一种免扩增的核酸检测方法及其应用

1.本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种免扩增的核酸检测方法及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎作为一种呼吸道传染病，主要是由新型冠状病毒感染引起的。对新型冠状病毒肺炎患者的早期诊断、早期隔离是目前对该类疾病防控的关键，其中核酸检测是新型冠状病毒检测的金标准。当前rna病毒核酸检测的方法包括逆转录pcr(rt-pcr)、逆转录-环介导等温扩增(rt-lamp)、逆转录-重组酶聚合酶扩增(rt-rpa)等，但这些技术存在一定的缺点，如需要逆转录、核酸扩增，检测流程繁琐，时间较长，核酸扩增会出现气溶胶的污染。重组酶聚合酶扩增-crispr(rpa-crispr)是近年来引起广泛关注的一种技术，最早用于基因编辑，后被用于核酸检测，检测原理是靶标与crispr rna(crrna)互补，引发cas蛋白的顺式切割和非特异性反式切割，可切割探针核酸产生荧光信号。许多报道将crispr/cas技术与核酸扩增相结合实现了核酸分子的超灵敏检测，然而这些基于crispr的检测多依赖于核酸扩增，以进一步放大扩增检测的信号，提高检测灵敏度。
3.近年来，研究者开发了一些免扩增核酸检测技术，但是灵敏度通常仅为1～100飞摩尔(fm)，远远达不到临床早期诊断的需求(1～10阿摩尔(am))。有研究者直接使用cas13a核酸酶对新型冠状病毒进行检测，发现其灵敏度达到了100拷贝/微升(约等于200am)，比其他免扩增核酸检测技术提高了近100倍，这主要得益于crispr/cas13a系统本身具有的超强信号放大能力，同时也说明了crispr/cas系统本身具有免扩增的核酸检测潜力。但是该检测体系仍是在常规的试管中反应，即将整个反应体系放在一个试管里，反应体系中的荧光信号被严重稀释，从而降低了被切割出来的荧光分子浓度，只有在大量荧光产物存在时才能被检测到。又有研究者使用微液滴数字crispr检测rna和dna，但基于液滴法上样量十分少，有漏检的可能，同时液滴的尺寸较大，约20微米，只有在较长反应时间后才能检测到单个液滴的荧光信号。因此，提供一种既能免扩增，又能提高检测灵敏度的核酸检测方法具有非常重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种免扩增的核酸检测方法，使用微米级别的微阵列芯片实现数字化crispr检测，不需要在crispr检测前进行核酸扩增，简便快速，灵敏度高，可检测到低至1am的核酸分子，能满足临床早期诊断的需求。
5.本发明还提出上述检测方法的应用。
6.根据本发明的一个方面，提出了一种免扩增的核酸检测方法，包括以下步骤：
7.s1：用捕获探针捕获待检核酸，形成捕获探针-待检核酸复合物；
8.s2：将所述捕获探针-待检核酸复合物与crispr反应体系混合形成反应液，将所述反应液通入微流控芯片的微孔中进行反应；
9.所述crispr反应体系包括cas蛋白、crispr rna和报告探针；
10.所述微流控芯片的微孔的体积为30～100fl；
11.s3：对步骤s2中所述报告探针产生的荧光进行显微观察，以确定核酸检测结果。
12.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
13.1.微阵列芯片的微孔体积很小，只有微液液滴体积的1％，每个微孔的反应体积为飞升级别，比传统反应体积小10亿倍，使得微孔中虽然只有一个分子，但crispr反应体系识别切割出的大量荧光被局限在一个微孔中，有效提高了灵敏度，同时可指数级降低背景噪音和10亿倍级别降低荧光信号的扩散稀释。
14.2.本发明将crispr技术与数字化微流控技术相结合开发的核酸检测方法，不需要核酸扩增就可以实现核酸的单分子检测，简便快速，不会造成扩增核酸时引起的气溶胶污染，极大地扩大了使用范围；另外，现有技术中将待检核酸和crispr反应液混合后，将反应液直接置于载玻片上或96孔板中进行显微观测，这种方法特异性极差，而本发明中通过与微流控芯片结合，可保证芯片的每个微孔中只含有一个分子，即特异性强，单分子检测结果更加精准。
15.在本发明的一些实施方式中，步骤s1中的所述捕获探针与磁珠结合，所述磁珠的直径为2.6～3.5μm。
16.在本发明的一些实施方式中，所述捕获探针上修饰有生物素，所述磁珠上修饰有链霉亲和素，通过共同孵育，所述生物素和所述链霉亲和素的结合将所述捕获探针修饰在所述磁珠上。
17.在本发明的一些实施方式中，所述cas蛋白包括cas13a或cas13b中的至少一种。
18.在本发明的一些优选的实施方式中，所述cas蛋白包括lwacas13a(纯化自leptotrichia wadei细菌)、lbucas13a(纯化自leptotrichia buccalis细菌)、ccacas13b(纯化自capnocytophaga canimorsus cc5细菌)、lbacas13a(纯化自lachnospiraceae bacterium细菌)、psmcas13b(纯化自prevotella sp.ma2016细菌)或psmcas13a(纯化自prevotella sp.ma2016细菌)中的至少一种。
19.在本发明的一些实施方式中，所述cas蛋白与所述crispr rna组合形成复合物。
20.在本发明的一些优选的实施方式中，所述报告探针为荧光报告探针，所述报告探针的两端标记有荧光基团和淬灭基团。
21.所述cas蛋白具有核酸酶的切割活性，当所述crispr rna识别到所述捕获探针-待检核酸复合物时，所述crispr rna与所述待检核酸通过碱基互补配对结合，此时会引发所述cas蛋白的顺式切割和非特异反式切割，所述cas蛋白对所述报告探针进行非特异反式切割，所述报告探针上的所述荧光基团被切割为游离态，进而产生荧光。
22.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中所述微流控芯片包括5
×
104～5
×
106个微孔。
23.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中所述微流控芯片包括10～500个矩阵。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微流控芯片包括100个矩阵。
25.在本发明的一些实施方式中，每个所述矩阵包括5000～10000个微孔。
26.在本发明的一些优选的实施方式中，每个所述矩阵包括10000个微孔。
27.在本发明的一些实施方式中，每个所述微孔的直径为3.5～5μm，高度为3.5～5μm。
28.在本发明的一些优选的实施方式中，每个所述微孔的直径为4.4μm，高度为3.5μm。
29.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中进行的所述反应为crispr反应，即所述cas蛋白对所述报告探针进行非特异切割，使所述报告探针的荧光基团被切割为游离态，游离的荧光基团产生所述荧光。
30.在本发明的一些实施方式中，所述crispr反应中，反应温度为32～39℃，反应时间为14～16min。
31.在本发明的一些优选的实施方式中，所述crispr反应的反应时间为15min。
32.在试验过程中对反应时间进行了优化，随着反应时间的增加，荧光亮度逐渐增强，阳性微孔的数量增加，但反应进行到15min时，荧光强度基本达到饱和，因此选择15min作为检测时间，这与在pcr管中的结果相吻合，15min左右检测时反应到达平台期。
33.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中将所述反应液通入所述微流控芯片的方法包括：通过微量注射泵将所述反应液注入所述微流控芯片的微孔中，并对所述微流控芯片进行油封。
34.在本发明的一些实施方式中，进行所述油封选用氟油。
35.在本发明的一些实施方式中，所述氟油包括hfe-7500或fc-40中的至少一种。
36.在本发明的一些实施方式中，步骤s3中所述显微观察的方法包括：用显微镜对所述crispr反应产生的所述荧光进行观察。
37.在本发明的一些实施方式中，所述显微镜包括倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜中的至少一种。
38.根据本发明的再一个方面，提出了所述核酸检测方法在非诊断目的的核酸快检中的应用。
39.在本发明的一些实施方式中，所述核酸快检包括食品领域的病毒核酸检测或环境中的病毒核酸检测。
40.目前由于新型冠状病毒的到处传播，食品和环境中也会有新型冠状病毒的存在，因此在食品进入市场前可利用本发明的检测方法对病毒核酸进行检测，或对货物外包装、运输车辆的集装箱内壁进行环境中的病毒核酸检测，以确保食品和环境的安全，再将其投入市场。
附图说明
41.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
42.图1为本发明实施例中使用的掩模版的示意图；
43.图2为本发明实施例中微流控芯片底板的显微成像图，a的标尺为200μm，b的标尺为100μm，c的标尺为50μm；
44.图3为本发明实施例中微流控芯片上盖的示意图；
45.图4为本发明实施例中进行核酸检测的流程图；
46.图5为本发明实施例和对比例对流感病毒m基因进行检测的荧光显微成像图(从第一幅图到最后一幅图分别对应实施例8、实施例7、实施例6、实施例5、实施例4、实施例3、实施例1、实施例2、对比例1)；
47.图6为采用本发明实施例的检测方法和rt-pcr方法对20例阳性样本和15例阴性样
本进行核酸检测的结果的统计分析图。
具体实施方式
48.下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
49.本发明的描述中，除非另有明确的限定，加热、孵育等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
50.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体结构、材料或者方法包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体结构、材料或者方法可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
51.实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
52.实施例1
53.本实施例对浓度为1am的流感病毒m基因进行了检测，具体过程为：
54.(1)微流控芯片的制备：a.利用气相沉积法在4英寸硅片表面生长一层氮化硅，使用匀胶机在氮化硅上旋涂光刻胶su8-2005，第一阶段转速为500r/min，加速度为100(r/min)/s，旋涂5～15s；第二阶段转速为4000r/min，加速度为500(r/min)/s，旋涂20～50s，将旋涂光刻胶后的硅片放置于95℃热板烘烤3min；
55.b.使用suss ma6光刻机载入掩模版(如图1所示，掩模版设计为包括100个矩阵，每个矩阵包括10000个小圆圈，每个小圆圈的直径为4.4μm，小圆圈的圆心间距10μm)和烘烤后温度降至室温的硅片，紫外曝光10～20s，将曝光后的硅片放置于95℃热板上烘烤2～5min；将烘烤后温度降至常温的硅片浸泡在su-8显影液中显影10～40s，随后用异丙醇冲洗并用气枪吹干，将吹干的硅片置于150℃热板上烘烤20～40min；
56.c.蒸镀铂层作为催化剂，通过各向异性的金属辅助化学刻蚀方法，在硅片上每个小圆圈的位置加工出深度为3.5μm的微孔结构；去除催化剂，用刻蚀液进行刻蚀，8～12min后将硅片取出清洗干净；
57.d.在硅片表面涂覆聚二甲基硅氧烷(pdms)层，在真空干燥箱中除气泡，并加热固化，固化后，将pdms层从硅片上剥离得微流控芯片底板，与同样操作制备的上盖一起放入等离子清洗机plasma处理，然后将上盖和底板贴合，烘烤5min即制成微流控芯片。
58.微流控芯片底板的显微成像图如图2所示，芯片底板中包括100个矩阵，每个矩阵包括10000个微孔，每个微孔的直径为4.4μm，高度为3.5μm，微孔的圆心间距10μm，其中a为芯片底板的一部分，包括2个矩阵，b为a中1个矩阵的放大图，包括10000个微孔，c为b的局部放大图，每个微孔的直径为4.4μm。
59.微流控芯片上盖的示意图如图3所示，上盖上有2个口供液体进出，其中一个为液体入口，另一个为液体出口；上盖的中间部分为100μm高的空间，供液体流过，即液体从上盖的入口进入微流控芯片，流过中间部分进行反应，再从上盖的出口排出废液。
60.(2)对流感病毒m基因进行检测，具体流程如图4所示。a.首先将链霉亲和素修饰的磁珠mb与生物素修饰的捕获探针(捕获探针如seq id no:1所示，具体序列为
atcctaaaattcccttagtcag)共同孵育30min，使捕获探针修饰在磁珠mb上，磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗3次，用20μl pbs重悬，加入到500μl裂解的流感病毒样本(其中流感病毒m基因的浓度为1am)中，利用捕获探针捕获流感病毒m基因30min，利用磁铁吸附对磁珠mb进行捕获，pbs清洗3次，用20μl pbs重悬，悬液中包括磁珠mb-捕获探针-流感病毒m基因复合物；
61.b.配制crispr反应体系(反应buffer(50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、100μg/ml bsa，ph＝7.9)、lwacas13a蛋白(纯化自leptotrichia wadei细菌)、crispr rna(如seq id no:2所示，具体序列为：gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaaccuugucuuuagccauuccaugag)和荧光报告探针，荧光报告探针的两端标记有荧光基团f和淬灭基团q，荧光报告探针的序列为fam-tttatt-bhq1，其中fam为荧光基团f，发绿色荧光，bhq1为淬灭基团q；
62.c.将a中制备的磁珠mb-捕获探针-流感病毒m基因复合物加入b中的crispr反应体系中，混匀形成反应液，通过微量注射泵将20μl反应液注入微流控芯片的微孔中，流速为10μl/min，然后将氟油fc-40注入微流控芯片的微孔中进行油封，从而使每个微孔中的反应被分为单独的反应，从底部加热微流控芯片至32～39℃，进行crispr反应；
63.因为靶标的数量远低于100万个，理论上每个微孔里只有一个待检核酸，开始的试验(没有磁珠)发现，很多微孔产生了荧光，但是数量远低于加入的待检核酸的数量，这是由于100万个微孔总体积只有50nl(即图4中的50fl
×
106)，而在实验时通入了20μl反应液，大部分的待检核酸被fc-40冲走，虽然实现了单分散检测，但对于待检核酸含量较低的样本，会导致假阴性结果，从而导致漏检。因此进一步将磁珠引入体系中，由于磁珠密度较大，会沉到微孔中，多余的磁珠会被fc-40推进微孔，通过多次尝试发现，当加入微孔数量2倍的磁珠时，50％以上的微孔基本每个微孔中都包含一个磁珠，因此在每个反应体系中加入200万个磁珠。
64.d.反应15min后将微流控芯片置于倒置荧光显微镜下进行观察，拍照，利用imagej软件进行计数和分析；
65.在微孔中进行crispr反应时，如果微孔中有待检测的流感病毒m基因，crispr rna就与流感病毒m基因通过碱基互补配对结合，此时会引发cas13a蛋白的顺式切割和非特异反式切割，cas13a蛋白对荧光报告探针进行非特异反式切割，荧光报告探针上的荧光基团fam被切割为游离态，进而产生绿色荧光，大量荧光基团聚集在微孔中，可在显微镜下观察到绿色荧光；
66.如果微孔中没有待检测的流感病毒m基因，只有磁珠mb连接的捕获探针，此时crispr rna没有识别到靶标，就不会引发cas13a蛋白的切割行为，荧光报告探针的荧光基团不会被切割，相应的微孔中没有游离荧光基团产生，在显微镜下不会观察到荧光。
67.实施例2
68.本实施例对浓度为0.1am的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相同。
69.实施例3
70.本实施例对浓度为10am的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相同。
71.实施例4
72.本实施例对浓度为100am的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相
同。
73.实施例5
74.本实施例对浓度为1fm的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相同。
75.实施例6
76.本实施例对浓度为10fm的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相同。
77.实施例7
78.本实施例对浓度为100fm的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相同。
79.实施例8
80.本实施例对浓度为1pm的流感病毒m基因进行了检测，具体过程与实施例1的相同。
81.对比例1
82.本对比例也进行了核酸检测，与实施例1的区别在于，本对比例中没有加入流感病毒样本，即流感病毒m基因的浓度为0，其余过程与实施例1的相同。
83.试验例
84.本试验例测试了实施例1～8和对比例1对不同浓度的流感病毒m基因的检测结果进行了显微观察，并对检测灵敏度进行了分析。其中：
85.实施例1～8和对比例1对流感病毒m基因的检测结果如图5所示。图5中，对比例1(没有加入流感病毒样本)和实施例2(流感病毒m基因的浓度为0.1am)的微孔中未见绿色荧光；实施例1(流感病毒m基因的浓度为1am)的微孔中可见绿色荧光，显示绿色荧光的微孔数量较少，视野中可见到1个微孔显示绿色荧光；实施例3(流感病毒m基因的浓度为10am)的视野中可见3个微孔显示绿色荧光；实施例4(流感病毒m基因的浓度为100am)的视野中显示绿色荧光的微孔增多；实施例5(流感病毒m基因的浓度为1fm)、实施例6(流感病毒m基因的浓度为10fm)、实施例7(流感病毒m基因的浓度为100fm)和实施例8(流感病毒m基因的浓度为1pm)中，随着流感病毒m基因浓度的升高，显示绿色荧光的微孔数逐渐增多。
86.从以上结果可以看出，采用本发明的核酸检测方法可检测到低至1am的待检核酸分子，这与常规的免扩增方法相比，灵敏度提高了100倍以上。
87.另外，发明人使用从医院采集的流感病毒真实样本，其中20例阳性样本，15例阴性样本，采用本发明中的核酸检测方法进行检测，以rt-pcr方法作为对照方法，检测的统计分析结果如图6所示，采用本发明的检测方法和rt-pcr方法对20例阳性样本和15例阴性样本的检测结果一致，说明本发明中的核酸检测方法可用于实际样本的检测。
88.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。