石油污染土壤中多环芳烃降解菌株LJB-25及其菌剂和应用

石油污染土壤中多环芳烃降解菌株ljb-25及其菌剂和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株石油污染土壤中多环芳烃降解菌株ljb-25及其菌剂和应用。


背景技术：

2.多环芳烃(pahs)是受到广泛关注的一类环境污染物质，在环境中普遍存在且不断积累。菲是一种三环芳烃，它与pahs的致癌性有着非常密切的关系，凭借其独特的化学结构，菲成为pahs研究的模式化合物。由于菲具有持久性、致癌、致畸、致突变性及生物累积性等特性，能够对生态环境和人类健康构成重大危害。
3.环境中有毒有害有机污染物的自然衰减主要依赖相关微生物代谢作用，生物修复技术具有成本低、效果好、无二次污染等优点，因此该方法是目前pahs污染修复最具潜力的修复手段。目前，已报道的菲降解菌株包括agmenellum sp.、aeromonas sp.、alcaligenes sp.、acinetobacter sp.、bacillus sp.、berjerinckia sp.、burkholderia sp.、corynebacterium sp.、cyclotrophicus sp.、flavobacterium sp.、micrococcus sp.、moraxella sp.、mycobacterium sp.、nocardioides sp.、pseudomonas sp.、rhodococcus sp.、streptomyces sp.、sphingomonas sp.、stenotrophomonas sp.、paenibacillus sp等。近年来国内外科研工作者已从自然环境中分离得到一些菲降解菌，并对其降解性能进行初步研究。janikowski tb等试验表明投加鞘氨醇单胞菌属菌株的生物反应器能完全降解萘、菲、蒽和芘，在75h内菲降解速率达到98mg
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h-1
。倪雪等从多环芳烃污染区植物体内分离得到两株具有降解菲能力的寡养单胞菌属(stenotrophomonas sp.)和假单胞菌属(pseudomonas sp.)，该两株菌在7d内可降解90％无机盐培养基中的菲(100mg
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)。邓军等从长期受pahs污染的土壤中分离得到1株菲降解菌氧化节杆菌(arthrobacter oxydans)，在菲初始质量浓度为50mg
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的无机盐培养液中培养5d后，菲降解率为60％左右(邓军等，2010)。目前，由于工矿业、农业等人为活动以及土壤环境背景值高等因素已经造成了环境中多环芳烃的严重污染及严重超标，并且化工类园区及周边土壤、采油区、采矿区、污水灌溉区的主要污染物多为多环芳烃。因此，筛选出能有效降解高浓度菲的菌株更具很好的应用价值。本发明以质量浓度为1000mg
·
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的菲作为菌株降解的底物，筛选能够高效降解pahs微生物菌株，以期为菲及其它多环芳烃的生物处理提供数据支持。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一株具有多环芳烃降解功能的achromobacter insuavis ljb-25。该菌株于2021年10月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：61985。
5.本研究报道菌株为achromobacter insuavis，是在2021年在东营石油污染场地中分离并鉴定的新型无色杆菌属的菌株，但关于该菌株对多环芳烃降解研究国内外还未见报
道。本研究从山东省东营市胜利油田中驯化和分离得到1株以高浓度菲作为碳源的高效菌株，对其进行鉴定，研究其生长特性及其对菲的降解特性，同时将其制备成微生物菌剂并探究其对菲的降解特性，为多环芳烃污染环境的生物修复提供参考。
6.本发明的第二个目的是提供所述的achromobacter insuavis ljb-25在降解多环芳烃中的应用。
7.优选的，所述的降解多环芳烃是降解土壤或污水中的多环芳烃。
8.优选的，所述的多环芳烃是菲。
9.本发明的第三个目的是提供所述的achromobacter insuavis ljb-25在制备多环芳烃降解菌剂中的应用。
10.本发明的第四个目的是提供一种多环芳烃降解菌剂，该菌剂包含上述的achromobacter insuavis ljb-25作为活性成分。
11.优选的，所述的多环芳烃降解菌剂的制备方法为：
12.s1：将achromobacter insuavis ljb-25制成od
600
＝1的菌悬液；
13.s2：将玉米秸秆生物炭和菌悬液按照1:20w/v的比例混合，28℃、180r/min摇床震荡培养8h，然后用无菌水离心清洗两次，离心条件为4000r/min下离心5min，取沉淀，得吸附菌体，往吸附菌体中加入无菌水定容至20ml，得到吸附菌体溶液；
14.s3：分别称取10g聚二烯醇和0.5g海藻酸钠加入60ml蒸馏水，70℃加热搅拌使其溶解后，121℃灭菌15min，冷却后，得到包埋剂溶液；
15.s4：称取5g ca(no3)2加入100ml去离子水中，搅拌使其溶解，调节ph为7.0，得到交联剂溶液；
16.s5：在包埋剂溶液中加入20ml吸附菌体溶液，用无菌水定容至100ml后混匀，使用50ml口径为2mm的注射器取50ml混合液，从30cm高处滴加到100ml的交联剂溶液中，固定1小时，即得到多环芳烃降解菌剂。
17.本发明的第五个目的是提供所述的achromobacter insuavis ljb-25和多环芳烃降解菌剂在多环芳烃污染环境的生物修复中的应用。
18.优选的，所述的多环芳烃污染环境包括多环芳烃污染水体和/或土壤。所述的多环芳烃是菲。
19.本发明的第六个目的是提供一种降解多环芳烃的方法，该方法是将所述的achromobacter insuavis ljb-25或所述的多环芳烃降解菌剂洒于含有多环芳烃的环境中，对多环芳烃进行降解。
20.本发明从山东东营市胜利油田中驯化和分离得到一株以菲为碳源的降解菌株ljb-25，根据菌株形态、生理特征、革兰氏反应、16s rdna基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为achromobacter insuavis。ljb-25生长的最佳环境条件为：温度为30℃，ph值为7，nacl为1％(质量分数)；该菌株的dna g c含量为68.3mol％；16s rdna基因测序分析结果显示与ljb-25最相近的菌株为achromobacter insuavis lmg 26845(相似度为99.9％)。ljb-25能够利用菲作为唯一碳源并且很快地降解菲；在菲初始浓度为100mg
·
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的无机盐培养基中培养3天后，降解率为62.3％；将该菌制备成菌剂后其降解率可达到81.2％。因此，该菌株在生物修复方面具有较好的应用潜力。
21.achromobacter insuavis ljb-25，其于2021年10月28日保藏于广东省微生物菌
种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：61985。
附图说明
22.图1为菌株ljb-25的生长形态图，(a)lb固体培养基上生长的ljb-25群落；(b)ljb-25透射电子显微镜图：周生鞭毛，比例尺为500nm。
23.图2为菌株ljb-25的系统发育信息。
24.图3为菌株ljb-25及其菌剂的菲降解特性。
具体实施方式
25.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
26.实施例1：achromobacter insuavis ljb-25的分离和鉴定
27.1、样品来源
28.从山东东营石油污染场地中采集土壤，以高浓度菲为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的菲降解菌。
29.2、培养基
30.2.1无机盐培养基
31.无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养，纯菌以及菌剂条件下菲降解实验。该培养基配方见表1。其配制方法是将各成分加入到水中，搅拌混匀，灭菌制得。
32.表1无机盐培养基配方
33.(a)
[0034][0035][0036]
(b)
[0037][0038]
(c)
[0039][0040]
2.2营养培养基
[0041]
营养培养基用于细菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。可根据细菌的不同生长特性，选择适宜的营养培养基，使得所培养的细菌能够达到其最大活性，便于进一步展开实验工作。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添质量分数1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基ph均调节至7.0。其配制方法是将各成分加入到水中，搅拌混匀，灭菌制得。
[0042]
表2 luria-bertani培养基(lb)成分
[0043][0044]
3、菌株的驯化、筛选和分离
[0045]
将采集的活性污泥加入到无机盐培养基中，以浓度为1000mg
·
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的菲作为降解的
底物，放置于30℃培养箱中避光震荡培养。利用以菲为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期。取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜富集培养基中并重复上述富集过程，如此重复三次。
[0046]
将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于30℃下培养，经过48h左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、透明度等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到100株以菲为碳源的纯菌株，进行菌株降解能力实验，最终从100株降解率较高的菌株中筛选得到1株对菲有较好降解性能的新型菌株ljb-25。挑取纯化后的单菌落到相应液体营养培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油质量分数为15％)，放置于-80℃长期保存。
[0047]
4、菌株鉴定
[0048]
根据菌株的革兰氏染色反应结果、形态特性、生理特性对菌株进行初步鉴定。
[0049]
4.1形态特征
[0050]
活化菌株ljb-25，用划线分离的方式分别接种至营养培养基平板上，将其放置于30℃培养箱中培养24h，观察形成单菌落的形态大小、颜色等特性。
[0051]
根据所分离出的无色杆菌所在属的相关信息，选用鞭毛染色法对培养24h后的细菌进行染色实验，在光学显微镜下观察染色好的细胞，观察细胞的革兰氏染色呈阳性或者阴性，并借助透射电子显微镜进一步对细胞形态进行观察。
[0052]
革兰氏染色：所需药品包括碘液(单质碘1.0g、碘化钾2.0g溶于300ml蒸馏水)、结晶紫草酸铵混合液(结晶紫2.0g溶于20ml 95％乙醇；草酸铵0.8g溶于蒸馏水；两种溶液混合静置48h)、0.5％番红(20ml质量分数为2.5％番红乙醇溶液加人80ml蒸馏水)。染色步骤如下：于干净的载玻片上滴数滴无菌水，用接种环从培养基平板上挑取培养了24h的菌体均匀的涂于载玻片上的水滴中，待水滴风干后将菌体固定于载玻片之上，用结晶紫草酸铵混合液染色1min，用水洗去染液，滴数滴碘液于菌体1min，水洗去染液，待干燥后用95％的乙醇脱色，待干燥后用0.5％番红复染2-3min，水洗干燥，用显微镜观察。若为革兰氏阳性菌细胞呈紫色，若为革兰氏阴性菌细胞为红色。
[0053]
结果显示，菌株ljb-25经活化以后，在30℃有氧的条件下该培养基制成的平板上生长24h后，能形成直径为0.5-1.0mm菌落凸起、光滑、半透明、周生鞭毛、革兰氏染色呈阴性、菌株个体为短杆状的菌落。该菌为好氧菌，其细胞尺寸大概为(0.5-0.75)
×
(1.0-1.5)μm。其细胞的透射电子显微镜图见图1。
[0054]
4.2生理特征
[0055]
细菌的生理特性种类具有多样性，能直接影响细菌在实际生活中的应用，细菌的生理特性是细菌所有特性中最值得研究的特征。
[0056]
本实验需要测定菌株的一些具有代表性的生理特性指标，测定项目包括碳源利用、产酸等，均使用api id 32gn、api 20e和api 20ne微生物鉴定试剂盒测试(生物梅里埃公司)。菌株ljb-25的生理特性见表3。
[0057]
表3菌株ljb-25的理化指标
[0058]
[0059][0060]
注：“ ”表示生长或阳性反应，
“‑”
表示不生长或阴性反应。
[0061]
4.3分子生物学特征
[0062]
分子生物学特性鉴定：分子生物学特性鉴定主要包括三方面的研究，dna g c含量测定、所分离的新菌与模式菌间的dna-dna杂交实验、测序及系统发育树的构建。这些实验都能为细菌在分类学上的定位提供科学证据。dna g c含量的测定主要运用到高效液相色谱法，具体步骤参考mesbah et al.(1989)的报告。
[0063]
在进行测序和构建系统发育树的之前，需先需要提取细菌的dna(实验使用的细菌基因组dna快速提取试剂盒来自北京艾德莱生物科技有限公司)。为了对细菌的分类学进行研究，通常需要扩增16s rrna基因以及构建系统发育树，扩增的基因为原核生物中编码rrna所组成部分中的一段dna，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定细菌。
[0064]
聚合酶链式反应(pcr)主要是用来扩增不同的基因片段，pcr需要不同的引物(27f和1492r；baker et al.,2003)，pcr扩增反应的体系：10
×
buffer 2.5μl，mg
2
(25mmol/l)1.5μl，dntp(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，taq酶：0.25μl，dna组模板0.1μl，去离子水19.35μl。pcr扩增反应条件：95℃条件下变性，55℃的条件下退火，72℃的条件下延伸，这个过程循环30次，72℃的条件下延伸10min，pcr反应
结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂gelred配制成凝胶块，在凝胶块中加入pcr产物和包含各种长度片段的dna标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入tbe(tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定pcr产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
[0065]
将测序所得的细菌16s rrna基因序列上传到eztaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/；kim et al.,2012)上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的16s rrna基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的16s rrna基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用mega 5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常常设定为重复1000次计算。
[0066]
菌株ljb-25的dna g c含量为68.3mol％，这个含量正好落在已经报道过的achromobacter细菌dna g c含量所在的范围之内。
[0067]
利用菌株ljb-25的16s rrna基因序列(其序列如seq id no.1所示)和与其相似度较高的16s rrna基因序列制作系统发育树，从而获得ljb-25的16s rrna基因与其相似性较高的16s rrna基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。
[0068]
以上结果表明，本发明所分离的菌株ljb-25为achromobacter insuavis这个种，将其命名为achromobacter insuavis ljb-25，2021年10月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：61985。
[0069]
实施例2：achromobacter insuavis ljb-25的生长条件
[0070]
1、生长温度的测定：配置菌株生长所需的液体营养培养基(配方见表2)，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌株ljb-25接入到培养基内(实验组)，用不接种细菌的培养基做为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养7d，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出菌株ljb-25可生长温度和最适生长温度范围。测试温度如下：4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃和60℃。
[0071]
2、生长ph的测定：配置菌株生长所需的液体营养培养基(配方见表2)，用如下缓冲体系调节培养液的ph，ph 4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；ph 6.0-8.0，0.1mol/l naoh和0.1mol/lkh2po4；ph 9.0-10.0，0.1mol/l nahco3和0.1mol/lna2co3；ph11.0，0.1mol/lnaoh和0.05mol/lna2hpo4。将活化好的菌株ljb-25接入到培养基内，每个ph做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将培养基放入菌株ljb-25生长最适温度下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出菌株ljb-25可生长ph和最适生长ph范围。测试的ph如下：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。
[0072]
3、盐浓度耐受：配置菌株生长所需的液体营养培养基(配方见表2)，调节培养基的
盐浓度。将活化好的菌株ljb-25接入到已灭菌的培养基内，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的培养基作为对照，将培养基放置在菌株ljb-25生长最适条件下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的情况时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最好得到新菌所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度如下：质量分数0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。
[0073]
结果显示，在营养培养基中，ljb-25能够在20-45℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度30℃；该菌能够在5.0-9.0的ph条件下生长，最适生长ph为7.0；该菌的盐耐受能力较强，能在盐浓度为0％到5％的条件下生长，且在1％的盐浓度下长势最好。
[0074]
实施例3：菲降解实验
[0075]
1、菌剂的制备
[0076]
(1)收集菌株ljb-25的菌体细胞，在5ml 1
×
pbs缓冲液中重悬之后调节其od
600
＝1，得到菌悬液，备用。
[0077]
(2)将玉米秸秆生物炭和ljb-25菌悬液按照1:20(w/v)的比例混合，28℃、180r/min摇床震荡培养8h，然后用无菌水离心清洗两次(4000r/min，5min)，取沉淀，得吸附菌体，往吸附菌体中加入无菌水定容至20ml，得到吸附菌体溶液。
[0078]
(3)分别称取10g聚二烯醇和0.5g海藻酸钠加入60ml蒸馏水，70℃加热搅拌使其溶解后，121℃灭菌15min，冷却后，得到包埋剂溶液。
[0079]
(4)称取5g ca(no3)2加入100ml去离子水中，搅拌使其溶解，调节ph为7.0，得到交联剂溶液。
[0080]
(5)在包埋剂溶液中加入20ml吸附菌体溶液，用无菌水定容至100ml后混匀，最终聚二烯醇和海藻酸钠的浓度为10％和5％，包埋微生物量为10％。使用50ml口径为2mm的注射器取50ml混合液，从30cm高处滴加到100ml的交联剂溶液中，固定1小时，即得到ljb-25菌剂。
[0081]
2、根据以上实验结果，确定菌株ljb-25的最佳生长条件为温度30℃，ph 7.0，添加质量分数为1％的nacl。菌株ljb-25和ljb-25菌剂在100mg
·
l-1
菲浓度中降解实验均在这个条件下进行。将处于对数生长期的菌株ljb-25或ljb-25菌剂按10％的接种量(原菌液的吸光度od为0.20，根据传统平板计数法得到原菌液含有的细胞数为1.1
×
107cfu
·
ml-1
)分别接种于含有初始菲浓度为100mg
·
l-1
的无机盐培养基(配方见表1，并添加1％nacl，ph 7.0)中，温度30℃振荡培养3d，并做平行实验3次。以不添加纯菌achromobacter insuavis ljb-25和ljb-25菌剂的处理为对照处理。
[0082]
取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μl浓度为200mg/l的回收率指示剂(菲-d10)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2ml，加入少量正己烷(约5ml)，旋转蒸发至2ml，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm 3％去活化中性氧化铝，3cm 3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15ml正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15ml，氮吹使其浓缩至约0.5ml，最后转移至1.5ml细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μl内标物六甲基苯，其
浓度为200mg/l。(2)仪器分析：安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定pahs含量。采用安捷伦db 5-ms(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)毛细管色谱柱进行分离分析，流速1.2ml/min。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，菲定量用6点校正曲线和内标法进行。
[0083]
结果显示，菌株ljb-25能够在高浓度菲条件下生长，且能够很快地降解菲，在菲初始浓度为100mg
·
l-1
的无机盐培养基中培养3天后，降解率为62.3％；将该菌制备成菌剂后其降解率可达到81.2％(图3)。以上结果说明菌株ljb-25是一种降解菲能力很强的菌株，在多环芳烃污染场地生物修复方面具有较好的应用潜力。
[0084]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。