乳糖酶突变体的制作方法

1.本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种新型乳糖酶突变体及其应用。


背景技术：

2.乳糖酶是一种分解乳糖产生半乳糖和葡萄糖的双糖酶，它能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，还可以通过半乳糖苷转移作用生成功能性低聚半乳糖，又称β-d-半乳糖苷酶。乳糖酶在乳制品加工、医药、环境、食品等领域得到广泛应用，在医药上主要用来治疗乳糖不耐受症。自荷兰生物学家1889年首次报道乳糖酶能水解乳糖以来，乳糖酶的研究日渐完善。20世纪60年代，国外学者成功研制出一系列微生物乳糖酶商品并投放市场，国内在20世纪80年代以后开始微生物乳糖酶的研究，但主要集中在产酶菌株的筛选、产酶条件的优化、乳糖酶的分离纯化及酶学性质等的研究，取得了一些进展。
3.乳糖酶的来源非常丰富，包括植物来源、动物来源和微生物来源。植物来源如杏、李、桃、苹果和咖啡豆等，动物来源主要有肠、脑、消化器官和皮肤组织，微生物来源有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等，只有微生物乳糖酶具有工业应用价值。
4.乳糖酶在医药、乳品、环境保护、分析等方面应用广泛，然而产量低下限制了乳糖酶的应用及规模化生产。研究者们在乳糖酶高产菌株选育方面开展了大量的工作，主要技术集中在诱变育种和基因工程。随着基因工程技术的发展，乳糖酶高产菌株的选育取得了很好的成效。基因工程技术将性状优良的乳糖酶基因导入易于培养且生长迅速的微生物，获得重组乳糖酶基因工程菌，再进行发酵条件优化，提高乳糖酶生产含量，降低生产成本。
5.低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖为原料，经乳糖酶催化水解半乳糖苷键，生成半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子生成的。低聚半乳糖具有较强的耐酸性、耐热性，不会因为在加工过程中的高温杀菌及人体胃酸所分解而失去其本来应有的特性，而且能有效地被双歧杆菌和乳酸杆菌同时利用，因此低聚半乳糖在生产和应用中也相当广泛。为了制备高含量的低聚半乳糖，开发新的催化效率更高的乳糖酶迫在眉睫。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种乳糖酶突变体，其生成低聚半乳糖的产率得到显著提高，有利于促进低聚半乳糖的广泛应用。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明涉及一种乳糖酶突变体，其包含与seq id no:2具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:2相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：140，141，238，804。
8.在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
9.在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至
少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
10.在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：n140c/e/m/q/t，a141g/t，s238g/n/r/p，e804q/r。
11.在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：n140c，n140e，n140m，n140q，n140t，a141g，a141t，s238g，s238n，s238r，s238p，e804q，e804r，n140c/s238g，n140e/s238g，n140m/s238g，n140q/s238g，n140t/s238g，n140m/s238n，n140q/s238n，n140e/s238r，n140m/s238r，n140q/s238r，n140t/s238r，n140c/s238p，n140e/s238p，n140m/s238p，n140q/s238p，n140c/e804q，n140e/e804q，n140m/e804q，n140q/e804q，n140t/e804q，n140c/e804r，s238g/e804r，s238n/e804r，n140e/s238n/e804q，n140e/s238r/e804q，n140q/s238r/e804q，n140q/s238p/e804q，n140e/s238p/e804q，n140m/s238p/e804q，n140t/s238g/e804r，n140e/s238n/e804r。
12.本发明还涉及编码上述乳糖酶突变体的dna分子。
13.本发明还涉及具有上述dna分子的重组表达载体。
14.本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
15.将上述的表达载体转入宿主细胞中，重组表达的乳糖酶突变体产低聚半乳糖的产率得到显著提升。
16.在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。
17.本发明还提供了上述乳糖酶突变体在生产低聚半乳糖中的应用。
18.本发明提供的乳糖酶突变体其生成低聚半乳糖三糖及以上糖的产率普遍高于野生型。以40%乳糖溶液为底物，50℃反应20h，通过钙柱检测所生成低聚半乳糖含量，野生型乳糖酶生成低聚半乳糖三糖及以上糖的产率为24.83%，而乳糖酶突变体的产率达到27.28%-44.68%，比野生型普遍提高了9.87%-79.94%，取得了意料不到的技术效果。本发明所述乳糖酶突变体可广泛应用于低聚半乳糖的生产，可有效提升三糖及其他多糖的转化率，有利于降低低聚半乳糖的生产成本，市场前景广阔。
具体实施方式
19.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
20.本发明中a，r，d，c，q，e，h，i，g，n，l，k，m，f，p，s，t，w，y，v分别是丙氨酸ala，精氨酸arg，天冬氨酸asp，半胱氨酸cys，谷氨酰胺gln，谷氨酸glu，组氨酸his，异亮氨酸ile，甘氨酸 gly，天冬酰胺asn，亮氨酸leu，赖氨酸lys，甲硫氨酸met，苯丙氨酸phe，脯氨酸pro，丝氨酸ser，苏氨酸thr，色氨酸trp，酪氨酸tyr，缬氨酸val的缩写。
21.本发明具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：菌株与载体：大肠杆菌dh5α、毕赤酵母gs115、载体ppic9k、amp、g418购自invitrogen公司。
22.酶与试剂盒：pcr酶及连接酶购买自takara公司，限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
23.培养基配方：大肠杆菌培养基（lb培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1% nacl，ph7.0)；lb-amp培养基：lb培养基加100 μg/ml氨苄青霉素；酵母培养基（ypd培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；酵母筛选培养基（md培养基）：2%葡萄糖，2%琼脂糖，1.34% ynb，4
×
10-5
生物素；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，0.5%甲醇。
24.下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
25.实施例1 乳糖酶基因的扩增以米曲霉（aspergillus oryzae）基因组为模板进行pcr扩增，pcr引物f1、r1如下：f1：gacctcctccaggacatcgtc；r1：ttagtaagcgcccttacgctg，胶回收pcr产物，连接peasy-t载体，转化至大肠杆菌dh5α中，挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示，扩增得到的基因片段的核苷酸序列为seq id no：1，其编码的氨基酸序列为seq id no：2。通过ncbi blast比对发现，seq id no：2与来源于米曲霉（aspergillus oryzae）的乳糖酶序列相似性高达100%，从而确定通过pcr获得的基因为乳糖酶基因，命名为bgl。
26.实施例2 乳糖酶随机突变体库的构建为了提高上述野生型乳糖酶bgl生成低聚半乳糖的产率，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
27.以bgl基因为模板，以引物f2、r2用genemorph ii随机突变pcr试剂盒（stratagene）进行pcr扩增，胶回收pcr产物，由于引物f2、r2两端带有毕赤酵母游离质粒parszαa上的50bp片段，扩增的pcr产物与毕赤酵母游离质粒parszαa上ecori、xbai位点上下游各有50bp重复序列。
28.f2：tgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagctgaattc gacctcctccaggacatcgtc（下划线为限制性内切酶ecori识别位点）；r2：atggtcgacggcgctattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctaga ttagtaagcgcccttacgctg（下划线为限制性内切酶xbai识别位点）。
29.pcr反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸3min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增得到的乳糖酶基因大小为2993bp左右的片段，胶回收pcr产物即为乳糖酶突变体库。
30.实施例3 乳糖酶随机突变体库转化毕赤酵母筛选将毕赤酵母游离质粒parszαa用ecori、xbai进行双酶切，胶回收载体片段。
31.将酶切好的parszαa载体片段与乳糖酶突变体库pcr产物按摩尔比1:1混合后，通
过电穿孔法转化毕赤酵母x33，在yz平板上分别筛选得到毕赤酵母重组转化子。
32.将筛选得到的突变体阳性转化子转接于bmgy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入bmmy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含乳糖酶突变体的发酵上清液，发酵上清液检测乳糖酶酶活。野生型乳糖酶酶活为82u/ml，从随机突变体库挑取酶活在10u/ml以上的突变体进行低聚半乳糖的制备。
33.（1）乳糖酶酶活单位的定义在ph4.5，37℃条件下，每分钟从浓度为2.96 mg/ml的对硝基苯酚-β-d-吡喃半乳糖苷溶液中释放1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量即为一个酶活力单位u。
34.（2）酶活测定方法 取0.5 ml浓度为3 mg/ml的对硝基苯酚-β-d-吡喃半乳糖苷溶液，加入到比色管中，37℃平衡5 min，再加入0.5 ml经ph4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的β-半乳糖苷酶酶液，混匀于37℃精确保温反应10 min。反应结束后，加入4 ml 浓度为0.5 mol/l的na2co3试剂，混匀以终止反应。然后冷却至室温，以标准空白样为空白对照，在400 nm处测定吸光值ae，根据对硝基苯酚标准曲线用回归方程计算出相应的对硝基苯酚的ug数r=（ae-b）/k。
35.酶活计算公式：xd=式中：xd为酶液中β-半乳糖苷酶的活力，u/ml；r为计算得到的对硝基苯酚ug数；10为反应时间10min；0.5为加入酶液体积0.5 ml；n为酶液稀释倍数；139.11为对硝基苯酚的摩尔质量，139.11 g/mol。
36.用ph5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制浓度为brix值40%乳糖溶液，于93℃以上加热20min，期间需要不断搅拌。然后毎管1ml后分装后，分别加入适量野生型乳糖酶及随机突变体酶液，在50℃反应20h。
37.反应液12000rpm离心10min，取上清，用0.22um超滤膜过滤后，取1ul稀释10倍上hplc分析。测定的色谱条件为：waters e2695，色谱柱为sugarpak钙柱，示差检测器，流动相为50mg/l edta-ca溶液，流速为0.3ml/min。
38.对于低聚半乳糖产率高于野生型乳糖酶的突变体，申请人分别提取其基因组，以引物f1、r1扩增出乳糖酶突变体基因并进行测序并确认突变位点。最终，申请人获得了能显著提高低聚半乳糖产率的乳糖酶突变位点：n140t，a141g，s238r，e804r。
39.包含上述单个突变位点的乳糖酶突变体产低聚半乳糖的产率见表1。
40.表1 乳糖酶单点突变体及其低聚半乳糖产率乳糖酶酶活（u/ml）低聚半乳糖三糖及以上糖产率野生型82.5424.83%n140t单点突变体28.9334.50�41g单点突变体62.7932.25%s238r单点突变体86.9430.41�04r单点突变体51.2936.37%实施例4 乳糖酶单点突变体的饱和突变筛选
申请人通过定点突变技术对上述随机突变筛选到的突变位点（n140、a141、s238、e804）进行了饱和突变的筛选。以野生型乳糖酶bgl基因为模板，每个突变体设计一对突变引物，分别与引物f2、r2扩增乳糖酶基因突变的上下游，该上下游片段与酶切好的parszαa载体片段按摩尔比1:1混合后，通过电穿孔法转化毕赤酵母x33，在yz平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株，每个突变体挑取6个阳性转化子。
41.将筛选得到的突变体阳性转化子转接于bmgy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入bmmy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含乳糖酶突变体的发酵上清液，发酵上清液检测乳糖酶酶活。挑取酶活在10u/ml以上的突变体进行低聚半乳糖的制备。
42.用ph5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制浓度为brix值40%乳糖溶液，于93℃以上加热20min，期间需要不断搅拌。然后毎管1ml后分装后，分别加入适量乳糖酶野生型及随机突变体酶液，在50℃反应20h。
43.反应液12000rpm离心10min，取上清，用0.22um超滤膜过滤后，取1ul稀释10倍上hplc分析。测定的色谱条件为：waters e2695，色谱柱为sugarpak钙柱，示差检测器，流动相为50mg/l edta-ca溶液，流速为0.3ml/min。
44.最终，申请人通过对突变位点（n140、a141、s238、e804）进行饱和突变筛选，获得如表2所述的能显著提高低聚半乳糖产率的突变位点。
45.表2 乳糖酶单点突变体及其低聚半乳糖产率乳糖酶酶活（u/ml）低聚半乳糖三糖及以上糖产率野生型82.5424.83%n140c单点突变体58.2137.81%n140e单点突变体12.1438.42%n140m单点突变体38.6334.55%n140q单点突变体43.8737.38%n140t单点突变体28.9334.50�41g单点突变体62.7932.25�41t单点突变体81.8127.28%s238g单点突变体119.8730.42%s238n单点突变体57.3130.05%s238r单点突变体86.9430.41%s238p单点突变体44.7832.40�04q单点突变体97.0831.46�04r单点突变体51.2936.37%实施例5 乳糖酶双点突变体的筛选为了进一步提高上述乳糖酶生成低聚半乳糖的产率，申请人将从单点饱和突变筛选到的低聚半乳糖产率高的突变体进行双点突变组合，所采用组合的单点突变包括n140c、n140e、n140q、n140m、n140t、s238g、s238n、s238r、s238p、e804q、e804r。
46.以其中一个单点突变体载体为模板，另一个突变位点设计定点突变引物，利用stratagene定点突变试剂盒进行定点突变，每个突变体通过测序确认突变位点正确。申请
人将克隆得到的乳糖酶双点突变体序列连接在毕赤酵母表达载体ppiczαa上；然后将该表达载体用sal i进行线性化，表达载体线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母x33，在yz平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株，每个突变体挑取6个阳性转化子。
47.将筛选得到的双点突变体阳性转化子转接于bmgy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入bmmy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含乳糖酶双点突变体的发酵上清液，发酵上清液检测乳糖酶酶活，挑取酶活在10u/ml以上的突变体进行低聚半乳糖的制备。
48.用ph5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制浓度为brix值40%乳糖溶液，于93℃以上加热20min，期间需要不断搅拌。然后毎管1ml后分装后，分别加入适量乳糖酶野生型及双点突变体酶液，在50℃反应20h。
49.反应液12000rpm离心10min，取上清，用0.22um超滤膜过滤后，取1ul稀释10倍上hplc分析。测定的色谱条件为：waters e2695，色谱柱为sugarpak钙柱，示差检测器，流动相为50mg/l edta-ca溶液，流速为0.3ml/min。
50.最终，申请人筛选获得如表3所述的能显著提高低聚半乳糖产率的双点突变组合。
51.表3 乳糖酶双点突变体及其低聚半乳糖产率乳糖酶酶活（u/ml）低聚半乳糖三糖及以上糖产率野生型82.5424.83%n140c/s238g31.7639.94%n140e/s238g6.6037.56%n140m/s238g23.3534.69%n140q/s238g40.4834.22%n140t/s238g46.9833.94%n140m/s238n35.0433.86%n140q/s238n23.5336.83%n140e/s238r24.4836.04%n140m/s238r35.9934.12%n140q/s238r26.9636.68%n140t/s238r42.0734.40%n140c/s238p12.3642.65%n140e/s238p9.2142.04%n140m/s238p17.1435.19%n140q/s238p15.2041.70%n140c/e804q32.940.40%n140e/e804q5.8742.11%n140m/e804q15.6240.84%n140q/e804q23.8340.25%n140t/e804q17.7438.45%n140c/e804r20.040.40%s238g/e804r26.6534.52%
s238n/e804r34.3434.12%实施例6 乳糖酶三点突变体筛选为了提高上述乳糖酶生成低聚半乳糖的产率，申请人将从单点饱和突变及双点突变中筛选到的低聚半乳糖产率高的突变体进行三点突变组合，所采用组合的单点突变包括n140c、n140e、n140q、n140m、n140t、s238g、s238n、s238r、s238p、e804q、e804r、e804l。
52.以其中一个双点突变体载体为模板，另一个突变位点设计定点突变引物，利用stratagene定点突变试剂盒进行定点突变，每个突变体通过测序确认突变位点正确。申请人将克隆得到的乳糖酶三点突变体序列连接在毕赤酵母表达载体ppiczαa上；然后将该表达载体用sal i进行线性化，表达载体线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母x33，在yz平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株，每个突变体挑取6个阳性转化子。
53.将筛选得到的三点突变体阳性转化子转接于bmgy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入bmmy培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含乳糖酶三点突变体的发酵上清液，发酵上清液检测乳糖酶酶活，挑取酶活在10u/ml以上的突变体进行低聚半乳糖的制备。
54.用ph5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制浓度为brix值40%乳糖溶液，于93℃以上加热20min，期间需要不断搅拌。然后毎管1ml后分装后，分别加入适量乳糖酶野生型及双点突变体酶液，在50℃反应20h。
55.反应液12000rpm离心10min，取上清，用0.22um超滤膜过滤后，取1ul稀释10倍上hplc分析。测定的色谱条件为：waters e2695，色谱柱为sugarpak钙柱，示差检测器，流动相为50mg/l edta-ca溶液，流速为0.3ml/min。
56.最终，申请人筛选获得如表4所述的能显著提高低聚半乳糖产率的三点突变组合。
57.表4 乳糖酶三点突变体及其低聚半乳糖产率乳糖酶酶活（u/ml）低聚半乳糖三糖及以上糖产率野生型82.5424.83%n140e/s238n/e804q19.0243.51%n140e/s238r/e804q16.6842.39%n140q/s238r/e804q13.7041.79%n140q/s238p/e804q12.644.68%n140e/s238p/e804q15.3442.71%n140m/s238p/e804q19.0244.37%n140t/s238g/e804r14.8843.91%n140e/s238n/e804r12.8541.35%综上所述，本发明通过随机突变结合定点突变技术，筛选获得了显著提高低聚半乳糖产率的乳糖酶突变体。与野生型乳糖酶相比，所述突变体产低聚半乳糖三糖及以上糖的产率普遍提高了9.87%-79.94%，取得了意料不到的技术效果。所述乳糖酶突变体可广泛应用于低聚半乳糖的生产，有利于降低低聚半乳糖的生产成本。
58.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。