一种用于提高PCR特异性的添加剂及其应用的制作方法

一种用于提高pcr特异性的添加剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种用于提高pcr特异性的添加剂及其应用。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)能够对仅含有几个细胞的样品进行基因检测。由于pcr技术能够把待测样品中的dna放大很高倍数，因此pcr技术在生物医学、临床检测、食品中病源微生物的检测等都具有较大的优势。然而，提取的样本纯度不够、模板dna中gc含量较高以及引物设计的不够合理等都可能使pcr产物出现非特异性条带、涂布性条带，甚至无法扩增出目的条带的情况，影响了实验结果的检测。
3.目前，二甲基亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甜菜碱、以及金纳米颗粒、银纳米颗粒、磁铁矿(fe3o4)纳米粒子等纳米粒子被报道能够在一定程度上提高pcr产量和特异性，但是一些物质在人体健康和环境安全上可能具有潜在的风险。因此，寻找稳定、经济、无毒性的pcr添加剂来解决pcr非特异性问题仍然是十分重要的。
4.在现有公开的专利中，牛凝血酶蛋白、甘露糖基甘油酸、磷酸二甘油酯和四氢嘧啶等作为pcr添加剂主要用于增强pcr的效率。但是，到目前为止，关于含有三价金属离子的pcr添加剂提高pcr特异性还没有被报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了寻找稳定、经济、无毒性的pcr添加剂用于提高pcr特异性，设计了含有三价金属离子的pcr添加剂。
6.本发明所提供的含有三价金属离子的pcr添加剂用于提高pcr特异性主要体现在应用本发明可显著抑制甚至消除电泳凝胶中非特异性条带(主要为涂布性拖尾条带)的产生。本发明的原理如下：当pcr组份中同时存在长片段和短片段时，向pcr组份中加入金属离子后，相比短片段dna而言，长片段上结合的三价金属离子可极大程度上改变其空间构象(如浓缩成团状)，导致长片段的扩增被优先抑制。因此，基于此原理，向pcr体系中加入三价金属离子可以消除大片段的非特异性条带。
7.本发明的第一方面，提供三价金属离子在制备pcr添加剂中的应用。
8.所述的pcr添加剂显著提高pcr特异性的机理是基于三价金属离子优先抑制pcr体系中长片段的扩增，从而改善pcr扩增过程中出现的涂布性拖尾现象。
9.进一步的，所述的三价金属离子为金离子(au
3
)、铬离子(cr
3
)、铝离子(al
3
)，以及含以上离子的络合离子形式如aucl
4-等。
10.进一步的，所述的三价金属离子来自包含以上价态金属离子的各种形式的金属盐化合物或其溶液，如氯化金(aucl3)、氢氧化金(au(oh)3)、氯金酸(haucl4)及其水合化合物(如haucl4·
3h2o)、三氯吡啶金或者吡啶三氯化金(c5h5aucl3n)、氯化铝(alcl3)、氯化铬(crcl3)及其水合化合物(如crcl3·
6h2o)等。
11.进一步的，所述的三价金属离子添加到pcr体系时，三价金属离子的终浓度范围为0.1-200μm(微摩尔每升)。
12.根据模板dna的浓度，预期pcr产物长度以及pcr扩增循环数的不同，所需的三价金属离子的最适浓度不同。
13.本发明的第二方面，提供一种含有三价金属离子的pcr添加剂，所述的pcr添加剂是用缓冲液(如10mm tris-hcl溶液)溶解含三价金属离子的物质(盐类或者络合物)，得到含三价金属离子及其各种络合、水合离子的缓冲(如tris-hcl)溶液。
14.进一步的，所述的pcr添加剂的ph值6《ph《7，pcr反应体系是弱碱性体系，如果pcr添加剂的ph过低，可能会影响pcr反应体系的ph值，如果添加剂的ph高于7时，金属离子则会形成氢氧化物沉淀，影响使用效果。
15.优选的，本发明所述的含三价金属离子的pcr添加剂的可采用如下方法制备：用配制好的浓度为10mm的tris-hcl溶液溶解三价金属离子盐，得到tris-hcl溶液溶解的含三价金属离子盐溶液，并调节溶液使6《ph《7。
16.本发明的第三方面，提供一种如上所述的含有三价金属离子的pcr添加剂在制备pcr反应体系中的应用。
17.本发明的第四方面，提供一种提高pcr特异性的方法，是在制备pcr反应体系时除加入pcr扩增的必需组分外，还添加含三价金属离子的pcr添加剂，其中三价金属离子在pcr体系中的终浓度为0.1-200μm。
18.进一步的，根据模板dna的浓度，预期pcr产物长度以及pcr扩增循环数的不同，所需的三价金属离子的最适浓度不同。
19.进一步的，所述的提高pcr特异性的方法包括但不限于以下步骤：
20.(a)pcr反应体系的制备：在pcr反应管中加入模板、引物、酶、dntps等pcr扩增的必需组分，并添加适量含三价金属离子的pcr添加剂。
21.(b)pcr反应程序：设置预变性、变性、退火、延伸的温度和时间；退火温度和延伸时间根据扩增的基因进行适当调整。
22.(c)pcr扩增结果的检测：使用琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测。
23.本发明优点在于：
24.1、本发明设计一种含有三价金属离子的pcr添加剂用于提高pcr的特异性，可抑制电泳凝胶中出现的非特异性条带(主要为涂布性拖尾条带)的产生，当pcr组份中同时存在长片段和短片段时，向pcr组份中加入三价金属离子后，长片段上结合的三价金属离子会使dna模板发生构象改变，导致其在后续的扩增过程中被优先抑制。
25.2、实验证明，本发明设计的含有三价金属离子的pcr添加剂能够显著抑制涂布性拖尾现象的发生，提高pcr特异性的效果显著，适宜浓度下能够有效的抑制凝胶中非特异性条带的产生，将pcr产物优化为单一目的条带。
26.3、本发明设计的pcr添加剂具有稳定性强、经济成本低、操作方法简单等优点，具有广阔的应用前景。
附图说明
27.图1.含有au
3
的pcr添加剂消除pcr中的非特异性条带。m表示bm2000dna marker，1
表示没有加入含有au
3
的pcr添加剂的对照组，2-4表示pcr体系中加入了含有au
3
的pcr添加剂，au
3
的终浓度分别为10、20、30μm。
28.图2.含有cr
3
的pcr添加剂消除pcr中的非特异性条带。m表示bm2000dna marker，1表示没有加入含有cr
3
的pcr添加剂的对照组，2-7表示pcr体系中加入了含有cr
3
的pcr添加剂，cr
3
的终浓度分别为10、20、30、40、50、60μm。
29.图3.含有al
3
的pcr添加剂消除pcr中的非特异性条带。m表示bm2000dna marker，1表示没有加入含有al
3
的pcr添加剂的对照组，2-4表示pcr体系中加入了含有al
3
的pcr添加剂，al
3
的终浓度分别为7.5、15、30μm。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
31.实施例1：含有au
3
的pcr添加剂提高pcr的特异性
32.1)上游引物：5
′-
ggcttcggtcccttctgt-3
′
(seq id no.1)，下游引物：5
′-
caccacctgttcaaactctgc-3
′
(seq id no.2)。模板(lambda dna)、dna聚合酶、dntp等常规试剂均购买自生物公司。
33.2)pcr体系如下：1.25u/25μl ex taq dna聚合酶，20mm tris-hcl(ph 8.9)，20mm kcl，2mm mgcl2，dntps和引物(0.04μm)。含有au
3
的pcr添加剂以终浓度30μm添加到pcr体系中。
34.3)pcr扩增程序如下：首先95℃2min预变性。然后35个循环包括94℃20s变性，55℃30s退火，72℃30s延伸。最后72℃延伸5min。pcr产物保存于4℃。
35.4)琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果。
36.pcr扩增结果如图1所示，没有加入含有au
3
的pcr添加剂的对照组中pcr产物为涂布性拖尾条带。加入含有au
3
的pcr添加剂的实验组中，非特异性条带得到抑制，适宜浓度下能够将pcr产物优化为单一目的条带，含有au
3
的pcr添加剂的确能够消除涂布性拖尾现象，提高pcr的特异性。
37.实施例2：含有cr
3
的pcr添加剂提高pcr的特异性
38.1)上游引物：5
′-
ggcttcggtcccttctgt-3
′
(seq id no.1)，下游引物：5
′-
caccacctgttcaaactctgc-3
′
(seq id no.2)。模板(lambda dna)、dna聚合酶、dntp等常规试剂购买自生物公司。
39.2)pcr体系如下：1.25u/25μl ex taq dna聚合酶，20mm tris-hcl(ph8.9)，20mm kcl，2mm mgcl2，dntps和引物(0.04μm)。含有cr
3
的pcr添加剂以终浓度40μm添加到pcr体系中。
40.3)pcr扩增程序如下：首先95℃2min预变性。然后35个循环包括94℃20s变性，55℃30s退火，72℃30s延伸。最后72℃延伸5min。pcr产物保存于4℃。
41.4)琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果。
42.pcr扩增结果如图2所示，没有加入含有cr
3
的pcr添加剂的对照组中pcr产物为涂布性拖尾条带。加入含有cr
3
的pcr添加剂的实验组中非特异性条带明显改善，适宜浓度下能够将pcr产物优化为单一目标条带，说明含有cr
3
的pcr添加剂的确能够抑制涂布性拖尾现象，提高pcr的特异性。
43.实施例3：含有al
3
的pcr添加剂提高pcr的特异性
44.1)上游引物：5
′-
ggcttcggtcccttctgt-3
′
(seq id no.1)，下游引物：5
′-
caccacctgttcaaactctgc-3
′
(seq id no.2)。模板(lambda dna)、dna聚合酶、dntp等常规试剂购买自生物公司。
45.2)pcr体系如下：1.25u/25μl ex taq dna聚合酶，20mm tris-hcl(ph8.9)，20mm kcl，2mm mgcl2，dntps和引物(0.04μm)。含有al
3
的pcr添加剂以终浓度15μm添加到pcr体系中。
46.3)pcr扩增程序如下：首先95℃2min预变性。然后35个循环包括94℃20s变性，55℃30s退火，72℃30s延伸。最后72℃延伸5min。pcr产物保存于4℃。
47.4)琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果。
48.pcr扩增结果如图3所示，没有加入含有al
3
的pcr添加剂的对照组中pcr产物为涂布性拖尾条带。加入含有al
3
的pcr添加剂的实验组中非特异性条带明显抑制，说明含有al
3
的pcr添加剂的确能够抑制涂布性拖尾现象，提高pcr的特异性。
49.以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。