普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因PvEXO70及应用

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70及应用
技术领域
1.本发明涉及普通菜豆镰孢菌枯萎病防治领域，特别是一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70及应用。


背景技术：

2.普通菜豆(phaseolus vulgaris l.)是最重要的食用豆类之一，约占全球食用豆类总产量的50％，是全球产量最高的食用豆类(phillip et al.,2004)。普通菜豆是人类饮食中植物蛋白质(约22％)，维生素(叶酸)和矿物质(钙，铜，铁，镁，锰，锌)的重要来源(broughton et al.,2003)，此外食用普通菜豆对癌症、糖尿病和心脏病等影响人类健康的重要疾病也有很好的预防和治疗作用(hangen&bennink,2003)。
3.真核生物的内膜系统和质膜间的囊泡运输是由栓留因子(tethering factors)参与调节的。栓留因子能够与snare蛋白(soluble n-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein receptor)和小gtpase相互作用，在囊泡运输过程中使囊泡和内膜区室联系起来，在囊泡的锚定和停靠过程中发挥重要的作用(sztul&lupashin,2006；cai et al.,2007；et al.,2010)。其中研究最为深入和进展最快的是胞泌复合体(exocyst)。胞泌复合体由sec3、sec5、sec6、sec8、sec10、sec15、exo70和exo84组成，这8个亚基在真核生物中保守存在(terbush et al.,1996)。目前的研究表明，植物的胞泌复合体在植物的生长发育过程(fendrych et al.,2010；kulich et al.，2010；wang et al.,2010)和防御系统(pecenkova et al.,2011；liu et al.,2017；ma et al.,2017；fujisaki et al.,2015)中起到重要的作用。拟南芥胞泌复合体exo70亚基广泛参与了与膜泡转运有关的生物学过程，如细胞顶端生长、细胞壁和细胞基质的形成、植物抗病性等。杨柳(2016)研究表明，拟南芥exo70亚基突变体表现出细胞自发性死亡和白粉菌抗性的增强等表型，其抗性依赖于sa信号通路，而不依赖于茉莉酸和乙烯信号通路，exo70突变后可以激活非典型r蛋白tn2(tir-nbs2)，诱导的活性氧爆发，引发免疫反应。拟南芥exo70突变体叶片细胞出现程序性死亡的现象，这表明exo70基因突变诱发寄主过敏反应，增强自身免疫力，从而提高寄主对外源病原体的防御能力(stegmann et al.,2013)，病原菌与寄主互作过程中通过效应蛋白识别exo70亚基，从而干扰植物胞泌过程，寄主则通过tir-nbs2蛋白分子监测exo70亚基的完整性激发寄主的抗病应答反应(zhao et al.,2015；liu et al.,2017)。此外，exo70亚基参与拟南芥对pseudomonas syringae pv.maculicola和blumeria graminis f.sp.hordei侵染的防御响应，在与寄主抗性密切相关的细胞壁形成过程中起到重要作用(pecenkova et al,2011)。由此可见，植物胞泌复合体exo70亚基参与植物抗病性相关生物学过程。
4.植物细胞胞泌过程内存在一个复杂的信号调节网络，参与植物生长发育和防御反应过程。胞泌复合体蛋白作为参与细胞胞泌过程中的重要因子起到了关键作用。exo70基因参与植物抗病反应的相关报道仍然还主要集中在模式植物上，但胞泌复合体组成亚基作为
调控植物抗病水平关键基因的重要地位是毋庸置疑的。目前，关于普通菜豆exo70基因的挖掘和抗病性遗传分析等研究在世界范围内还是空白。


技术实现要素：

5.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70及应用。
6.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
7.本发明的第一个目的是要提供一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70，其基因序列如seq id no.1所示。
8.本发明的第二个目的是要提供一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70的获取方法，包括以下步骤：
9.1)以普通菜豆为试材，分别在接种菜豆镰孢菌病原菌0、24、48、72、96和120h后于根组织采样并等量混合，用trizol提取总rna，用oligo(dt)纤维素分离纯化mrna并合成cdna；
10.2)以合成cdna作为模板，设计如下引物利用rt-pcr方法分离普通菜豆中exo70基因，引物序列如下：
11.exo-f1：5
’‑
aatcagcgactctggaaa-3’；
12.exo-r1：5
’‑
atttggcaacccttctat-3’；
13.扩增获得大小为2700bp的扩增片段即为普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70。
14.本发明的第三个目的是要提供一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70在提高普通菜豆抵抗镰孢菌枯萎病性能上的应用，具体步骤如下：
15.1)构建pvexo70基因沉默载体
16.采用bamhi和msci双酶切方法将pvexo70基因开放阅读框中442bp序列片段导入pg7r2v载体中，构建基于vigs技术的基因沉默载体pg7r2v-pvexo70；
17.2)获得pvexo70基因沉默菜豆植株
18.将pg7r2v-pvexo70与pghopr1载体的体外转录产物等量混合后接种普通菜豆植株首片三出复叶，培养条件为28℃光照16h/25℃黑暗8h，获得pvexo70基因沉默菜豆植株。
19.与现有技术相比，本发明获得了在普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病反应中发挥重要作用的pvexo70基因，进而通过构建pvexo70基因沉默载体，然后获得pvexo70基因沉默菜豆植株，从而增强普通菜豆对镰孢菌枯萎病的抗病性。
附图说明
20.图1为pvexo70过表达菜豆植株的qrt-pcr检测结果。
21.图2为pvexo70过表达菜豆植株2周后病情特征。
22.图3为pvexo70过表达植株2周后病级分析结果。
23.图4为pvexo70沉默表达菜豆植株的qrt-pcr检测结果。
24.图5为pvexo70沉默菜豆植株2周后病情特征。
25.图6为pvexo70沉默菜豆植株2周后病级分析结果。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
27.实施例1
28.普通菜豆中抗病相关蛋白的编码基因pvexo70的克隆与功能验证
29.一、抗病相关蛋白的编码基因pvexo70的分离
30.1.总rna提取及mrna纯化，以普通菜豆(260205，国家作物种质库)为试材，分别在接种菜豆镰孢菌病原菌后0、24、48、72、96和120h于根组织采样并等量混合，用trizol提取总rna，用oligo(dt)纤维素分离纯化mrna并合成cdna。
31.2.以合成cdna作为模板，设计引物利用rt-pcr方法分离普通菜豆中exo70基因，引物序列如下：
32.exo-f1：5
’‑
aatcagcgactctggaaa-3’33.exo-r1：5
’‑
atttggcaacccttctat-3’34.扩增获得约2700bp大小的扩增片段即为普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因pvexo70，其基因序列如seq id no.1所示。
35.二、过表达技术验证pvexo70基因功能
36.采用xbai和saci双酶切方法将pvexo70基因开放阅读框约1887bp序列片段导入p35sgus 载体中，构建过表达载体。将p35s-pvexo70载体转化发根农杆菌k599菌株感受态细胞，接种普通菜豆抗病材料260205的7日龄幼苗作为处理，以转化p35sgfpgus 载体和无载体转化的k599菌株诱导产生不定根的菜豆植株作为对照。不定根的诱导在90％湿度条件下进行，当不定根长至3-4cm时将植株移栽至新盆中，使其稳定生长，28℃光照16h/25℃黑暗8h条件下培养3周。qrt-pcr检测结果表明，pvexo70过表达菜豆植株不定根中目标基因的表达量显著高于空载体转化和非转化不定根，如图1所示。
37.接种枯萎病病原菌2周后，pvexo70过表达菜豆植株发病级数显著高于空载体转化和非转化不定根植株，参见图2；接种病原菌2周后，2组对照植株发病级数仅为3.7和3.2，而pvexo70过表达不定根的菜豆植株发病级数达到8.4，参见图3。以上结果表明，pvexo70在调控普通菜豆枯萎病抗病反应中发挥重要作用。
38.实施例2
39.获取pvexo70基因沉默菜豆植株
40.采用bamhi和msci双酶切方法将pvexo70基因开放阅读框中约442bp序列片段导入pg7r2v载体中，构建基于vigs技术的基因沉默载体，将pg7r2v-pvexo70载体与pghopr1载体的体外转录产物等量混合后接种于普通菜豆感病材料brb-130植株首片三出复叶，然后以pg7r2v-ck载体与pghopr1载体体外转录产物混合物接种的菜豆植株和野生型植株作为对照，培养条件均为28℃光照16h/25℃黑暗8h。qrt-pcr检测结果表明，pvexo70基因沉默菜豆植株根中目标基因的表达量显著低于野生型植株和空载体植株，如图4所示。
41.接种病原菌后，pvexo70沉默菜豆植株发病级数显著低于接种空载体病毒菜豆植株和野生型植株，参见图5。接种病原菌2周后，2组对照植株发病级数仅为分别达到8.6和7.7，而pvexo70沉默的菜豆植株发病级数仅为4.5，参见图6。
42.以上结果表明，pvexo70在调控普通菜豆枯萎病抗病反应中发挥关键作用，通过获
得pvexo70基因沉默菜豆植株，可以增强普通菜豆对镰孢菌枯萎病的抗病性。
43.本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。