛋白质，优选细胞表面蛋白，并从而刺激免疫系统以攻击那些细胞。免疫治疗抗体用于治疗、治愈、预防或诊断疾病，或用于以其他方式增强身体或精神健康。
[0281]
如本文所用，术语“免疫检查点”是指硬连线到免疫系统中的抑制性途径，其对于维持自身耐受和调控外周组织中生理免疫应答的持续时间和幅度以最小化附带组织损伤至关重要。肿瘤可以指定一个或多个免疫检查点途径作为免疫抗性的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原具有特异性的t细胞。免疫检查点可以被抗体阻断。此类免疫检查点的实例是
ctla-4、pd-1和pd-l1。
[0282]
更优选地，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述药物选自纳武单抗(例如opdivo
tm
)、派姆单抗(例如keytruda
tm
)、度伐鲁单抗(例如imfinzi
tm
)、阿特朱单抗(例如tecentriq
tm
)、阿维鲁单抗(例如bacencio
tm
)和西米普利单抗(例如libtayo
tm
)和/或其组合和/或其类似物。甚至更优选地，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述药物是纳武单抗或派姆单抗，和/或其组合和/或其类似物。甚至更优选地，所述药物是纳武单抗，
[0283]
另一个实施方案中，根据本发明的携带磷酸化位点的激酶底物位于或固定在固体支持物上，优选多孔固体支持物上。优选地，所述携带磷酸化位点的固定化激酶底物将是固定化的蛋白质、肽或肽模拟物。更优选地，肽固定在固体支持物上。
[0284]
如本文所用，“肽”是指通常由2至100、优选2至30、更优选5至30和甚至更优选13至18个天然存在的或合成的氨基酸组成的短截短蛋白质，所述氨基酸也可以进一步修饰，包括通过消除一个分子的水而共价连接第一氨基酸的α羧基基团和第二氨基酸的α氨基基团的肽键。氨基酸可以是那些天然存在的氨基酸或这些氨基酸的化学合成变体或这些氨基酸的修饰形式，氨基酸的修饰形式可以通过添加其他化学基团从它们的基本化学结构改变，这些其他化学基团可以发现在天然存在的化合物中共价附接至它们。
[0285]
如本文所用，“蛋白质”是指由排列成线性链的氨基酸制成的，并通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基基团之间的肽键结合在一起的多肽。
[0286]
如本文所用，“肽模拟物”是指在结构上与肽相似并且与表2中所列的肽序列相似的有机化合物。肽模拟物通常是根据现有肽设计的，以改变分子特征。改善的特性可以包括，例如改善的稳定性诸如对酶降解的抗性，或增强的生物活性，通过受限的优选构象而改善的亲和力，和合成的容易性。与肽相比，肽模拟物中的结构修饰可能涉及主链修饰以及侧链修饰。
[0287]
根据激酶活性测量方法的类型，其上固定有蛋白质、肽或肽模拟物的固体支持物可能不同。在elisa中，蛋白激酶底物附接在微量滴定板的表面，而在微阵列中，蛋白激酶底物固定在微阵列基底上和/或微阵列基底中。或者，直接在微阵列基底上原位合成底物。
[0288]
在本发明的优选实施方案中，将蛋白激酶底物固定在阵列上，优选蛋白激酶底物微阵列上，其中将蛋白激酶底物固定在固体支持物或其他载体上。固定可以是两个或更多个蛋白激酶底物分子附接或黏附到载体的表面，包括例如在多孔或流通的固体支持物的情况下，附接或黏附到所述载体的内表面。
[0289]
在本发明的优选实施方案中，蛋白激酶底物的阵列是流通阵列。如本文所用，流通阵列可以由本领域通常已知的具有定向的贯穿通道的任何载体材料制备，诸如例如pct专利公开wo 01/19517中所描述的。通常，载体由金属氧化物、玻璃、氧化硅或纤维素制备。在特定实施方案中，载体材料由选自氧化锌、氧化锆、氧化锡、氧化铝、氧化钛和铊的金属氧化物制备；在更特定的实施方案中，金属氧化物由氧化铝组成。
[0290]
因此，在本发明的进一步实施方案中，所述阵列是
[0291]
在进一步的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述固体支持物(微阵列)包含固定于其上的表2中所列的所有93种肽标志物。
[0292]
在进一步的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述nsclc是腺癌或鳞状细胞癌。
[0293]
在进一步的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述nsclc是iii期nsclc或iv期nsclc，优选iv期nsclc。
[0294]
在进一步的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述nsclc是iii期腺癌或鳞状细胞癌或iv期腺癌或鳞状细胞癌，优选iv期腺癌或鳞状细胞癌。
[0295]
也可以根据本发明测量磷酸化水平，而无需生成其磷酸化谱。同样对于该实施方案，待使用的肽、蛋白质或肽模拟物的量和类型如上所述。
[0296]
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的方法用于评估患有非小细胞肺癌的患者对药物的易感性的用途，其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂。
[0297]
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的方法用于评估药物的药学价值的用途，其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂。
[0298]
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的方法用于评估药物的临床价值的用途，其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂。
[0299]
如本文所用，当评估对药物的易感性、药物的药学价值或药物的临床价值时，这包括评估受试者或患者对所述药物的抗性，更特别地，其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂。
[0300]
在另一个实施方案中，本发明还涉及与具有处理器和连接到处理器的存储器的计算机结合使用的计算机程序产品，所述计算机程序产品包括其上编码有计算机程序机制的计算机可读存储介质，其中所述计算机程序机制可以被加载到所述计算机的存储器中并且使所述计算机执行根据本发明的方法。
[0301]
本发明进一步涉及计算机系统，其包括处理器和与所述处理器耦合并编码一个或多个程序的存储器，其中所述一个或多个程序指示处理器执行根据本发明的方法。
[0302]
在另一个实施方案中，本发明还涉及用于确定诊断患有非小细胞肺癌的患者对药物的响应的试剂盒，其包括用于测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0303]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种激酶；优选选自flt1、flt3、flt4、csf-1r、kit、pdgfrα、pdgfrβ和kdr的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或所有八种激酶；更优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、优选所有三种激酶；
[0304]-src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或至少十一种激酶；优选选自src、blk、lck、fyn、yes、brk、fgr、hck、lyn、frk和srms的src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或所有十一种激酶；更优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或所有五种激酶；和
[0305]-syk激酶家族的至少一种或至少两种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的两种激酶的激酶活性的工具；和
[0306]
计算机可读存储介质，其上记录有用于执行本文教导的预测诊断患有非小细胞肺癌的患者对药物的响应的方法的一个或多个程序；
[0307]
其中所述药物是pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂；和
[0308]
其中所述血液样品包括外周血单核细胞。
[0309]
在特定实施方案中，该试剂盒包含用于测量flt1、flt3、flt4、src、blk、lck、fyn、yes、syk和zap70的激酶活性的工具。
[0310]
在更特定的实施方案中，该试剂盒包含用于测量flt1、flt3、flt4、src、blk、lck、fyn、yes、syk、zap70、jak2、her4和trkb的激酶活性的工具。
[0311]
用于测量vegfr或pdgfr激酶家族的激酶、src激酶家族的激酶和syk激酶家族的激酶的激酶活性的方法可以是本领域已知的确定激酶活性的任何方法，诸如包括肽标志物的阵列。
[0312]
在特定实施方案中，用于测量
[0313]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种激酶；优选选自flt1、flt3、flt4、csf-1r、kit、pdgfrα、pdgfrβ和kdr的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或所有八种激酶；更优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、优选所有三种激酶；
[0314]-src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或至少十一种激酶；优选选自src、blk、lck、fyn、yes、brk、fgr、hck、lyn、frk和srms的src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或所有十一种激酶；更优选选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或所有五种激酶；和
[0315]-syk激酶家族的至少一种或至少两种激酶，优选选自syk和zap70的syk激酶家族的两种激酶的激酶活性的工具是包含表2中所列的所有93种肽标志物的至少一个阵列。
[0316]
在特定的实施方案中，用于测量
[0317]
选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、优选所有三种激酶；
[0318]-选自src、blk、lck、fyn和yes的src激酶家族的至少两种、至少三种、至少四种、优选所有五种激酶；
[0319]-选自由syk和zap70组成的激酶组的syk激酶家族的至少一种，优选所有两种激酶；的激酶活性的工具是包含表2中所列的所有93种肽标志物的至少一个阵列。
[0320]
在又一个实施方案中，本发明进一步涉及
[0321]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种激酶；优选选自flt1、flt3、flt4、csf-1r、kit、pdgfrα、pdgfrβ和kdr的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或所有八种激酶；更优选选自flt1、flt3和flt4的vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种、至少两种、优选所有三种激酶；
[0322]-src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或至少十一种激酶；优选选自src、blk、lck、fyn、yes、brk、fgr、hck、lyn、frk和srms的src激酶家族的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或所有十一种激酶；更优
ici治疗所述患者；或如果确定所述患者对所述pd-1或pd-l1 ici无响应，则用除所述pd-1或pd-l1 ici之外的抗赘生疗法治疗所述患者。
[0341]
除了确定响应的所述pd-1或pd-l1 ici之外的抗赘生疗法是本领域公知的。例如，当nsclc的特征在于egfr突变时，抗赘生疗法可以选自奥希替尼、厄洛替尼、阿法替尼、吉非替尼、达克替尼及其任意组合。例如，当nsclc的特征在于alk重排时，抗赘生疗法可以选自艾乐替尼、布加替尼、色瑞替尼、克唑替尼及其任意组合。例如，如果nsclc的特征在于ros1重排，则抗赘生疗法可以选自克唑替尼、色瑞替尼及其组合。例如，如果nsclc的特征在于braf v600e突变，则抗赘生疗法可以选自达拉非尼、曲美替尼及其组合。例如，如果nsclc的特征在于ntrk基因融合突变，则抗赘生疗法可以是拉罗替尼。例如，如果nsclc的特征在于除egfr突变、alk重排、ros1重排、braf v600e突变或ntrk基因融合突变之外的任何其他突变，或者如果nsclc的特征在于无突变，则抗赘生治疗可以是铂类双药化疗，还包括贝伐单抗或其他类型的化疗或多西他赛或培美曲塞或吉西他滨或雷莫芦单抗，包括多西他赛。本领域技术人员将理解这些抗赘生治疗方案进一步取决于nsclc肿瘤的tnm分期、患者的表现评分、肺癌的类型、治疗线以及个体患者和主治医师做出的选择。
[0342]
换言之，pd-1或pd-1lici可以用于nsclc的治疗，其包括：
[0343]
(i)确定诊断患有nsclc的患者对pd-1或pd-l1 ici治疗的响应，其包括以下步骤
[0344]
(a)测量从所述诊断患有nsclc的患者获得的血液样品中的
[0345]-vegfr或pdgfr激酶家族的至少一种激酶；
[0346]-src激酶家族的至少一种激酶；和
[0347]-syk激酶家族的至少一种激酶，
[0348]
的激酶活性，从而提供所述血液样品的激酶活性谱；和
[0349]
(b)从所述激酶活性谱确定所述患者对所述药物的响应；
[0350]
其中所述血液样品包括外周血单核细胞；和
[0351]
(ii)如果确定所述患者对所述pd-1或pd-l1 ici有响应，则向所述患者施用所述pd-1或pd-l1 ici，或者如果确定所述患者对所述pd-1或pd-l1ici无响应，则向所述患者施用所述pd-1或pd-l1 ici。
[0352]
术语“治疗”或“治疗”具有它们普遍接受的含义，并且优选地涵盖对已经形成的疾病或病症的治疗性治疗，诸如对已经形成的赘生性疾病的治疗，以及预防性或预防措施，其中目的是防止或减少不期望的折磨发生的机会，诸如防止赘生性疾病的发生、形成和进展。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于减轻一种或多种症状或一种或多种生物标志物、减弱疾病程度、疾病稳定(即不恶化)状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态等。“治疗”还可以意味着与如果未接受治疗的预期生存期相比生存期延长。
[0353]
如本文教导的用于使用的pd-1或pd-l1 ici和方法允许在将受益于此类治疗的诊断患有nsclc的患者中施用治疗有效量的pd-1或pd-l1 ici。如本文所用，术语“治疗有效量”具有其普遍接受的含义，并且优选是指在受试者中引发外科医生、研究人员、兽医、医生或其他临床医生寻求的生物或药物响应的活性化合物或药剂的量，可以包括减轻正在治疗的疾病或病症的症状。本领域已知用于确定如本文教导的pd-1或pd-l1 ici的治疗有效剂量的方法。
[0354]
在某些实施方案中，将所述pd-1或pd-l1 ici配制成药物配制剂或组合物并作为
药物配制剂或组合物施用。此类药物配制剂或组合物可以包含在试剂盒中。
[0355]
如本文所用，术语“药学上可接受的”与本领域一致并且优选意指与药物组合物的其他成分相容并且对其接受者无害。
[0356]
如本文所用，“载体”或“赋形剂”具有其普遍接受的含义并且优选包括任何和所有溶剂、稀释剂、缓冲剂(诸如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、增溶剂、胶体、分散介质、媒介物、填充剂、螯合剂(诸如例如，edta或谷胱甘肽)、氨基酸(例如，甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、用于实现贮库效果的药剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、抗氧化剂、张力控制剂、吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性物质不相容，否则可考虑将其用于治疗组合物中。
[0357]
用于配制药物组合物的示例性非限制性载体包括例如水包油或油包水乳剂、含有或不含有适合静脉内(iv)使用的有机助溶剂的水性组合物、脂质体或含有表面活性剂的囊泡、微球、微珠和微粒体、粉末、片剂、胶囊、栓剂、水性混悬剂、气雾剂和本领域普通技术人员显而易见的其他载体。
[0358]
如本文所指的药物组合物可以配制用于基本上任何施用途径，例如但不限于口服施用(诸如，口服摄取或吸入)、鼻内施用(诸如，鼻内吸入或鼻内粘膜应用)、胃肠外施用(例如，皮下、静脉内、肌内、腹膜内或胸骨内注射或输注)、经皮或经粘膜(诸如，口服、舌下、鼻内)施用、局部施用、直肠、阴道或气管内滴注，以及等等。用这种方式，通过方法和组合物可达到的治疗效果可以是例如全身的、局部的、组织特异性的等，这取决于给定应用的具体需要。
[0359]
(任选地与待施用的一种或多种其他活性化合物联合)使用的本发明的pd-1或pd-l1 ici的剂量或量任选地联合待施用的一种或多种其他活性化合物，取决于个体情况，并且按照惯例，适应个体情况以达到最佳效果。因此，它取决于待治疗疾病的性质和严重性，并且还取决于待治疗患者的性别、年龄、体重、一般健康状况、饮食、施用方式和时间以及个体响应性，取决于所用化合物的施用途径、功效、代谢稳定性和作用持续时间，或取决于治疗是急性还是慢性还是预防性，或者取决于除了本文所述的pd-1或pd-l1 ici之外是否施用其他活性化合物。
[0360]
非限制性地，根据疾病的类型和严重性，本文公开的pd-1或pd-l1 ici，或者两种或更多种此类pd-1或pd-l1 ici的组合的典型剂量范围可以为约1μg/kg至1g/kg的体重或更多，取决于上述因素。例如，在2至4周的ici治疗间隔内，一种或多种药剂的剂量范围可以为约0.5mg/kg至50mg/kg的体重或每个患者每个治疗周期约100-2000mg。对于数周或数月或更长时间的重复施用，根据病情，持续治疗直到出现期望的疾病症状抑制。
[0361]
在某些实施方案中，pd-1或pd-l1 ici可以在治疗期间每月施用至少一次，例如pd-1或pd-l1 ici可以在治疗期间每三周施用至少一次，例如，pd-1或pd-l1 ici可以在治疗期间每两周施用至少一次。
[0362]
在某些实施方案中，如本文教导的pd-1或pd-l1 ici或药物配制剂可以单独使用或联合一种或多种适用于治疗赘生性疾病的活性化合物使用(即联合疗法)。后者可以在施用本文教导的pd-1或pd-l1 ici或药物配制剂之前、之后或同时施用。
[0363]
本领域技术人员将理解用于确定需要ici的患者对pd-1或pd-1l ici治疗的响应
的方法的不同实施方案适用于如本文所述的所有方法(例如治疗方法)、用途、试剂盒、计算机程序产品和计算机系统，反之亦然。
[0364]
本发明在下文通过特定的非限制性实施例的说明来举例说明。
实施例
[0365]
实施例1.在用纳武单抗或派姆单抗治疗时短期进展和晚期(或无)进展的nsclc患者可以根据激酶活性谱(肽微阵列)进行区分。
[0366]
在用免疫检查点抑制剂(ici)治疗前不久，从56名nsclc患者(包括两个亚组)中分离pbmc。所有患者均接受了使用纳武单抗或派姆单抗的抗pd1单一疗法，并且未接受任何先前线的免疫治疗。在存在蛋白酶和磷酸酶抑制剂的情况下，在mper缓冲液中裂解pbmc，并使用动态肽微阵列(pamchip)分析2μg总蛋白的蛋白酪氨酸激酶(ptk)活性的谱。微阵列包含了144种不同的肽，它们是蛋白酪氨酸激酶的底物。所得的磷酸化谱或激酶活性谱在r中处理，包括归一化步骤(方差稳定归一化，vsn)和用combat方法校正两个亚组之间的系统差异。
[0367]
早期(无进展生存期(pfs)《140天)相对晚期/无进展(pfs》140天)患者之间的差异磷酸化谱或激酶活性谱显示于图1，分别显示了早期进展组和晚期/无进展组之间的93种肽(对应于的表2中所列的肽)的磷酸化的平均差异。使用两个样品t检验将18个磷酸化位点坚定为差异最大的磷酸化位点(数据未显示)。
[0368]
令人惊讶的是，个体患者的磷酸化谱或激酶活性谱提供了用抗pd1 ici治疗的患者的治疗结果的良好预测。使用r中的glmnet来训练和评估预测模型，可能将早期进展与晚期/无进展的患者分开(图2a-b)。
[0369]
对于早期进展患者相对晚期/无进展患者的差异磷酸化谱或激酶活性谱结合相应的肽序列，分析了可以诱导两组患者之间的磷酸化差异的推定的上游激酶活性。使用来自知识数据库(hprd、phosphosite、reactome和phosphonet)的信息以识别可以充当预测患者对抗pd1ici治疗的响应的标志物的激酶(图3和图4，图4呈现的信息与如图3所示，但显示了激酶之间的进化关系)。在该分析中晚期/无进展患者显示出更高活性的酪氨酸激酶是包括flt1、flt3、flt4在内的vegfr和pdgfr家族的激酶，以及包括jak2、her4和trkb在内的其他激酶。在该分析中早期进展患者显示出更高活性的酪氨酸激酶是包括src、blk、lck、fyn和yes在内的来自src家族的激酶，以及syk家族激酶syk和zap70。