一种结合葡聚糖的融合蛋白、重组微生物及其制备方法和在重塑根际微生物群落中的应用

1.本发明属于根际菌技术领域，具体涉及一种结合葡聚糖的融合蛋白、重组微生物及其制备方法和在重塑根际微生物群落中的应用。


背景技术：

2.微生物群落在自然界中普遍存在，并在大量的生物过程中发挥重要作用，如环境污染物(如持久性有机污染物、微塑料)的降解、生物燃料(如甲烷、乙醇和石油)的生产、对多种胁迫的耐受性(如热、冷、干、高渗、氧化、抗生素和病原体入侵条件)，以及肠道生态系统稳态的维持。改造自然微生物群落，提高微生物个体间的协同效率，正成为合成生物学和生物技术的一个热点。
3.植物根际微生物群落是由微生物群落(如细菌、真菌、原生动物和藻类)紧密包围在植物根的狭窄区域，并受到根系代谢的动态影响。这些微生物群落与植物根系有强烈的相互作用，通过释放无机养分、产生植物激素和减轻环境胁迫来改善植物的生长。此外，良性微生物群落形成物理保护层，产生抗菌剂，激活植物免疫反应，保护植物免受病原体感染。因此，优化根际微生物群落结构无疑是促进植物生长、增强植物对物理、化学和生物胁迫的抵抗力的有效途径。
4.环境污染，特别是由新出现的污染物(如重金属、与富营养化有关的营养成分、持久性有机污染物等)引起的多重污染，正成为水和土壤系统的重大问题，并严重威胁着人们的健康和全球生态系统。植物修复是一种流行的环境污染治理策略，已成功应用于清除挥发性有机化合物和pm 2.5，去除土壤和水中的重金属，降解有机污染物。毫无疑问，根际微生物群落作为植物重要的相互作用因子，在植物修复过程中对促进植物生长、代谢和污染物去除起着至关重要的作用。然而，尽管大量研究集中在污染物(如重金属、持久性有机污染物和石油烃)对根际微生物群落的影响，人工改造根际微生物群落，通过微生物群落-植物共生体去除多种污染物，缓解污染场地的各种胁迫，目前还未有相关报道。
5.微生物细胞和相关的胞外聚合底物(epss)构成有机体之间的自然物理接触。然而，这些接触并不稳定，经常受到复杂的环境因素(如温度、ph值、c/n比、金属离子等)的破坏。合成生物学是细胞表面成分大规模重塑的有力策略，将成为增强植物和生物之间物理联系的一种有前途的方式。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合葡聚糖的融合蛋白，所述融合蛋白对含葡聚糖的物质具有较理想的结合性能。
7.本发明的目的还在于提供一种重组微生物及其制备方法和在重塑根际微生物群落中的应用，所述重组微生物通过融合蛋白增强与植物根系的物理接触，在根际形成具有植物修复功能的微生物群落。
8.本发明提供的一种结合葡聚糖的融合蛋白，所述融合蛋白包括以下结构经顺次连接得到：解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域、标记蛋白结构域和解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域。
9.优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
10.本发明提供了一种编码所述融合蛋白的融合基因，是微生物分泌信号肽编码序列和所述融合蛋白的编码序列顺次连接得到。
11.优选的，所述融合基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
12.本发明提供了一种含有所述融合基因的重组表达载体。
13.本发明提供了一种结合葡聚糖的重组微生物，所述重组微生物的细胞表面展示所述融合蛋白。
14.本发明提供了所述重组微生物在重塑植物根际微生物群落中的应用。
15.优选的，所述植物根际微生物群落中微生物包括产葡聚糖的细菌或真菌；
16.所述细菌包括以下一种或几种：台湾贪铜菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和木醋杆菌；
17.所述真菌包括以下一种或几种：哈茨木霉、酿酒酵母、拟青霉和黑曲霉。
18.本发明提供了所述重组微生物在促进植物生长、提高植物抗逆性或植物修复中的应用。
19.优选的，所述提高植物抗逆性是所述重组微生物降低氧化应激反应；
20.所述植物修复是去除种植基质中重金属的污染和富营养化；所述重金属包括以下一种或几种：cd、pb、hg、cu、cr和co。
21.本发明提供的一种结合葡聚糖的融合蛋白，所述融合蛋白包括以下结构经顺次连接得到：解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域、标记蛋白结构域和解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域。本发明通过模拟葡聚糖结合蛋白和葡聚糖底物之间的结合关系，设计了一种新型融合蛋白。实验证明以微生物为载体，所述融合蛋白能良好地结合葡聚糖。实验表明，与不表达融合蛋白的对照微生物相比，表面表达所述融合蛋白的微生物表面葡聚糖含量显著升高，说明融合蛋白具有较强的葡聚糖结合能力。
22.本发明提供了结合葡聚糖的重组微生物，所述重组微生物的细胞表面展示所述融合蛋白。所述重组微生物具有招募天然产葡聚糖微生物的能力，同时所述重组微生物还能通过结合根际分泌的葡聚糖结合到植物根际中，从而加强天然微生物与植物根的物理接触。物理接触的加强进一步重塑了模型修复植物凤眼莲、浮萍、龙葵等根际微生物群落，促进了多种污染物在植物体内的积累。本发明提供的重组微生物为重塑根际微生物群提供了新的思路，从而在污水处理和土壤污染物去除过程中有效地进行植物修复。同时所述重组微生物与植物根际的结合还具有促进植物生长、提高植物抗逆性。
附图说明
23.图1为重组微生物eccmc对凤眼莲根际细菌多样性的影响；其中图1(a)为各处理组根际细菌shannon指数，图1(b)为各处理根际细菌simpson指数，图1(c)为各样品界水平的细菌相对丰度分布；
24.图2为微生物eccmc对凤眼莲植株及根系生长量的影响，其中图2(a)为各处理组凤
眼莲植株照片，图2(b)为各处理组植株湿重，图2(c)为各处理组根系长度；
25.图3为重组微生物eccmc对凤眼莲去除污染物能力的影响，其中图3(a)为各处理组根系镉含量变化，图3(b)为污水中镉含量变化，图3(c)为污水中cod含量变化，图3(d)为污水中总氮含量变化，图3(e)为污水中总钾含量变化，图3(f)为污水中总磷含量变化。
具体实施方式
26.本发明提供的一种结合葡聚糖的融合蛋白，所述融合蛋白包括以下结构经顺次连接得到：解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域、标记蛋白结构域和解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域。
27.在本发明中，所述融合蛋白中标记蛋白包括荧光蛋白或藻红蛋白。所述荧光蛋白包括红色荧光蛋白mcherry或绿色荧光蛋白。在本发明实施例中，以红色荧光蛋白mcherry结构域作为标记蛋白结构域代表，说明融合蛋白的生物学功能。所述标记蛋白起蛋白标识作用，不影响结合葡聚糖性能。所述融合蛋白的氨基酸序列优选如seq id no：1(mkktaiaiavalagfatvaqaagtgvvsvqfnngsspassnsiyarfkvtntsgspinladlklryyytqdadkpltfwcdhagymsgsnyidatskvtgsfkavspavtnadhylevalnsdagslpaggsieiqtrfarndwsnfdqsndwsytaagsymdwqkisafvggtlaygstpdggnpppqdptinptsisakagsfadtkitltpngntfngiselqssqytkgtpggggvskgeddnmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelyksasagasasagasasagasasaagtgvvsvqfnngsspassnsiyarfkvtntsgspinladlklryyytqdadkpltfwcdhagymsgsnyidatskvtgsfkavspavtnadhylevalnsdagslpaggsieiqtrfarndwsnfdqsndwsytaagsymdwqkisafvggtlaygstphhhhhh)所示。
28.本发明提供了一种编码所述融合蛋白的融合基因，是微生物分泌信号肽编码序列和所述融合蛋白的编码序列顺次连接得到。所述融合蛋白以微生物为载体进行表达时，需表达在细胞表面，因此，需要微生物分泌信号肽将融合蛋白定位到细胞壁表面表达。所述微生物分泌信号肽根据微生物种类不同而不同，包括细菌分泌信号肽和真菌分泌信号肽。本发明对所述细菌分泌信号肽和真菌分泌信号肽的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的微生物分泌信号肽即可。在本发明实施例中，以大肠杆菌分泌信号肽ompa为例，说明融合蛋白在细菌上重组表达情况。所述融合基因的核苷酸序列优选如seq id no：2(atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggcaggtttcgctaccgtcgctcaggctgcgggcaccggcgtggtgtccgtgcagttcaacaacggctccagccctgcaagctccaactcgatctacgctcgtttcaaggtcaccaacaccagcggcagcccgatcaacctggcggatctgaaattgcgctattactacacccaagatgctgataaaccgttgaccttctggtgtgatcacgcgggttacatgagcggctctaactatatcgatgcgacctcgaaggttaccggttcctttaaggccgtgagcccagcggttacgaacgcggatcactatctggaagtcgcacttaattctgatgccgggtcgctgccggctggcggttctatcgagatccagactcgcttcgcacgtaatgactggtcaaacttcgaccagtcgaacgattggagctacaccgctgcaggctcctacatggattggcaaaagattagcgcattcgttggtggcacgttggcgtatggttccaccccggacggtggcaatccgccgccgcaggacccgaccattaacccgacctccattagtgctaaagccggttcgtttgcggacaccaagatcacgctgaccccaaatggtaacacgttcaatggcataagcgaactgcagtctagccagtacaccaaaggtaccccgggtggtggaggtgttagcaagggtgaagatgataacatggcaattatcaaggagttcatgcgtttc
aaagttcacatggaaggtagcgtcaatggtcacgagttcgagattgagggcgagggcgagggccgtccgtatgaaggcacccaaaccgctaaattgaaggtcaccaagggcggaccgctcccatttgcctgggatattctgagcccacagtttatgtacggttcgaaagcgtacgtgaaacatccggctgacatcccggattacctgaagcttagctttccggagggttttaagtgggaacgtgttatgaattttgaggacggtggggtggtgacggtgacccaagacagcagcctgcaagacggtgagttcatttacaaggtaaaattgagaggtacgaacttcccgagcgacggcccggttatgcagaaaaagaccatgggttgggaagcaagtagcgagcgcatgtacccggaggatggtgctctgaagggtgagatcaagcagcgtctaaagctcaaagatggtggccactacgatgctgaagttaaaactacctataaagcgaaaaagccggttcaactgccgggtgcgtataacgtgaacattaaattggacattacctcccataatgaggattatacgatcgtggaacaatatgaacgtgcggaaggccgtcatagcaccggtggcatggacgaactgtacaaaagcgcgtccgcgggtgcgagcgctagcgcgggcgcttctgcttccgccggggcgagcgccagcgccgcaggcaccggcgttgtgagcgttcagtttaacaacggcagctctcccgcgagctctaacagcatctacgcgcgtttcaaagtcaccaacacctccggcagcccgatcaatctggcggacttgaagttacgctattactacacccaggacgcggacaaaccgctcaccttctggtgcgatcatgccggttacatgtccggcagcaattatattgacgcgacatccaaggtgactggcagctttaaggcggtgtcaccagcggttaccaatgcggatcattatctggaagttgctctgaacagcgacgcaggtagcttgccggccggcgggtccatcgagatccaaacccgcttcgcccgtaatgactggtcaaacttcgatcaatcaaacgactggagctatactgcggcaggtagctatatggattggcaaaaaatcagtgcgtttgtaggtggcaccttggcatacggttcaacccctcatcaccaccaccaccactaa)所示。
29.本发明提供了一种含有所述融合基因的重组表达载体。
30.本发明对所述重组表达载体的骨架载体没有特殊限制，采用本领域所熟知的骨架载体即可，例如pet-28a质粒或pvlt33质粒。当骨架载体为pet-28a质粒时，所述融合基因的插入位点优选为bamh
ꢀⅰ
与xho
ꢀⅰ
，形成pet-28a-cmc。当骨架载体为pvlt33质粒时，所述融合基因的插入位点优选为ecor
ꢀⅰ
与sac
ꢀⅰ
，形成pvlt33-cmc。本发明对所述插入的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的插入方法即可，例如利用带有酶切位点的引物对融合基因进行pcr扩增，所得pcr产物和骨架载体采用bamh
ꢀⅰ
与xho
ꢀⅰ
进行双酶切处理，将酶切片段和所得线性载体连接，经筛选，得到重组表达载体。其中带有酶切位点的引物包括核苷酸序列如seq id no：3(cgcggatccatgaaaaagacagctatcgcgat)和seq id no：4(ccgctcgagttagtggtggtggtggtgatg)所示。所述pcr扩增的反应条件优选为94℃5min，(94℃30s，50℃2min10s，72℃30s)
×
30个循环，72℃7min，降温至4℃；所述pcr扩增的反应体系优选为long taq酶缓冲液5μl、2.5mm dntp 4μl、上游引物2μl、下游引物2μl、模板2μl，long taq酶1μl，ddh2o补充至50μl。
31.本发明提供了一种结合葡聚糖的重组微生物，所述重组微生物的细胞表面展示所述融合蛋白。
32.在本发明中，所述重组微生物的构建方法，优选包括以下步骤：
33.将上述方案所述重组表达载体转化至微生物感受态中，经培养，筛选，得到重组微生物。
34.本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可，例如cacl2转化法。所述筛选利用重组表达载体中所携带的抗性基因进行抗性筛选。
35.在本发明中，当所述重组表达载体为pet-28a-cmc时，微生物感受态优选为大肠杆菌感受态。当所述重组表达载体为pvlt33-cmc，微生物感受态优选为恶臭假单胞菌kt2440
感受态。
36.所述重组微生物的细胞表面表达融合蛋白，所述融合蛋白对葡聚糖具有较强的结合能力，因此重组微生物能够利用融合蛋白与分泌葡聚糖的植物根系结合，同时，所述重组微生物基于融合蛋白能够大量招募自然产葡聚糖的微生物并结合，大大提高了植物根际微生物的丰度和数量，从而在植物根际形成新的微生物群落，基于自然产葡聚糖的微生物具有广泛的促生长、抗逆作用以及去除重金属污染物的作用，从而提高植物的生长速度、抗逆性，发挥植物修复功效。
37.本发明提供了所述重组微生物在重塑植物根际微生物群落中的应用。
38.在本发明中，所述植物根际微生物群落中微生物优选包括产葡聚糖的细菌或真菌。所述细菌包括以下一种或几种：台湾贪铜菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和木醋杆菌。所述真菌包括以下一种或几种：哈茨木霉、酿酒酵母、拟青霉和黑曲霉。所述植物优选包括水生植物和陆生植物。本发明对所述植物的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物即可。以水生模式植物凤眼莲和浮萍为例，说明重组微生物重塑植物根际微生物群落的功效。同时以龙葵作为陆生植物的代表，说明重组微生物重塑植物根际微生物群落的功效。实验结果表明，重组微生物对植物根际微生物群落具有重构作用。所述重组微生物的施用浓度为107～108个细胞/l或107～108个细胞/kg。
39.本发明提供了所述重组微生物在促进植物生长、提高植物抗逆性或植物修复中的应用。
40.在本发明中，所述促进植物生长表现在提高植株的株高、湿重和根长。
41.在本发明中，所述提高植物抗逆性优选是所述重组微生物降低氧化应激反应。降低氧化应激反应表现在提高超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)和过氧化物酶(pod)活力，降低mda含量。
42.在本发明中，所述植物修复优选是去除种植基质中重金属的污染和富营养化。所述重金属优选包括以下一种或几种：cd、pb、hg、cu、cr和co。降低水体中cod值，以及总氮、总磷和总钾的含量。实验证明，本发明利用重组微生物通过重塑根际微生物群落实现促进植株生长及污染物治理能力。
43.下面结合实施例对本发明提供的一种结合葡聚糖的融合蛋白、重组微生物及其制备方法和在重塑根际微生物群落中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
44.实施例1
45.重组微生物eccmc对凤眼莲根际微生物群落重塑及修复增强效应
46.1.试验方法
47.(1)重组微生物eccmc的制备方法
48.首先设计一种高效结合葡聚糖的人工合成蛋白cmc，后者能够与植物根系及产葡聚糖天然微生物结合。融合cmc蛋白(seq id no:1)由三个结构域组成：解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域(cbm
cipc
)、红色荧光蛋白mcherry结构域、解纤维素梭菌cipc蛋白葡聚糖结合结构域(cbm
cipc
)。采用从头合成方法，制备cmc蛋白的编码基因cmc(seq id no:2)，该基因的n端带有大肠杆菌分泌信号肽ompa，使融合蛋白cmc能够在重组微生物细胞表面高效展示。
49.将编码基因cmc克隆到pet-28a质粒，多克隆位点为bamh
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与xho
ꢀⅰ
，得到表达质粒pet-28a-cmc。其中扩增引物如seq id no：3(cgcggatccatgaaaaagacagctatcgcgat，其中下划线部分为酶切位点)和seq id no：4(ccgctcgagttagtggtggtggtggtgatg，其中下划线部分为酶切位点)所示。
50.将表达质粒pet-28a-cmc利用cacl2法转入到bl21感受态，得到合成菌株eccmc。同时制备对照菌株ecm，该菌株仅表达对照蛋白mcherry。
51.(2)多糖结合能力评价：
52.为评价重组微生物的多糖结合能力，将几种多糖，包括fitc标记的葡聚糖、甘露聚糖和透明质酸，溶解在浓度为100mg/l的pbs缓冲液中。将合成的细胞以1
×
107细胞/ml的剂量加入培养液中。混合物在孵化37℃为30分钟，其次是离心12000转2分钟。细胞被pbs洗两次，采用流式细胞分析仪检查或荧光酶标仪检测细胞fitc荧光强度。
53.(3)细菌结合能力评价：
54.为研究重组微生物招募天然微生物细胞的能力，将天然产葡聚糖的台湾贪铜菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、木醋杆菌在含2％葡萄糖(w/v)的lb培养基中培养12h，将真菌菌株哈茨木霉、酿酒酵母、拟青霉和黑曲霉在pda培养基中培养36h，离心获得天然菌株，用4
′
,6-二氨基-2-苯基吲哚(5mg/l)对细菌进行染色，用荧光白(10mg/l)对真菌细胞染色，pbs重悬。将新培养的重组微生物细胞以1
×
107细胞/ml的浓度加入培养基中。共孵育30分钟后，收集培养物进行共聚焦显微镜观察。
55.(4)eccmc与凤眼莲根系结合能力分析：
56.从健康的凤眼莲植株上取新鲜和幼根，用pbs洗涤两次。将根浸泡在pbs中，将新培养的重组微生物细胞加入根悬液中，最终浓度为1
×
107个细胞/l。在30℃孵育30分钟后，用pbs轻轻冲洗两次根，并用共聚焦显微镜观察。溶液中剩余的细菌细胞用于菌落形成单位(cfu)的测定。
57.(5)eccmc对凤眼莲根际微生物群落的重塑作用解析：
58.在模拟污水中培养凤眼莲，研究人工重组微生物对凤眼莲根际微生物群落的影响。污水由蛋白胨80mg/l、酵母膏30mg/l、(nh4)2so428mg/l、nh4cl 25mg/l、kh2po470 mg/l、cdcl23.3 mg/l、ph6.0～6.5组成。污水cod为40mg/l，总氮为28mg/l，总钾为20mg/l，总磷为16mg/l，cd
2
为3mg/l。3组根际微生物群落进行重塑，分别为对照组、ecm组和eccmc组。在大多数实验中，将合成的细菌细胞ecm(ecm组)或eccmc(eccmc组)加入到污水中，浓度为1
×
108cells/l。将含重组微生物细胞的污水加入2l容量的鱼缸中，每个鱼缸添加1l，然后分别加入1株凤眼莲(25
±
2g)，每个鱼缸进行培养。在对照组中，植物在不含任何重组微生物细胞的污水的鱼缸中培养。每组3株为重复。培养14天后，采集植物根系进行进一步的微生物群落学、代谢组学、生化和污染物去除分析。用2.5％戊二醛固定取样的植物根系24h，然后用真空冷冻干燥机冻干12h。然后用扫描电镜观察干根。第14天，采用tguide s96磁珠提取试剂盒提取凤眼莲根际微生物总dna。利用细菌16s v3 v4引物(338f，5'-actcctacgggaggcagca-3'，seq id no:5；806r，5'-ggactachvgggtwtctaat-3'，seq id no:6)及其真菌的引物(its1f，5'-cttggtcatttagaggaagtaa-3'，seq id no:7；its25
“‑
gctgcgttcttcatcgatgc-3'，seq id no:8)。构建的文库用illumina novaseq6000测序系统(biomarker ltd.，china)进行测序。数据采用silva参考数据库进行分析。利用qiime2软件
评估alpha多样性，计算各组的shannon指数和simpson指数。
59.(6)eccmc对凤眼莲生长、抗逆及污染物去除能力的影响：
60.在生长的第14天，对各处理的凤眼莲进行称重及根系长度测定。采用液氮研磨法对取样的根系细胞进行破碎裂解。裂解液在12000rpm离心10分钟，用考马斯亮蓝试剂检测上清液总蛋白含量。采用超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)和过氧化物酶(pod)检测试剂盒测定上清液的sod、cat和pod活性。采用丙二醛(mda)检测试剂盒检测mda水平。
61.在人工合成的细菌处理凤眼莲模拟污水的指定时间内，对植物的根、叶和污水进行采样。将根和叶干燥，取重量，用30％的hno3消化，用电感耦合等离子体质谱仪检测消解液中cd
2
的含量。用相似的方法测定污水中cd
2
、总钾和总磷的含量。用cod测定试剂盒测定污水样品的cod值。样品在过硫酸钾溶液中预热，然后用钼酸铵、酒石酸锑钾和l-抗坏血酸钠着色，定量测定总磷含量。
62.2试验结果
63.(1)eccmc对葡聚糖的结合能力
64.eccmc或ecm细胞与fitc-葡聚糖孵育10min后，ecm细胞几乎没有fitc荧光，而eccmc细胞有明显的fitc荧光。说明eccmc具有很强的葡聚糖结合能力。
65.共聚焦显微镜放大图像和荧光定量进一步显示，eccmc细胞具有mcherry的双侧分布。这些结果表明，eccmc细胞表面中葡聚糖结合蛋白表达量高。
66.(2)eccmc对天然微生物的吸附能力
67.eccmc与天然的台湾贪铜菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、木醋杆菌细胞共孵育30min后，对照组ecm细胞未能吸收天然细菌细胞。相比之下，eccmc细胞与天然细菌细胞强烈结合招募，形成eccmc与天然细菌细胞的共聚集体。因此，eccmc强烈吸收天然产生含葡聚糖eps的细菌细胞。
68.与eccmc共孵育时，所有被测真菌细胞均能与eccmc细胞强结合，但无法与对照ecm细胞结合。特别是，酵母细胞与ecm细胞孵育时在培养基中分散良好，但酵母细胞与eccmc细胞形成了显著的聚集体，表明eccmc作为交联剂诱导真菌细胞聚集。
69.此外，eccmc细胞也强烈结合黑曲霉菌丝和分生孢子，而ecm细胞则无法结合，这表明eccmc可能在真菌生命周期的不同时期招募到真菌细胞。总之，上述结果表明eccmc细胞有很强的能力结合和招募天然的细菌和真菌细胞产生细胞外葡聚糖。
70.(3)eccmc与凤眼莲根系的结合能力
71.将凤眼莲在含重组微生物的水中培养1天后，取浸泡在水中的根进行共聚焦显微镜观察。根系仅吸收很低水平的ecm对照细胞，但吸附很高水平的eccmc细胞。菌落形成单位检测进一步表明，根粘附的eccmc数量比ecm多12倍。因此，eccmc细胞比ecm具有更高的根系结合能力。
72.(4)eccmc对凤眼莲根系微生物群落的重构作用
73.16s rdna测序结果显示，与对照和ecm处理组的根际细菌多样性相比，eccmc处理根际细菌多样性的shannon指数和simpson指数均有所增加。细菌群落丰度分析进一步表明eccmc处理的根系中有多个门的相对丰度高于对照和ecm处理的根系。这些门包括acidobacteria，actinobacteria，gemmatimonadetes，chloroflexi，armatimonadetes和nitrospirae(图1)。
74.同时，its分析测序结果显示ecm和eccmc对真菌门的组成没有显著影响。然而，eccmc虽然没有显著改变真菌多样性，但却显著增加了根系上的真菌生物量。因此，eccmc对模拟污水中凤眼莲根际微生物群落进行了高度重塑。另外，往该培养体系中加入100mg/l青霉素、50mg/l链霉素及100mg/l氟康唑，能够导致eccmc组的凤眼莲根际微生物群落生物多样性及微生物显著下降，从而消除eccmc的微生物群落重塑作用。
75.(5)eccmc对凤眼莲生长、抗逆及污染物治理的增强作用
76.在模拟污水中培养14天后，eccmc处理的凤眼莲植株的株高、湿重(40g比30～32g)和根长(18cm比12～13cm)均高于其他两组。这表明eccmc在植物生长中具有积极的作用(见图2)。
77.酶活性测定结果表明，eccmc处理3d后，3种酶的活性均高于对照和ecm处理的根系，说明eccmc处理的根系对重金属的耐受能力更强。经过14天的处理后，eccmc处理的根系中这些酶的活性低于其他两组，这可能与该组氧化应激减弱有关。eccmc处理连续3天和14天后，丙二醛(mda)水平显著降低。上述结果表明，eccmc显著上调了重金属胁迫下根系中抗氧化酶的水平，进一步减轻重金属诱导的氧化应激。
78.对照和ecm组的根表面cd含量均较低，而eccmc处理的根表面cd分布明显。icp分析进一步表明，在第3～14天，经eccmc处理的根的cd
2
含量高于其他两组。同时，eccmc组植物叶片中cd
2
的含量也高于其他组，说明eccmc也促进了cd
2
从根系向叶片的运输。用icp法进一步测定了污水中cd
2
的含量。处理14天后，对照组和ecm处理组仅去除水中部分cd
2
，污水中cd
2
含量仍为》0.5mg/l。相比之下，eccmc处理组植物从污水中几乎彻底去除cd
2
，污水重金属含量减少至《0.05mg/l(图3)，这表明eccmc组植物的重金属去除能力大大高于其他两组(》98％比《80％)。
79.此外，与对照组和ecm组相比，处理14d后eccmc组的cod值远低于其他两组(《7mg/l比》25mg/l)，总氮、总钾和总磷均较低(《1.5mg/l比》6mg/l)，表明eccmc同样能够显著促进植物对富营养化污染物的治理能力。
80.此外，往该培养体系中加入100mg/l青霉素、50mg/l链霉素及100mg/l氟康唑以紊乱根系微生物群落，能够消除eccmc对凤眼莲植株生长、重金属吸附及富营养化污染物清除的促进作用，表明eccmc对植株生长代谢及污染物治理能力的促进作用是通过重塑根际微生物群落实现的。
81.实施例2
82.重组微生物eccmc对浮萍根际微生物群落重塑及修复增强效应
83.1试验方法
84.(1)eccmc对浮萍根际微生物群落的重塑作用解析：
85.在模拟污水中培养浮萍，研究人工重组微生物对浮萍根际微生物群落的影响。污水由蛋白胨80mg/l、酵母膏30mg/l、(nh4)2so428mg/l、nh4cl 25mg/l、kh2po470 mg/l、cdcl23.3 mg/l、ph 6.0～6.5组成。污水cod为40mg/l，总氮tn为28mg/l，总钾tk为20mg/l，总磷tp为16mg/l，cd
2
为3mg/l。3组根际微生物群落进行重塑，分别为对照组、ecm组和eccmc组。在大多数实验中，将合成的细菌细胞ecm(ecm组)或eccmc(eccmc组)加入到污水中，浓度为1
×
108cells/l。将含重组微生物细胞的污水加入1l容量的鱼缸中，每个鱼缸添加0.5l，然后分别加入1株浮萍(25
±
2g)，每个鱼缸进行培养。在对照组中，植物在不含任何重组微
生物细胞的污水的鱼缸中培养。每组3株为重复。培养14天后，采用tguide s96磁珠提取试剂盒提取浮萍根际微生物总dna。利用细菌16s v3 v4引物及其真菌的引物。构建的文库用illumina novaseq6000测序系统(biomarker ltd.，china)进行测序。数据采用silva参考数据库进行分析。利用qiime2软件评估alpha多样性，计算各组的shannon指数和simpson指数。
86.(6)eccmc对浮萍生长及污染物去除能力的影响：
87.在生长的第14天，第各处理的浮萍进行称重及根系长度测定。采用液氮研磨法对取样的根系细胞进行破碎裂解。裂解液在12000rpm离心10分钟，用考马斯亮蓝试剂检测上清液总蛋白含量。采用超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)和过氧化物酶(pod)检测试剂盒测定上清液的sod、cat和pod活性。采用丙二醛(mda)检测试剂盒检测mda水平。
88.在人工合成的细菌处理浮萍模拟污水的指定时间内，对植物的根、叶和污水进行了采样。将根和叶干燥，取重量，用30％的hno3消化，用电感耦合等离子体质谱仪检测消解液中cd
2
的含量。用相似的方法测定污水中cd
2
、总钾和总磷的含量。用cod测定试剂盒测定污水样品的cod值。样品在过硫酸钾溶液中预热，然后用钼酸铵、酒石酸锑钾和l-抗坏血酸钠着色，定量测定总磷含量。
89.2试验结果
90.(1)eccmc对浮萍根系微生物群落的重构作用
91.16s rdna测序结果显示，与对照和ecm处理组的根际细菌多样性相比，eccmc处理根际细菌多样性的shannon指数和simpson指数均有所增加。细菌群落丰度分析进一步表明eccmc处理的根系中有多个门的相对丰度高于对照和ecm处理的根系。这些门包括acidobacteria，actinobacteria，gemmatimonadetes，等。its分析测序结果显示，eccmc显著增加了根系酵母门、壶菌门真菌丰度。因此，eccmc对模拟污水中浮萍根际微生物群落进行了高度重塑。
92.(2)eccmc对浮萍生长及污染物治理的增强作用
93.在模拟污水中培养14天后，eccmc处理的浮萍植株株高、湿重和根长均高于对照组和ecm组，表明eccmc在植物生长中具有积极的作用。
94.酶活性测定结果表明，eccmc处理3d后，3种酶的活性均高于对照和ecm处理的根系，而mda含量显著偏低，说明eccmc处理的根系对重金属引起的氧化压力耐受性更强。
95.icp分析表明，在第3～14天，经eccmc处理的根的cd
2
含量高于其他两组。处理14天后，eccmc处理组植物从污水中几乎彻底去除cd
2
，污水重金属含量减少至《0.07mg/l，cod值远低于其他两组(《10mg/l比》28mg/l)，总氮、总钾和总磷均较低(《2mg/l比》8mg/l)，表明eccmc同样能够显著促进浮萍对富营养化污染物的治理能力。
96.此外，往该培养体系中加入100mg/l青霉素、50mg/l链霉素及100mg/l氟康唑以紊乱根系微生物群落，同样能够消除eccmc对浮萍植株生长、重金属吸附及富营养化污染物清除的促进作用，表明eccmc对植株生长及污染物治理能力的促进作用是通过重塑根际微生物群落实现的。
97.实施例3
98.重组微生物ppcmc对龙葵根际微生物群落重塑及修复增强效应
99.1试验方法
100.(1)重组微生物ppcmc的构建方法
101.采用将cmc基因片段克隆到pvlt33质粒，克隆位点为ecorⅰ与sacⅰ，得到质粒pvlt33-cmc。将该质粒转入恶臭假单胞菌kt2440，得到合成菌株ppcmc。同时制备对照菌株ppm，该菌株仅表达对照蛋白mcherry。
102.(2)ppcmc对龙葵根际微生物群落的重塑作用解析：
103.在模拟重金属污染土壤中培养龙葵，研究人工重组微生物ppcmc对龙葵根际微生物群落的影响。模拟重金属污染土壤中cd
2
、pb
2
、hg
2
、cu
2
、cr
3
和co
2
含量均为1mg/kg土壤。对3组根际微生物群落进行重塑，分别为对照组、ppm组和ppcmc组，施加细胞浓度为107～108个细胞/kg土壤。培养30天后，剪取龙葵根系，采用tguide s96磁珠提取试剂盒提取根际微生物总dna。用细菌16sv3 v4引物及其真菌的引物(its1f和its2)构建的文库用illumina novaseq6000测序系统进行测序。数据采用silv a参考数据库进行分析。利用qiime2软件评估alpha多样性，计算各组的shannon指数和simpson指数。
104.(3)eccmc对龙葵生长、抗逆及污染物去除能力的影响：
105.在生长的第30天，对各处理的龙葵进行称重及根系长度测定。采用液氮研磨法对取样的根系细胞进行破碎裂解。裂解液在12000rpm离心10分钟，用考马斯亮蓝试剂检测上清液总蛋白含量。采用sod、cat和pod检测试剂盒测定上清液的sod、cat和pod活性。采用丙二醛检测试剂盒检测mda水平。
106.在人工合成的细菌处理龙葵模拟污水的指定时间内，对植物的根、叶和污水进行了采样。将根和叶干燥，取重量，用30％的hno3消化，用电感耦合等离子体质谱仪检测消解液中cd
2
、pb
2
、hg
2
、cu
2
、cr
3
和co
2
的含量。用相同方法测定土壤中各种重金属离子的含量。
107.2试验结果
108.(1)ppcmc对龙葵根系微生物群落的重构作用
109.16s rdna测序结果显示，与对照和ppm处理组的根际细菌多样性相比，ppcmc处理根际细菌多样性的shannon指数和simpson指数均有所增加。细菌群落丰度分析进一步表明：ppcmc处理的根系中有多个门的相对丰度高于对照和ppm处理的根系。这些门包括放线菌门、拟杆菌门等。its分析测序结果显示，ppcmc显著增加根系新丽鞭毛菌门、担子菌门的真菌丰度。因此，ppcmc对模拟重金属污染土壤龙葵根际微生物群落进行了高度重塑。
110.(2)ppcmc对龙葵生长及污染物治理的增强作用
111.在模拟重金属污染土壤中培养30天后，ppcmc处理的龙葵植株的株高、湿重和根长均高于对照组和ppm组，表明ppcmc在植物生长中具有积极的作用。
112.酶活性测定结果表明，ppcmc处理30d后，3种酶的活性均高于对照和ppm处理的根系，而mda含量显著偏低，说明ppcmc处理的根系对重金属引起的氧化压力耐受性更强。icp分析表明，在第30天，经ppcmc处理的根的cd
2
、pb
2
、hg
2
、cu
2
、cr
3
和co
2
含量高于其他两组，土壤中六种重金属离子含量均降低50％以上，降低率远高于对照及ppm组的20～30％，表明ppcmc同样能够显著促进龙葵对富营养化污染物的治理能力。
113.此外，往体系中加入100mg/l青霉素、50mg/l链霉素及100mg/l氟康唑以紊乱根系微生物群落，同样能够消除ppcmc对龙葵植株生长、污染物清除的促进作用，表明ppcmc对植株生长代谢及污染物治理能力的促进作用是通过重塑根际微生物群落实现的。
114.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。