一种宽宿主谱克罗诺杆菌噬菌体及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种宽宿主谱克罗诺杆菌噬菌体及 其应用。


背景技术：

2.克罗诺杆菌即阪崎肠杆菌(cronobacterspp.(enterobacter sakazakii))是重 要的食源性致病菌，各年龄阶段的人群均可感染，感染婴幼儿尤其是早产儿、 低体重儿或免疫受损婴儿致死率高达40％到80％。我国食品安全国家标准《gb10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品》中明文规定0～6月龄婴儿食用的 配方食品不允许检出克罗诺杆菌。克罗诺杆菌属有7个种，包括阪崎克罗诺杆 菌(c.sakazakii)，丙二酸盐克罗诺杆菌(c.malonaticus)，苏黎世克罗诺杆菌 (c.turicensis)，都柏林克罗诺杆菌(c.dublinensis)，莫金斯克罗诺杆菌(c. muytjensii)，尤尼沃斯克罗诺杆菌(c.universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(c. condimenti)。目前国内主要食品克罗诺杆菌污染调查研究发现有前五个种的菌 株引起的污染。
3.噬菌体由于具有高特异性和有效性的杀死宿主菌而对共生菌群没有影响的 优点，已经成为一种新的、安全可行的预防和根除食物及食物加工过程中微生 物污染的方法。前期文献报道分离出的噬菌体对奶粉中阪崎克罗诺杆菌的生长 有较好的抑制作用，而针对其他种的抑制效果不敏感或无抑制作用。由于克罗 诺杆菌的种多样性，以及噬菌体具有严格的宿主特异性，只能感染某一株或某 一类的细菌，目前尚缺乏能有效裂解多种克罗诺杆菌并能应用于生产实际中的 烈性噬菌体。因此，筛选宽宿主谱的噬菌体对于食品中克罗诺杆菌成为本领域 技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明从广州市广州城市河涌水中筛选分离获得一 种新型烈性噬菌体，通过对其性能的鉴定发现该噬菌体可以裂解多种克罗诺杆 菌株，宿主谱广且裂解效果好。所述噬菌体保藏编号为：gdmcc no:61184-b1， 分类名为：cronobacter bacteriophage，保藏日期为：2020年9月14日，保藏单 位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：中国广州市先烈中路100号59号 楼五楼广东省微生物研究所。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种克罗诺杆菌噬菌体，所述噬菌体为克罗诺杆菌噬菌体vb_ctup_a24， 其保藏编号为：gdmcc no:61184-b1，所述噬菌体属于短尾噬菌体，呈多面体 的头部和短尾结构，头部长127.6mm，宽56.7mm，尾部约36.1mm。
7.进一步地，所述噬菌体vb_ctup_a24的基因组全长为75,106bp，为 podoviridae科的新种，其基因组序列如seq idno：1所示，有108个编码序列 (cds)。
8.进一步地，所述噬菌体vb_ctup_a24不包含细菌耐药或/和毒力基因。由于 本发明的噬菌体不含有细菌耐药或/和毒力基因，在应用上具有安全性。
9.进一步地，所述噬菌体vb_ctup_a24在ph值4～11、在25～60℃条件下具 有耐性。本发明通过大量试验研究发现，噬菌体vb_ctup_a24在ph值4～11、 在25～60℃条件下仍保持原有效价。
10.本发明还提供了所述噬菌体vb_ctup_a24在制备抑制或杀灭克罗诺杆菌株 制剂中的应用。
11.进一步地，所述制剂为喷雾剂或洗剂。
12.进一步地，所述应用为在食品杀菌中的应用。
13.本发明还提供了一种含有本发明噬菌体vb_ctup_a24的组合物，所述组合 物至少含有本发明的噬菌体vb_ctup_a24。
14.本发明的有益效果为：本发明中的噬菌vb_ctup_a24可以裂解多种克罗诺 杆菌株，具有一定的广谱性。能在ph 4.0-11范围和温度25～60℃条件下具有良 好的稳定性，噬菌体效价没有发生明显变化，显示了良好的酸碱及温度耐受性， 为不同环境条件下防控克罗诺杆菌提供了良好的噬菌体来源；本发明中的噬菌 体vb_ctup_a24的基因分析显示其不携带任何毒力或抗生素耐药基因，可以安 全地运用于克罗诺杆菌的防控中。
附图说明
15.图1为噬菌体vb_ctup_a24噬菌斑图
16.图2为噬菌体vb_ctup_a24电镜图
17.图3为噬菌体vb_ctup_a24基因组ani分析结果示意图
18.图4为噬菌体vb_ctup_a24进化树分析结果示意图
19.图5为噬菌体vb_ctup_a24的温度耐受性测定结果示意图
20.图6为噬菌体vb_ctup_a24的ph耐受性测定结果示意图
21.图7为噬菌体vb_ctup_a24在液体食品中(冲调奶粉)的杀菌作用示意图 其中：(a)为4℃条件下噬菌体抑制阪崎克罗诺杆菌465g的生长情况；(b)为4℃ 条件下噬菌体抑制丙二酸盐克罗诺杆菌cro695w的生长情况；(c)为37℃条件 下噬菌体抑制阪崎克罗诺杆菌465g的生长情况；(d)为37℃条件下噬菌体抑制 丙二酸盐克罗诺杆菌cro695w的生长情况)。
具体实施方式
22.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体 实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
23.实施例1本发明噬菌体的分离与纯化
24.1.1水样的处理和富集增殖
25.本发明试验用于分离噬菌体的水样为2018年采集于广州城市河涌水。
26.将水样10000g离心10min，去除一些固体大颗粒和部分细菌，收集上清。 将上清液经过真空抽滤后，转移到一个干净无菌的容器中。添加终浓度为50mm 的mgso4。充分搅拌均匀，静置15-20min。将混合液经过真空抽滤后，倒弃上 清，收集滤膜。将滤膜剪碎成块状，放进干净无菌的烧杯中，加入适量的洗脱 液，充分搅拌混匀。将烧杯转移到超声波清洗器，超声洗脱4-5min，使噬菌体 颗粒从滤膜上充分洗脱下来。转移到50ml离心管中，4000g离心
2min，收集 上清液。小心将上清液通过直径为0.45μm的微孔滤膜转入新的无菌管，即为噬 菌体混合液。可放4℃冰箱保存备用(若长期保存可加入终浓度30％甘油，放 于4℃或-20℃保存)。
27.在无菌条件下用接种环分别取一环苏黎世克罗诺杆菌cro1541a1-1，划线接 种于显色平板上，37℃培养过夜，从平板上挑取单菌落，接种于5ml lb培养 基中，37℃培养过夜。将活化的菌种以1％的接种量接入5ml lb-ca培养基(lb 培养基中添加终浓度1-2mmol/l cacl2配置而成)中，37℃培养至指数生长期(约 3h)。吸取5ml噬菌体混合液与等体积的双料lb培养基(酵母提取物1g，蛋 白胨2g，nacl 1g，溶于100ml去离子水中，121℃高压灭菌20min)混合，再 加入500μl生长至指数生长期的菌液，37℃、150rpm培养过夜。将上述培养 液转移至无菌离心管中，加入终浓度0.1％v/v氯仿，剧烈振荡30s，静置5min 后，4000g离心15-20min，去除大部分完整菌体及菌体碎片。小心将上清液通 过直径为0.45μm的微孔滤膜转入新的无菌管，即为噬菌体样品，可放4℃冰箱 保存备用(若长期保存可加入终浓度为30％甘油，放于-20℃保存)。
28.1.2噬菌体的纯化和电镜观察
29.将活化的菌株以1％的接种量接入5ml lb-ca培养基中，于200rpm、37℃ 下培养3h。取100μl培养液与上述富集的100μl噬菌体样品到1.5ml离心管 中，混合均匀。将混合液与5ml 0.7％lb-ca软琼脂45℃相混合，平铺到1.5％lb 琼脂表面。37℃下静置培养6h，得到单个清晰可辨的中等大小的噬菌斑(图1)。 用接种环转接噬菌斑至干净的1.5ml离心管中，加入适量sm缓冲溶液，充分 搅拌，4000g离心15-20min，收集上清，将上清液通过直径为0.45μm的微孔 滤膜转入新的无菌管，即为噬菌体纯化液，纯化的步骤重复至少三次，成功分 离到克罗诺杆菌噬菌体，本发明将其命名为：vb_ctup_a24，双层琼脂板计数测 定其效价
30.将纯化的噬菌体悬液滴在覆有膜的载体网上，经2min后用滤纸吸去，滴一 滴pta，染色1min后吸去多余的液体，在空气中干燥，然后用透射电子显微镜 观察(图2)，属于短尾噬菌体，头部长约127.6mm，宽56.7mm，尾部约36.1mm。
31.实施例2噬菌体的全基因组测序及新种鉴定分析
32.向实施例1中0.5ml纯化的噬菌体悬液中加入dnase i和rnase a，37℃温 育30分钟后加入蛋白酶k，sds和edta，65℃温育30分钟后加入等体积苯酚， 涡旋振荡30s，12000g离心5min，移上层水相于新的离心管中。采取苯酚-氯仿
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异戊醇法(25：24：1)提取噬菌体基因组，涡旋振荡30s，12000g离心5min， 移上层水相于一新的离心管中；再用等体积氯仿抽提，重复抽提直到无苯酚的 气味；向上层抽提液中加入等体积的异丙醇，混匀后，-20℃放置30min后，4℃ 下12000g离心20min，收集沉淀；用70％的乙醇洗涤dna沉淀，12000g离心 5min，弃去乙醇，干燥dna沉淀加入20μl无菌水溶解dna，-20℃保存备用。 按照illumina测序仪文库构建说明书进行操作，最后使用illumina nextseq测序 仪进行全基因组测序。测序产生的数据经过q20筛选，去掉不合格数据，剩余 的reads使用spydes软件进行组装，利用prokka软件进行基因组注释，注释出 的orf提取出来利用ncbi的blastp进行蛋白质的二次注释。
33.全基因组分析显示，vb_ctup_a24的基因组全长为75,106bp，gc含量为 44.05％，可能的编码序列(cds)有108个，无耐药和毒力基因。在ncbi上进 行全基因组blastn分析，
最相似的噬菌体是cronobacter phage vb_csap_gap52， 覆盖度为95％，相似度为88.15％，其次是salmonella phage 7-11，覆盖度为14％， 相似度为80.24％，满足噬菌体新种的标准(与已有的种全基因组相似度小于 95％)，属于噬菌体podoviridae科的新成员。噬菌体基因组ani分析(图3)和 进化树结果(图4)也支持该结论。
34.实施例3测定噬菌体的宿主谱
35.将对数期的表1中的细菌培养液0.1ml与0.7％琼脂的软琼脂lb培养基(5 ml)轻轻混匀后，倒在普通lb底层平板上，自然干燥15min使上层培养基固 定。然后将5μl的噬菌体vb_ctup_a24纯化液点种到凝固好的上层平板上，自 然干燥后于37℃培养6h或过夜，出现噬菌斑表明该菌株为敏感宿主菌。结果由 表1可以看出本发明噬菌体可以裂解多株阪崎克罗诺杆菌，丙二酸盐克罗诺杆 菌，都柏林克罗诺杆菌，苏黎世克罗诺杆菌和莫金斯克罗诺杆菌，因此，本发 明获得的噬菌体vb_ctup_a24是一株广谱烈性噬菌体(表1)。
36.表1 噬菌体vb_ctup_a24宿主谱
[0037][0038]
表1中“ ”表示出现噬菌斑，能裂解
“‑”
表示未出现噬菌斑，不能裂解。
[0039]
实施例4测定噬菌体ph值和温度耐受性
[0040]
取0.1ml效价在109pfu/ml的噬菌体液于1.5ml离心管中，分别置于25℃、 30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的水浴中作用1h。 待作用时间结束后立即取出并置于冰上冷却。测定各自效价；取0.1ml效价在 109pfu/ml的噬菌体液于1.5ml离心管中，并加入0.9ml不同ph的lb培养基 (ph＝3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)，置于37℃下水浴中作用1h，待作 用时间结束后立即取出测定各自效价。
[0041]
结果如图5所示，噬菌体在25～55℃分别作用1h后，活性没有明显变化； 噬菌体在60℃作用1h后效价下降1.7lg pfu/ml，65℃作用1h后，活性显著下降 6.9lg pfu/ml，70℃作用1h检测不到噬菌体。
[0042]
结果如图6所示，噬菌体在ph为3时，效价下降5.9lg pfu/ml；ph为4～11 时，噬菌体活性没有变化，ph为12时，效价下降7.1lg pfu/ml。
[0043]
实施例5噬菌体在液态食品中的杀菌作用
[0044]
采用无菌水制备奶粉样品(10％w/v)，并混合均匀。取菌液(105cfu/ml)和 噬菌体(10
10
pfu/ml)各1ml加入50ml的奶粉液中，对照组采用pbs代替噬 菌体液，置于4℃和37℃、200rpm的条件下培养，分别在0、2、4、6、24h时 取样，使用pbs连续稀释，通过环凯的克罗诺杆菌显色平板计数法测定活菌数 来检测杀菌效果。
[0045]
结果如图7所示，噬菌体对阪崎克罗诺杆菌465g和丙二酸盐克罗诺杆菌 cro695w均有很好的杀菌效果(p《0.05)。4℃条件下阪崎克罗诺杆菌465g加噬 菌体的实验组活菌数较之对照组从2h到24h降低0.5lg～1.7lg cfu/ml左右(图 7a)，37℃条件下阪崎克罗诺杆菌活菌数2h到6h较之对照组降低了3.2～6.8lgcfu/ml，24小时比对照组的活菌数低了5.0lg cfu/ml(图7c)。如图7b所示，4℃ 条件下丙二酸盐克罗诺杆菌cro695w加噬菌体的实验组活菌数较之对照组随着 时间推移从2h降低0.8lg cfu/ml，4～6h降低到1.6lg cfu/ml，24h后活菌数低于 检测限(《10cfu/ml)。37℃条件下丙二酸盐克罗诺杆菌cro695w加噬菌体的实 验组活菌数较之对照组2h减少4.3cfu/ml，4h到6h低于检测限，24h低7.3lg cfu/ml(图7d)。37℃条件下杀菌效果强于4℃。
[0046]
本实施例用于噬菌体食品防控实验用菌株阪崎克罗诺杆菌465g和丙二酸 盐克罗诺杆菌cro695w已保存于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，保 藏号分别为：gdmcc 61206和gdmcc 61205。
[0047]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。