一种短肽及其在癫痫治疗中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药和癫痫的治疗领域，尤其涉及一种短肽及其在癫痫治疗中的应用，特别涉及其降低癫痫神经元异常放电及其在保护神经元中的应用。


背景技术：

2.癫痫是一种大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的慢性疾病。据中国最新流行病学资料显示，国内癫痫的总体患病率为7.0
‰
，年发病率为28.8/ 10 万，1年内有发作的活动性癫痫患病率为4.6
‰
。据此估计中国约有900万左右的癫痫患者，其中500～600万是活动性癫痫患者，同时每年新增加癫痫患者约40万，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。
3.癫痫的发病本质是神经元异常放电，因此，目前临床应用以及正在开发的抗癫痫药物通过靶向降低神经元放电，进而减少神经元的超兴奋性。癫痫的神经元异常放电可导致神经元死亡进而导致脑损伤，因此保护神经元免受异常放电的损伤是目前函待解决的重要科学问题。
4.近年来，随着人们对癫痫发生的分子机理的不断揭示，癫痫特异的靶点治疗日益受到重视，而获得适合的靶点是癫痫治疗的关键环节。随着分子生物学方法的飞速发展，诱导大量纯化多肽的方法不断更新，为癫痫靶向治疗开辟环节新纪元。无镁细胞外液处理神经元3小时后，神经元出现高幅高频的自发性动作电位，被认为是一种经典的癫痫体外模型。该模型目前被广泛用于筛选抗癫痫药物。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种短肽及其在癫痫治疗中的应用。该短肽起到抑制放电和神经保护作用，为靶向抗癫痫药物的研发奠定理论基础。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
7.一种短肽，所述短肽的氨基酸序列如seq id no.1所示：leu-ile-ile-gln-arg-ala。
8.进一步，所述短肽是通过人工合成纯化获得。
9.进一步，所述短肽能增加癫痫神经元的存活率。
10.进一步，所述短肽能减少癫痫神经元放电、降低癫痫神经元超兴奋性。
11.进一步，所述短肽能减少癫痫动物异常放电与癫痫发作时间。
12.进一步，所述短肽能改善癫痫神经元的凋亡。
13.所述短肽在制备用于治疗癫痫疾病的靶向抗癫痫药物中的应用。
14.进一步地，所述药物为任何药学上可接受的剂型。
15.进一步地，所述药物为任何药学上可接受的剂量。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
17.1）本发明提供的短肽在氨基酸序列上具有原始创新性。
18.2）本发提供的短肽是通过人工合成纯化获得，制备方法简单，纯度可控。
19.3）本发明中短肽经实验验证，可以从改善神经细胞存活率、改善癫痫神经元放电、减少凋亡作用发挥抗癫痫的药理作用，为靶向抗癫痫药物的研发奠定理论与实践基础。
附图说明
20.图1为cell counting kit-8检测本发明短肽对无镁癫痫模型neuro-2a神经细胞存活率的影响。
21.图2为膜片钳检测本发明短肽对无镁癫痫模型神经元异常放电的影响。
22.图3为脑电图检测本发明短肽对自发性癫痫大鼠癫痫发作的影响。
23.图4为western blot检测本发明短肽对无镁癫痫模型细胞给药后neuro-2a神经细胞凋亡的影响。
24.图5为光学显微镜观察本发明短肽给予无镁癫痫模型后neuro-2a神经细胞的形态图。标尺：100μm。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。本发明的短肽是强耀生物公司应用高效液相色谱法合成制备，电喷雾电离质谱方法进行分析。商品号：04010042860，纯度为98.88%，分子量为721.9。
26.实施例一 无镁癫痫细胞模型的建立、实验分组与给药方法。
27.首先进行细胞培养。原代神经元的培养：取新生大鼠脑，显微镜下分离双侧海马，置于d-hanks 液；加入0.125% 胰蛋白酶，于37 ℃培养箱消化15～30 min。种植培养液（dmem/f12 15%血清）终止消化，调整细胞密度为2
×
105/cm
2 后种植于2.0 cm
×
2.0 cm 的盖玻片上。3～4d 半量更换饲养培养液（2% b27 neurobasal
tm-a-medium）。neuro-2a细胞密度达到80% ~ 90%时，去培养基，10 ml pbs清洗两次。加入3 ml 含0.25% edta的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min。加入1 ml dmem完全培养基终止胰酶消化，转移至15 ml 离心管。加入10 ml pbs清洗细胞，并转移至15 ml 离心管，2000rpm 离心2min，弃上清液。再加入10 ml pbs，吹匀，吸取10 μl 进行计数，按照1
×
106/盘接种，在含5%co2的细胞培养箱继续培养。无镁液（mmol
·
l-1
）：nacl 145，kcl 2.5，cacl
2 2，hepes 10，glucose 10，glycine 0.001，用naoh 调ph至7.4；细胞外液（mmol
·
l-1
）：nacl 135，kcl 5.4，mgcl21.0，nah2po
4 0.33，hepes 10，glucose 5.5，用naoh调ph 至7.4；培养10天后的神经元或neuro-2a细胞放入“无镁”细胞外液处理3 小时后，重新放入含镁的正常细胞外液中培养。此时的神经细胞即为无镁癫痫细胞模型。恢复正常细胞外液的同时给予不同浓度的短肽，处理24h后进行如下实验。实验分为正常组、无镁癫痫细胞模型组与无镁癫痫细胞 短肽组。
28.实施例二 cck8法检测短肽对neuro-2a细胞系存活率的影响。
29.cell counting kit-8（简称cck-8）试剂可简便而准确地检测细胞存活率。
30.1）在96孔板中配置细胞悬液。将培养板置于培养箱培养24小时。
31.2 ) 向培养细胞中加入不同浓度多肽药物并作用24小时。
32.3) 向每孔加入10 μl cck8溶液。
33.4) 将培养板置于培养箱培育3小时。
34.5) 用酶标仪测定450 nm处的吸光度。
35.cell counting kit-8检测结果如图1所示，给予无镁处理neuro-2a神经细胞不同的短肽浓度1 μm 和2 μm，其中2 μm短肽改善无镁癫痫细胞存活率的效果最佳。****p<0.0001，与正常组相比；n.s.没有统计学差异，与无镁癫痫模型组相比；
## p<0.01，与无镁模型 短肽组（1 μm）相比。n=6，每组6批细胞。
36.实施例三 膜片钳技术检测短肽对无镁癫痫细胞模型原代培养大鼠神经元放电的影响。
37.膜片钳技术可以记录细胞的电流和电压。无镁液（mmol
·
l-1
）：nacl 145，kcl 2.5，cacl
2 2， hepes 10，glucose 10，glycine 0.001，用naoh 调节ph至7.4。细胞外液（mmol
·
l-1
）：nacl 135，kcl 5.4，mgcl
2 1.0，nah2po
4 0.33，hepes 10，glucose 5.5，用naoh 调ph至7.4。电极内液（mmol
·
l-1
）：k-aspartate 50，kcl 20，hepes 20，egta 1，mgcl
2 1，cacl
2 0.2，nacl 13.6，k2atp
3 3，koh 调ph至7.4。将培养10天后的神经元放入“无镁”细胞外液处理3小时后，重新放入含镁的正常细胞外液中培养。电阻为2～5 mω。利用膜片钳电流钳技术在电流钳模式下，分别记录正常神经元、无镁癫痫神经元和无镁癫痫神经元组 短肽的兴奋性。应用德国heka膜片钳放大器，egor软件进行记录，如图2所示。与正常神经元相比，无镁癫痫细胞模型显示超兴奋性，但2 μm短肽给予后可以显著减少无镁癫痫细胞模型的超兴奋性。**p<0.01，与正常组相比； ## p<0.01，与无镁模型组相比。n=5，每组5个细胞。
38.实施例三 脑电图技术检测短肽对自发性癫痫大鼠 (tremor) 神经元放电的影响。
39.用10%水合氯醛（0.3 ml/100g）麻醉正常wisar大鼠和自发性癫痫大鼠，植入脑电图电极。皮质电极和海马电极分别缓慢植入皮质（距颅骨上的脑干外侧3.0 mm和嘴侧3.0 mm）和左侧海马（距脑干外侧2.0 mm，尾侧4.0 mm和距皮质表面3.0 mm）。给药和电极植入后，分别于第7天和第24小时记录神经元电活动。在脑电监测中，大鼠先在40
×
40
×
40 cm的隔音箱中熟悉环境20分钟以上，然后进行30分钟的脑电记录。当5-7hz棘波复合物在皮层和海马持续1s以上时，被认为是一个单一的失神样癫痫发作事件。当两个独立的5-7hz棘波样复合物之间的时间间隔小于1秒时，这两个反应被认为是一次癫痫发作。给予不同浓度的短肽，处理24小时后进行如下实验。实验分为正常大鼠组、癫痫大鼠组、癫痫大鼠 短肽组，如图3所示。与正常动物相比，癫痫大鼠组癫痫放电时间显著增加，给药后显著减少癫痫发作的时间。****p<0.0001，与正常wistar大鼠组相比； ## p<0.01，与自发性癫痫大组相比。n=4，每组4只大鼠。
40.实施例四 western blot方法检测细胞凋亡。
41.ripa裂解液裂解贴壁细胞。匀浆超声后低温离心取上清液bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。加入上样缓冲液煮沸变性后取50μg/孔，5% （质量浓度）浓缩胶和12%（质量浓度）分离胶进行sds-page 电泳，浓缩胶电压80v 50min，分离胶电压120v 70min。转印至pvdf膜（200ma，2小时）。5%（质量浓度）bsa常温封闭1小时加入一抗兔抗鼠多克隆抗体caspase-3、bcl-2 和bax (1:1000)，室温摇床上缓慢摇动孵育过夜。pbs洗涤3次。加入二抗羊抗兔抗体1:3000，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2小时。 tbst洗膜后ecl化学发光，按
一抗说明书上的蛋白相对分子质量确定目的条带位置并测定灰度值，目的条带灰度值与gapdh灰度值的比值为caspase-3蛋白相对表达量，如图4所示，western blot方法揭示短肽可改善无镁癫痫模型细胞凋亡结果，与正常neuro-2a神经细胞相比，无镁癫痫细胞模型显示凋亡指标caspase-3蛋白表达上调，但2μm短肽给予后可以显著减少无镁癫痫细胞蛋白caspase-3的表达。与正常neuro-2a神经细胞相比，无镁癫痫细胞模型显示抗凋亡指标bcl-2 /bax蛋白表达下调，但2μm短肽给予后可以显著减少无镁癫痫细胞蛋白抗凋亡指标bcl-2 /bax蛋白表达上调。*p<0.05，与正常组相比； ## p<0.01或 #
p<0.05，与无镁模型组相比。n=6，每组6批细胞。
42.实施例五 neuro-2a细胞培养及光学显微镜观察。
43.neuro-2a按照1
×
106/盘接种，在含5%co2的细胞培养箱培养。给予2μm短肽24小时后，光学显微镜检测细胞形态，如图5所示，neuro-2a细胞给予无镁处理3h后，细胞形态损伤，细胞肿胀、坏死。给予2μm短肽24 h后，无镁癫痫细胞形态部分恢复。