一种土壤菌筛选分离方法与流程

1.本发明涉及土壤菌技术领域，具体为一种土壤菌筛选分离方法。


背景技术：

2.杜仲胶是杜仲中存在的一类高分子化合物，杜仲的树皮、叶及种皮中均含有丰富的杜仲胶，其叶含杜仲胶2％～4％、树皮含6％～10％、种子含10％～18％。杜仲胶作为一种天然高分子材料，是国际上公认的能够替代传统三叶橡胶的胶源，与天然橡胶同为异戊二烯的高聚物，是反式异戊二烯的高聚体，其独特的橡-塑二重性使其成为新材料开发领域中的研究热点，。
3.传统的化学法提取杜仲胶，由于含胶细胞的细胞壁不易被有机试剂溶解，胶体不易溶出，且溶剂对细胞壁的分解作用是有限的，因此该法在杜仲胶的提取过程中存在杜仲胶产出率低、提取工艺复杂、对环境污染严重且生产成本高等问题。
4.现有的生物酶如纤维素酶、果胶酶等，经验证不能有效的降解杜仲叶使维管结构暴露从而分离杜仲胶。
5.经调查研究发现，杜仲林土壤中的落叶经过一定时间，其纤维及维管结构会被降解而杜仲胶丝保留并暴露出来，说明土壤中可能存在可有效降解杜仲叶提取杜仲胶丝的微生物菌种资源，因此提出一种土壤菌筛选分离方法。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种土壤菌筛选分离方法，解决了不能从土壤中筛选分离出能够有效降解杜仲叶的微生物菌种资源的问题。
8.(二)技术方案
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
10.一种土壤菌筛选分离方法，包括以下步骤：
11.s1：土壤采样，采集杜仲林下的腐殖质土，然后备用；
12.s2：富集培养，将取自杜仲林下的土壤分别加入pda和na培养基中富集真菌和细菌，37℃细菌和55℃嗜热菌每3d一次，共富集3次，真菌则每10d一次，共富集3次；
13.s3：再次培养，将单菌落接入液体培养基中，置于30-38℃，150r/min震荡条件下，遮光培养36-48h，得到单菌落培养液，培养基的成分为葡萄糖3-6份，na2hpo 1-3份，caco 1-3份，mgso 4
·
7h 2o 3-5份，琼脂1-8份，黄豆粉0.5-2份、水200份；
14.s4：涂布分离，富集结束后取一定的菌液利用平板涂布法将菌进行分离，挑取生长速度快、菌落数量占优势的菌种接种并保存，共分离出7株37℃菌，代号分别为37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7，55℃菌5株，代号分别为55-1、55-2、55-3、55-4、55-5，25℃菌10株，代号分别为25-1、25-2、25-3、25-4、25-5、25-6、25-7、25-8、25-9、25-10；
15.s5：菌株初筛，将细菌接种于na液体培养基，真菌接种于pda液体培养基中，分别于
37℃、25℃、55℃培养，然后将菌液稀释涂布于果胶琼脂培养基和纤维素琼脂培养基上，按照菌落的生长情况进行结果记录；
16.s6：酶活测定，将上述菌株分别接种于纤维素、果胶液体培养基中，分别在培养2、4、6天测定纤维素酶果胶酶酶活，测定方法如下：取菌液2ml于5000rpm离心5min，取1ml上清液，纤维素酶活测定方法：取1ml上清与1ml底物混合，底物为10g/l羧甲基纤维素钠配置时候先加水然后涡旋状态下加入羧甲基纤维素钠的混合物，充分震荡摇匀，50℃条件下恒温水浴30min，加入2.5ml dns试剂并充分摇匀，立即放入沸水中煮5min，取出，迅速用流水冷却至室温，分光光度计540nm下测定吸光度，进行筛选分离。
17.s7：分离纯化，取s4中培养的菌落，按照其形态进行分离，分离后再次进行富集培养，培养后把不同种类的菌落分别投入到三角瓶中，然后放入1-5片杜仲叶，在不同的温度下进行培养，观察其对叶片的分解效率。
18.作为本发明再进一步的方案，所述s1中在取样时进行分散取样，取样3-12份，在取样时需要不同处取不同深度的土样。
19.进一步的，所述s2中培养37℃细菌、55℃嗜热菌和真菌时取25g土加入到na培养基中，富集时取1ml菌液加入250ml培养基中。
20.在前述方案的基础上，所述s4中菌株用终浓度为20％甘油保存在-80℃冰箱，s4中取的菌液为100微升。
21.进一步的，所述s5中在25℃培养时可以提升温度到30℃，同时也可以根据培养时间进行变量控制温度。
22.在前述方案的基础上，所述s6中果胶琼脂培养基的配料为k2hpo4 1g，mgso4 0.5g，nano3 3g，feso4 0.01g，果胶2g，琼脂20g，纤维素琼脂培养基的配料为nano3 1.0g，nahpo4 1.2g，kh2po4 0.9g，mgso4 0.5g，kcl 0.5g，酵母浸出粉0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，羧甲基纤维素钠20g，琼脂20g。
23.本发明再进一步的方案，所述s6中酶活定义为ph 4.6，温度为50℃条件下，一个酶活力为每分钟形成1μmol，葡萄糖的酶量，单位为μmol/l(min.g)，计算公式：葡萄糖量
×
n/(待测液中原酶液量
×
反应时间
×
葡萄糖分子量)，n：为稀释倍数，本实验为4.5，待测液中原酶液量：1ml。
24.进一步的，所述s6中果胶酶活力测定方法与纤维素方法一致，底物替换为5g/l果胶溶液；计算公式：半乳糖醛酸量
×
n/(待测液中原酶液量
×
反应时间
×
半乳糖醛酸分子量)，n：为稀释倍数。
25.在前述方案的基础上，所述s7中温度可选为20-32摄氏度，时间为2-30天。
26.(三)有益效果
27.与现有技术相比，本发明提供了一种土壤菌筛选分离方法，具备以下有益效果：
28.1、本发明通过对土壤进行富集培养，能够得到更多的菌落，从而方便后期的培养试验，而且确定培养的温度，从而更好的提取不同温度下的菌落。
29.2、本发明中，通过平板涂布法将菌进行分离，然后挑取生长速度快、菌落数量占优势的菌种接种能够快速对菌落进行分离，方便后面的筛选确认。
30.3、本发明中，通过把菌液稀释涂布于果胶琼脂培养基和纤维素琼脂培养基上，按照菌落的生长情况进行结果记录，能够清楚的了解不同的菌落在培养基上的生长情况，从
而快速进行筛选适合的菌株。
31.4、本发明中，通过酶活测定能够筛选出有效破坏杜仲含胶细胞壁中的纤维素、半纤维素、黏结素、木质素等结构，从而筛选处适合的菌株。
附图说明
32.图1为本发明提出的一种土壤菌筛选分离方法的流程结构示意图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.参照图1，一种土壤菌筛选分离方法，包括以下步骤：
35.s1：土壤采样，采集杜仲林下的腐殖质土，然后备用；
36.s2：富集培养，将取自杜仲林下的土壤分别加入pda和na培养基中富集真菌和细菌，37℃细菌和55℃嗜热菌每3d一次，共富集3次，真菌则每10d一次，共富集3次；
37.s3：再次培养，将单菌落接入液体培养基中，置于37℃，150r/min震荡条件下，遮光培养40h，得到单菌落培养液，培养基的成分为葡萄糖3份，na2hpo 2份，caco 3份，mgso 4
·
7h 2o 4份，琼脂5份，黄豆粉1份、水200份；
38.s4：涂布分离，富集结束后取一定的菌液利用平板涂布法将菌进行分离，挑取生长速度快、菌落数量占优势的菌种接种并保存，共分离出7株37℃菌，代号分别为37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7，55℃菌5株，代号分别为55-1、55-2、55-3、55-4、55-5，25℃菌10株，代号分别为25-1、25-2、25-3、25-4、25-5、25-6、25-7、25-8、25-9、25-10；
39.s5：菌株初筛，将细菌接种于na液体培养基，真菌接种于pda液体培养基中，分别于37℃、25℃、55℃培养，然后将菌液稀释涂布于果胶琼脂培养基和纤维素琼脂培养基上，按照菌落的生长情况进行结果记录；记录结果如下：
40.[0041][0042]
注：-：未长； :稍长； ：适度生长； ：生长较好
[0043]
s6：酶活测定，将上述菌株分别接种于纤维素、果胶液体培养基中，分别在培养2、4、6天测定纤维素酶果胶酶酶活，测定方法如下：取菌液2ml于5000rpm离心5min，取1ml上清液，纤维素酶活测定方法：取1ml上清与1ml底物混合，底物为10g/l羧甲基纤维素钠配置时候先加水然后涡旋状态下加入羧甲基纤维素钠的混合物，充分震荡摇匀，50℃条件下恒温水浴30min，加入2.5ml dns试剂并充分摇匀，立即放入沸水中煮5min，取出，迅速用流水冷却至室温，分光光度计540nm下测定吸光度，进行筛选分离。
[0044]
s7：分离纯化，取s4中培养的菌落，按照其形态进行分离，分离后再次进行富集培养，培养后把不同种类的菌落分别投入到三角瓶中，然后放入1-5片杜仲叶，在不同的温度下进行培养，观察其对叶片的分解效率。
[0045]
本发明的s1中在取样时进行分散取样，取样3份，在取样时需要不同处取不同深度的土样，s2中培养37℃细菌、55℃嗜热菌和真菌时取25g土加入到na培养基中，富集时取1ml菌液加入250ml培养基中，s4中菌株用终浓度为20％甘油保存在-80℃冰箱，s4中取的菌液为100微升。
[0046]
尤其的，s6中果胶琼脂培养基的配料为k2hpo4 1g，mgso4 0.5g，nano3 3g，feso4 0.01g，果胶2g，琼脂20g，纤维素琼脂培养基的配料为nano3 1.0g，nahpo4 1.2g，kh2po4 0.9g，mgso4 0.5g，kcl 0.5g，酵母浸出粉0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，羧甲基纤维素钠20g，琼脂20g，s6中酶活定义为ph 4.6，温度为50℃条件下，一个酶活力为每分钟形成1μmol，葡萄糖的酶量，单位为μmol/l(min.g)，计算公式：葡萄糖量
×
n/(待测液中原酶液量
×
反应时间
×
葡萄糖分子量)，n：为稀释倍数，本实验为4.5，待测液中原酶液量：1ml，s6中果胶酶活力测定方法与纤维素方法一致，底物替换为5g/l果胶溶液；计算公式：半乳糖醛酸量
×
n/(待测液中原酶液量
×
反应时间
×
半乳糖醛酸分子量)，n：为稀释倍数，s7中温度可选为20-32摄氏度，时间为2-30天。
[0047]
在该文中的描述中，需要说明的是，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来
将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0048]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。