人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导剂及其用途的制作方法

1.本发明属于干细胞领域，涉及干细胞的定向诱导分化，具体涉及人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导剂及其用途。


背景技术：

2.间充质干细胞来源十分广泛，最初在骨髓中分离得到，但骨髓间充质干细胞受供体年龄和健康状况的影响，并且其收集过程会对供体造成创伤。近年来，脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，脐带间充质干细胞能表达多种胚胎干细胞特有的分子标志，分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无伦理道德问题的限制，是最具临床应用前景的多能干细胞之一。
3.急性创伤及退行性关节疾病均可能导致软骨损伤，由于关节软骨无血管、无神经、无淋巴管以及缺乏干细胞的特征，使其自我修复潜力非常有限，若不及时治疗，最终将发展为骨关节炎。传统的关节镜清理、骨髓刺激技术、自体或同种异体骨软骨移植、自体软骨细胞移植和金属等人工材料修复或替代局部软骨损伤，存在纤维软骨再生、供体部位并发症、移植物失败、种子细胞去分化、替代物松动翻修等局限性和不足。近些年来，基于脐带间充质干细胞等间充质干细胞的再生医学为软骨病损提供了一种很有希望的治疗策略。
4.寻找经济有效的诱导剂，是实现以脐带间充质干细胞为软骨组织工程种子细胞的关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导剂及其用途。
6.本发明目的通过如下技术方案实现：
7.黄腐酚用作人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导剂的用途。
8.黄腐酚用于诱导人脐带间充质干细胞成软骨分化的用途。
9.黄腐酚用于制备诱导人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养基的用途。
10.技术效果：
11.本发明发现，黄腐酚可以诱导人脐带间充质干细胞成软骨分化，可以用作人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导剂并用于制备诱导人脐带间充质干细胞成软骨分化的培养基。
附图说明
12.图1为hucmscs倒置显微镜下观察结果。
13.图2为阿利辛蓝染色结果。
14.图3为westernblot凝胶成像图。
具体实施方式
15.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
16.一、实验材料
17.黄腐酚购自上海源叶生物，hplc≥99％。
18.人脐带组织取自健康足月顺产胎儿，置于含有1％双抗的无菌pbs溶液中，8h内使用。
19.α-mem培养基、胎牛血清fbs和胰酶购自美国gibco公司。
20.fitc或pe标记的小鼠抗人cd90、cd105、cd73、cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr抗体及各相关同型对照购自美国ebioscince公司。
21.sox9、colⅱ和β-actin一抗以及hrp标记二抗购自abcam。
22.二、实验方法
23.1、脐带间充质干细胞(hucmscs)的分离、培养和鉴定
24.hucmscs的分离和培养：将10～15cm足月新生儿脐带置于含有1％双抗的无菌pbs溶液中，转移至超净工作台，用含有1％双抗的无菌pbs溶液反复冲洗，洗净血管内污血，然后移至hank's溶液中，去除两条脐静脉和一条脐动脉，剥离外皮，暴露中间的胶冻样的华通胶，剪成小段，晾干，剪成1mm3大小，铺至t75培养瓶底部，反转培养瓶，在组织块对侧加入10ml含有10％fbs和1％双抗的α-mem培养基，于37℃、5％co2、饱和湿度条件培养。12h后将培养瓶反转使培养基漫过组织块，继续培养约14d至组织块周围有细胞爬出时，去除组织块，用0.25％胰蛋白酶消化约30～60s，中止消化后1000r/min离心5min，重悬后接种至培养皿中，每3d换一次液，取第5代细胞在倒置显微镜下观察，用于后续实验。
25.hucmscs的鉴定：取第5代hucmscs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1
×
106个/ml，每离心管中加入1ml细胞悬液，无菌pbs洗涤2次，1000
×
g离心5min，弃上清，100μlpbs重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量cd90、cd105、cd73、cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000
×
g离心5min，pbs洗涤2次，加入500μl pbs重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
26.2、分组、诱导分化、阿利辛蓝染色和软骨标志蛋白检测
27.基础成软骨诱导培养基的配制：
28.在含有10％fbs和1％双抗的α-mem培养基中添加6.25mg/l胰岛素、6.25mg/l转铁蛋白、10μg/l转化生长因子β1、0.1μmol/l地塞米松和50mg/l维生素c。
29.取生长状态良好的第5代hucmscs，胰酶消化，用含有10％fbs和1％双抗的α-mem培养基制成细胞悬液，按1
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107/皿接种于10cm细胞培养皿中于37℃、5％co2、饱和湿度条件培养。待hucmscs贴壁后，诱导ⅰ、ⅱ、ⅲ组分别更换为含有10、20、50μg/ml黄腐酚的基础成软骨诱导培养基继续培养，对照组更换为基础成软骨诱导培养基继续培养。每2-3d半量更换培养基，继续培养5d：
30.2.1阿利辛蓝染色
31.收集部分细胞，pbs洗涤，多聚甲醛固定，pbs洗涤再次洗涤，加入阿利辛蓝染色液染色，显微镜下观察。
32.2.2western blot检测软骨标志蛋白表达
33.收集部分细胞，pbs洗涤，提取总蛋白，bca法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度一致后，加入5
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上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入sox9、colⅱ和β-actin一抗，4℃孵育过夜。tbst反复洗膜后，hrp标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照。
34.3、统计学分析
35.采用graphpad prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，p《0.05认定为差异显著。
36.三、实验结果
37.1、hucmscs分离、培养和鉴定
38.hucmscs贴壁生长，倒置显微镜下观察结果见图1，呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合hucmscs的细胞生物学特点。流式细胞仪检测显示cd90、cd105、cd73阳性表达(＞98％)，cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr阴性表达(＜2％)，符合hucmscs的表面标记特点。
39.2、阿利辛蓝染色
40.图2为阿利辛蓝染色结果，由于诱导培养时间较短，对照组仅呈现较弱的阳性染色，但诱导ⅰ、ⅱ、ⅲ组均呈现明显的阳性染色结果，且染色程度与黄腐酚的剂量正相关。阿利辛蓝染色检测的是软骨中的软骨粘多糖，该结果说明诱导ⅰ、ⅱ、ⅲ组出现明显的成软骨分化，分化程度与黄腐酚的剂量正相关。
41.3、软骨标志蛋白表达水平
42.图3为western blot凝胶成像图，由于诱导培养时间较短，对照组软骨标志蛋白sox9、colⅱ表达水平较低，但诱导ⅰ、ⅱ、ⅲ组sox9、colⅱ蛋白表达水平均显著升高，且升高水平与黄腐酚的剂量正相关。sox9、colⅱ蛋白为软骨标志性蛋白，该结果说明诱导ⅰ、ⅱ、ⅲ组出现明显的成软骨分化，分化程度与黄腐酚的剂量正相关。