适用于电刺激骨再生的电活性钙钛矿水凝胶及其制备和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种适用于电刺激骨再生的电活性钙钛矿水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.骨是脊椎动物体内的硬组织，主要由羟基磷灰石和胶原纤维等构成。生物体内的骨骼结构一旦造成破坏，就会引发一系列疾病，如骨折，骨质疏松，骨关节炎以及骨缺损等。
3.目前，骨损伤已经成为日益严重的健康问题，对人类的身体健康造成了巨大的威胁。
4.因此，有效的预防及治疗骨科相关的疾病成为当代社会亟需解决的关键问题。
5.尽管自体骨和异体骨移植都可以用于骨缺损修复，但是其结构单一或费用较为昂贵，使其临床应用受到了限制。因此，仍需进一步研究较为理想的材料用于骨缺损修复。
6.为了解决骨缺损修复的原料问题，仿生水凝胶和支架已被提出并广泛投入试验。
7.仿生水凝胶具有良好的生物相容性，在体内可降解并可携带治疗药物，从成分和结构上模拟骨再生环境，以加速骨科疾病的治疗。
8.此外，在过去的二十年中，电刺激作为一种物理治疗手段已被应用于部分医疗场景。
9.研究表明，生物体维持良好的自然电活动对生物组织的稳定性和功能具有重要意义。
10.骨具有介电、压电、热电性和铁电性等天然的生物电信号，并且被认为是调节骨生长、重塑和骨折愈合的重要因素。
11.基于电信号的生物反应和潜在的临床效应，仿生电刺激和电活性植入物已被开发用于再生组织损伤。
12.然而，组织电仿生工程主要应用于神经、心血管组织等传统可兴奋组织的治疗，而忽略了同样具有生物电特性的骨组织的治疗，早期恢复正常骨电活动可能是骨形成的关键限速步骤。
13.公开号为cn111303449a的专利说明书公开了一种用于皮肤修复的电活性水凝胶的制备和应用，通过与外源电刺激耦合共同作用促进皮肤伤口愈合与组织再生。
14.根据上述现状，电活性水凝胶耦合电场刺激是治疗骨组织缺损重要的发展趋势。
15.因此，骨仿生材料除了常规地在结构和形态上模拟天然骨的细胞外基质外，还需要提高组织植入物的整体导电性。


技术实现要素：

16.针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了一种适用于电刺激骨再生的电活性钙钛矿水凝胶的制备方法。
17.一种适用于电刺激骨再生的电活性钙钛矿水凝胶的制备方法，包括步骤：
18.(1)将海藻酸钠粉末溶解在去离子水中，用氢氧化钠溶液调节到ph＝7.4～8.0(优选ph＝8.0)，滴加甲基丙烯酸酐溶液，海藻酸钠质量与甲基丙烯酸酐体积之比为5～20mg:0.05ml，搅拌反应得到接枝甲基丙烯酸的海藻酸钠溶液，记为溶液a；
19.(2)将溶液a透析并干燥得到甲基丙烯酸海藻酸钠粉末，溶于去离子水，得到纯化的溶液b；溶液b中甲基丙烯酸海藻酸钠的浓度为10～30mg/ml；
20.(3)向溶液b中加入磷酸钙、钙钛矿和聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)，搅拌均匀得到溶液c；
21.(4)取光引发剂溶于溶液c，在紫外线照射下交联反应得到适用于电刺激骨再生的电活性钙钛矿水凝胶。
22.作为优选，步骤(1)中海藻酸钠质量与甲基丙烯酸酐体积之比为10mg:0.05ml；
23.甲基丙烯酸海藻酸钠、磷酸钙、钙钛矿和聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)的比例为20mg:10mg:10mg:0.1ml。
24.在一优选例中，步骤(1)中，搅拌反应的温度为4℃，搅拌反应的时间为12～24h，溶液a中海藻酸钠的终浓度为10mg/ml，甲基丙烯酸酐的终浓度为5vol％。
25.在一优选例中，步骤(2)中，溶液b中纯化的甲基丙烯酸海藻酸钠浓度为20mg/ml。
26.在一优选例中，步骤(3)中，磷酸钙为纳米棒状晶体，钙钛矿为纳米晶体。
27.在一优选例中，步骤(3)中，溶液c中磷酸钙浓度为10mg/ml，钙钛矿浓度为10mg/ml，聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)浓度为10vol％。
28.步骤(3)中，钙钛矿优选为钛酸镁、钛酸钡、钛酸钙中的至少一种，进一步优选为钛酸镁。钛酸镁不仅具有钙钛矿共有的电学特性，还能解离出镁离子促进骨形成。
29.在一优选例中，步骤(4)中，按照光引发剂终浓度0.5mg/ml向溶液c中加入光引发剂，交联反应时间为0.5～1h。
30.本发明还提供了所述的制备方法制备得到的电活性钙钛矿水凝胶，为均质的凝胶固体状，具有优异的生物相容性、机械性能、电化学特性和导电性。
31.本发明还提供了所述的电活性钙钛矿水凝胶在制备用于修复骨缺损的药物、支架中的应用。
32.所述的电活性钙钛矿水凝胶与电刺激耦合，可协同显著促进成骨分化和骨缺损修复。在一优选例中，所述电刺激的电压为100～500mv。
33.本发明以海藻酸钠、磷酸钙、钙钛矿和聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)为主要原材料，利用经过修饰后的海藻酸钠的交联特性，以及钙钛矿和聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)的电学特性，配合各原料的合成比例以及工艺条件的精确控制，可制备得到具有电活性的钙钛矿水凝胶。由本发明的制备方法得到的电活性钙钛矿水凝胶不仅具有优异的生物相容性，还具有良好的机械性能、电化学活性和导电性。进一步地，该水凝胶能与外源电刺激耦合共同促进细胞的成骨分化，进而促进骨缺损的修复，因此其在制备用于修复骨缺损的药物或支架方面具有重要的应用价值。
34.与现有技术相比，本发明具有如下显著的技术效果：
35.1)本发明的电活性钙钛矿水凝胶的制备方法工艺简单、操作溶液、成本低廉、原料易得，从原料使用到制备工艺过程均绿色无污染，利于工业应用。本发明利用修饰后的海藻酸钠与二价阳离子的配位作用以及紫外线作用下的化学交联作用实现水凝胶制备，制备过
程简单，但所述水凝胶具有良好的机械性能和压缩回复能力。
36.2)本发明中，同时利用了钙钛矿和聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)来提升所述水凝胶的电学特性，钙钛矿是一类性能优异的压电材料，但存在导电性不足的缺点，因此引入聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)来辅助改善其导电性，从而使所述水凝胶能够作为电刺激辅助治疗手段的基底。
37.3)本发明的电活性钙钛矿水凝胶具有优异的生物相容性，能在电刺激的共同作用下促进细胞的钙富集和成骨分化，进而促进骨缺损的修复，在骨再生组织工程方面具有潜在的应用前景。
附图说明
38.图1为实施例1制备得到的电活性钙钛矿水凝胶的电路连接照片(a)、透射电镜照片(b)和高分辨透射电镜照片(c)，以及应变-模量随时间变化图(d)，图中标尺：100nm(b)，10nm(c)；
39.图2为对照组和实施例1制备得到的电活性钙钛矿水凝胶的细胞培养染色图，图中标尺：200μm；
40.图3为对照组和实施例1制备得到的电活性钙钛矿水凝胶与骨髓间充质干细胞培养7天后的碱性磷酸酶染色图(a)，以及培养14天后的茜素红s染色图(b)；
41.图4为对照组和实施例1制备得到的电活性钙钛矿水凝胶用作骨缺损修复2周和4周之后的x片和ct结果；
42.图5为对照组和实施例1制备得到的电活性钙钛矿水凝胶用作骨缺损修复2周和4周之后的he染色结果图，图中标尺：2mm；
43.图6为对比例1制备得到的水凝胶的电路连接图片。
具体实施方式
44.下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
45.实施例1
46.(1)将海藻酸钠粉末溶解在去离子水中，用氢氧化钠溶液调节到弱碱性溶液(ph＝8.0)，缓慢滴加甲基丙烯酸酐溶液，在4℃下搅拌24小时反应得到接枝甲基丙烯酸的海藻酸钠溶液a，所述溶液a中海藻酸钠的终浓度为10mg/ml，甲基丙烯酸酐的终浓度为5vol％；
47.(2)将溶液a透析并干燥得到甲基丙烯酸海藻酸钠粉末，溶于去离子水，得到纯化的溶液b，所述溶液b中纯化的甲基丙烯酸海藻酸钠浓度为20mg/ml；
48.(3)向溶液b中加入磷酸钙、钛酸镁和聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)，搅拌均匀得到溶液c；溶液c中磷酸钙浓度为10mg/ml，钙钛矿浓度为10mg/ml，聚(3,4-亚乙基二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)浓度为10vol％；
49.(4)按照光引发剂i2959终浓度0.5mg/ml向溶液c中加入光引发剂i2959，在紫外线照射下交联反应0.5～1小时得到所述的电活性钙钛矿水凝胶。
50.如图1a所示，制备的电活性钙钛矿水凝胶呈黑色均质的凝胶固体状，具有优异的
导电性，能够作为灯泡电路的连接物。
51.如图1b所示，制备的电活性钙钛矿水凝胶的透射电镜结果显示磷酸钙纳米棒状晶体和钛酸镁纳米晶体，以及周围少量的有机纤维。
52.如图1c所示，制备的电活性钙钛矿水凝胶的高分辨透射电镜显示了磷酸钙和钛酸镁的晶格条纹，分别是(002)和(104)晶面，证实了这两种晶体。
53.如图1d所示，制备的电活性钙钛矿水凝胶的随应变改变的水凝胶模量响应曲线，应变在100％和0.1％之间循环变化，水凝胶的模量始终能够恢复到初始水平，表明水凝胶具有较好的回复性能。
54.应用例1电活性钙钛矿水凝胶的细胞生物相容性评估
55.将100μg实施例1的电活性钙钛矿水凝胶铺到96孔板底部作为实验组，空白的96孔板作为对照组。将实验组和对照组分别在紫外灯照射杀菌后，将骨髓间充质干细胞按照每孔3000个细胞的密度种植于孔板中，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，每2天更换一次培养液。培养1、3和5天后，观察细胞的生长情况，结果如图2所示。
56.图2为实验组和对照组分别培养1、3和5天以后的细胞染色图。可以看出，实验组的细胞数量与对照组的细胞数量相近，表明实施例1的电活性钙钛矿水凝胶具有较好的细胞相容性。
57.应用例2电活性钙钛矿水凝胶的成骨分化能力评估
58.(1)将骨髓间充质干细胞按照每孔20万细胞的密度铺12孔板，待贴壁后，将100μg经过紫外线灭菌的实施例1的电活性钙钛矿水凝胶铺到细胞上方，作为水凝胶组，而空白的12孔板作为对照组，同时加入成骨诱导液，成骨诱导液的成分为含有10-8
m地塞米松、50μg ml-1
抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠和10％胎牛血清的培养基，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，每2天更换一次成骨诱导培养液。其中水凝胶组 电刺激，每天施加100mv的方波交流电压30分钟。培养7天以后，观察细胞的生长情况并用碱性磷酸酶染液染色，结果如图3a所示。
59.(2)将骨髓间充质干细胞按照每孔20万细胞的密度铺12孔板，待贴壁后，将100μg经过紫外线灭菌的实施例1的电活性钙钛矿水凝胶铺到细胞上方，作为水凝胶组，而空白的12孔板作为对照组，同时加入成骨诱导液，成骨诱导液的成分为含有10-8
m地塞米松、50μg ml-1
抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠和10％胎牛血清的培养基，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，每2天更换一次成骨诱导培养液。其中水凝胶组 电刺激，每天施加100mv的方波交流电压30分钟。培养7天以后，观察细胞的生长情况并用茜素红s对矿化结节进行染色，结果如图3b所示。
60.图3a为细胞培养7天后的碱性磷酸酶染色结果，可见相较于对照组，水凝胶组和附加电刺激的水凝胶组显示出显著更深的染色，尤其是附加电刺激时更进一步提升，这两组碱性磷酸酶活性更高，说明实施例1的电活性钙钛矿水凝胶和电刺激具有促进成骨分化表达的效果。
61.图3b为细胞培养14天后的矿化结节茜素红s染色结果，相较于对照组，水凝胶组生成了更多的矿化结节，在电刺激附加时染色更深，说明实施例1的电活性钙钛矿水凝胶和电刺激能够诱导骨髓间充质干细胞生成更多的矿化结节。
62.应用例3电活性钙钛矿水凝胶的骨缺损修复的x射线和ct结果
63.取8周龄的大鼠若干，破开皮肤后在股骨干上钻出3
×
5mm的长方形骨缺损。之后，取相应大小的实施例1的电活性钙钛矿水凝胶置于缺损位点内，然后缝合，作为水凝胶组和水凝胶 电刺激组。对照组则选用磷酸钙基的海藻酸钠水凝胶作为参照。放入水凝胶后缝合大鼠腿部皮肤，于无菌环境继续正常饲养。其中水凝胶 电刺激组的大鼠需要每天在股骨干两端施加0.5v的方波交流电压30分钟，以耦合外源电刺激。在2周、4周时用二氧化碳处死大鼠后，取出股骨，采用x射线和ct扫描表征股骨缺损部位，观察骨缺损的修复情况。
64.图4为对照组、水凝胶组和水凝胶 电刺激组的大鼠在手术2周和4周之后的股骨x片和ct图像。结果显示，2周时，对照组的骨缺损位置基本没有新骨生成，只有少量矿化沉积结节，而水凝胶组则生成了较多新骨，尤其是附加电刺激组的新骨基本已经覆盖整个缺损部位。4周时，对照组的骨缺损位置仅有较薄的一层新骨覆盖，表面十分粗糙；水凝胶组的缺损位置基本已经被新生骨组织填满；而附加电刺激组的股骨表面已经基本平整，几乎完全愈合。
65.应用例4电活性钙钛矿水凝胶的骨缺损修复的he染色结果
66.将应用例3所述的手术后经过2周和4周修复的带有骨缺损的股骨置于4％多聚甲醛中固定2天，而后脱钙2周，经过脱水和石蜡包埋后进行切片得到骨组织切片。使用苏木精和伊红染色得到he染色切片，用显微镜观察切片并拍照。
67.图5为对照组、水凝胶组和水凝胶 电刺激组的大鼠在手术2周和4周之后的骨组织切片he染色图像。可见2周时，对照组的股骨标本缺损区域几乎没有新的组织生成，水凝胶组则已经有疏松的结缔组织覆盖，水凝胶 电刺激组的缺损已经开始减小。4周时，对照组的缺损仍然明显，水凝胶组的新骨基本已与原生骨吻合，而电刺激作用下的缺损位点几乎完全愈合，损伤修复组织被成型的新骨包绕在内部。
68.对比例1
69.与实施例1的区别仅在于所述制备方法中步骤(3)的钛酸镁被替换成等量磷酸钙，其余步骤和条件均相同。所制得水凝胶如图6所示，其导电性不佳，难以用作电刺激治疗的基底。
70.此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。