褐飞虱基因片段NlVgN在提高水稻抗虫性中的应用

褐飞虱基因片段nlvgn在提高水稻抗虫性中的应用
技术领域
1.本发明属于植物抗虫性领域，尤其涉及一种褐飞虱基因片段nlvgn及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。


背景技术：

2.害虫是造成全球粮食生产损失，威胁食品安全的重要因素，如何科学有效、绿色环保地减少每年由虫害造成的巨大粮食损失，是人们一直以来亟需解决的问题。水稻(oryza sativa l.)作为世界上最重要的粮食作物之一，为全球近一半人口提供主食来源。稻飞虱是水稻上主要的一类害虫，属昆虫纲半翅目(hemiptera)飞虱科(delphacidae)，常见的主要有褐飞虱(nilaparvata lugens)、白背飞虱(sogatella furcifera)和灰飞虱(laodelphax striatellus)，它们通过刺吸植物汁液、产卵损伤以及传播病毒等方式对我国水稻粮食生产造成了严重危害。
3.农药一直是控制水稻害虫的最有效的手段，具有生效快、适用范围广、使用便利等特点，但是过多的使用农药对环境和农产品的安全以及生物的多样性造成了严重的影响。因此，减少化学农药使用量、开发害虫绿色防控技术，如提升水稻抗虫性、培育抗虫水稻品种等等是今后害虫防控中的迫切需求。
4.植物在遭受植食性昆虫攻击时，会通过识别植食性昆虫相关的激发子，启动下游相关的信号通路，如钙离子流、活性氧(reactive oxygen species,ros)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,mapk)级联以及植物激素(如茉莉酸、水杨酸、乙烯等)介导的信号途径等，进而快速且特异性地重置它们的转录组、蛋白质组和代谢组，最后对植食性昆虫产生直接和(或)间接抗性。直接抗性是指植物所产生的防御反应直接降低植食性昆虫的种群适合度或驱避植食性昆虫的为害，而间接抗性则是指植物所产生的防御反应通过增强植食性昆虫天敌的作用控制植食性昆虫的为害。通过揭示植物产生直接和间接抗性的机理，从而通过一定途径提高植物的抗虫性，就可以达到安全有效控制害虫为害的目的。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种褐飞虱基因片段nlvgn及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐飞虱基因片段nlvgn及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。
7.进一步地，所述褐飞虱基因nlvgn具有seq id no.1的dna序列。
8.进一步地，所述褐飞虱基因nlvgn的编码蛋白具有seq id no.2的氨基酸序列。
9.进一步地，所述抗虫性为，提高水稻对褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的直接抗性，和通过增强水稻对稻飞虱天敌引诱作用而提高的间接抗性。
10.进一步地，将体外表达的nlvgn纯化蛋白直接应用于水稻体，或在水稻中表达所述
褐飞虱基因nlvgn。
11.本发明的有益效果是：本发明通过外用褐飞虱基因nlvgn编码蛋白nlvgn处理水稻植物体或在水稻中表达基因nlvgn，发现与对照水稻相比，可以显著提高水稻对稻飞虱的直接和间接抗性，验证了褐飞虱基因nlvgn及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。对水稻的抗虫育种，尤其是抗稻飞虱的水稻品种培育，具有十分重要的指导和促进作用。
附图说明
12.图1是用于体外表达nlvgn的载体构建示意图；
13.图2是不同处理下水稻叶鞘茉莉酸(a)和茉莉酸-异亮氨酸共轭物(b)的含量(均值 标准误，n＝5)示意图；空白对照(con)、机械损伤加施用空载体对照纯化产物(w ev)及机械损伤加施用nlvgn纯化蛋白(w nlvgn)植株；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(p《0.05，tukey’s hsd post-hoc test)；
14.图3是不同处理下褐飞虱产卵量(a)及卵的孵化率(b，均值 标准误，n＝10)示意图；con、w ev和w nlvgn分别表示未处理水稻、机械损伤加空载体纯化产物处理水稻和机械损伤加nlvgn纯化蛋白处理水稻；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(p《0.05，tukey’s hsd post-hoc test)；
15.图4是不同处理后水稻释放的挥发物组份及含量示意图(均值 标准误，n＝5)；con、w ev和w nlvgn分别表示未处理水稻、机械损伤加空载体纯化产物处理水稻和机械损伤加nlvgn纯化蛋白处理水稻；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(p《0.05，tukey’s hsd post-hoc test)；
16.图5是不同处理水稻对稻虱缨小蜂行为反应效果图(n＝60)；w ev和w nlvgn分别表示机械损伤加空载体纯化产物处理水稻和机械损伤加nlvgn纯化蛋白处理水稻；星号表示不同处理之间存在显著性差异(p《0.05，卡方检验)；
17.图6是在水稻植株中过量表达nlvgn的遗传转化载体的构建示意图；
18.图7是不同水稻品系上稻飞虱卵孵化率结果图；a、b和c分为15头产卵褐飞虱雌成虫(bph)，10头产卵白背飞虱雌成虫(wbph)以及10头产卵灰飞虱雌成虫(sbph)在野生型植株(wt，xs11)和过量表达nlvgn品系oe-1和oe-3植株上产卵为害24h后，稻飞虱卵的孵化率；星号表示不同处理之间存在显著性差异(***p《0.001，student’s t test)；柱状图为均值 标准误(n＝10)；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(p《0.05，tukey’s hsd post-hoc test)。
具体实施方式
19.本发明一种褐飞虱基因片段nlvgn及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用，利用pcr、原核表达、蛋白纯化、农杆菌转化等分子生物学技术，结合多种生物学测定方法，对目标基因及其编码产物在提高水稻抗虫性中的作用进行了研究，结果证明将褐飞虱nlvgn蛋白直接作用于水稻体，或在水稻中过量表达所述褐飞虱基因nlvgn，可激发水稻抗虫性，提高水稻对稻飞虱的抗性。
20.本发明通过将基因片段nlvgn编码产物应用到水稻植物体，或在水稻中过表达基因片段nlvgn，来提高水稻植株的抗虫性。所述褐飞虱基因片段nlvgn，具有seq id no.1的
dna序列。具体地，为了提高水稻植株的抗虫性，可以通过两种方案来实现：
21.(1)通过体外表达褐飞虱基因片段nlvgn，获得蛋白nlvgn，然后应用于植物体；
22.(2)利用转基因技术将基因片段nlvgn在植物中表达。
23.本发明提供了两种提高水稻抗虫性的方法，包括：将体外表达的褐飞虱基因片段nlvgn编码蛋白nlvgn应用于水稻植物体以及在水稻中过量表达褐飞虱基因片段nlvgn，获得转nlvgn基因水稻植株。
24.针对基因nlvgn对虫害的适用范围，本发明提供了外用nlvgn处理水稻，或转nlvgn基因水稻，提高对褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱直接抗性和间接抗性的验证实验；发现与正常的水稻相比，外用nlvgn处理水稻或转nlvgn基因水稻，可以降低稻飞虱卵孵化率、增强对稻飞虱卵期寄生蜂稻虱缨小峰的引诱作用。
25.本发明抗虫基因为seq id no.1的dna序列，编码438个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现该基因及其编码产物与水稻的抗虫性密切相关，通过将nlvgn蛋白体外表达后直接应用于水稻体，或通过在水稻中过量表达nlvgn基因，均能有效提高水稻对稻飞虱的直接抗性和间接抗性。本发明将在作物害虫防控和抗虫育种，特别是在水稻害虫防控和抗虫育种中得到广泛应用。
26.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但应申明，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明保护范围。
27.实施例1：褐飞虱基因nlvgn编码产物的体外获得。
28.1)取10头褐飞虱怀卵雌成虫，利用sv total rna isolation system(promega)试剂盒提取总rna，反转为cdna。
29.2)通过pcr技术，扩增基因nlvgn的orf序列片段。所使用的特异性引物如下：
30.nlvgn-f1:5
’‑
ccggaattcagcggcagtggaccatggaa-3’31.nlvgn-r1:
32.其中下划线位置为酶切位点，粗体为终止密码子。
33.3)pcr产物回收纯化后和pet-28a(novagen)表达载体同时分别做双酶切(ecorⅰ和xhoⅰ)；酶切后，用t4连接酶将pcr片段酶切产物克隆至表达载体上，如图1所示。
34.4)重组载体及pet-28a空载体(作为对照)转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(transgen#cd601)，经过细菌培养、单克隆的挑选和细菌扩增，提取质粒用以测序。
35.5)测序正确后，在37℃、200r/min的摇床中，将含有重组质粒及空载的大肠杆菌bl21(de3)菌株扩大培养至菌液od
600
达到0.5-0.6之间，加入iptg(终浓度1mmol/l)，在16℃、150r/min的摇床中过夜诱导表达蛋白。
36.6)使用ni-nta agarose(qiagen#30310)，按照说明书步骤纯化重组蛋白及空载产物。
37.7)纯化蛋白使用pierce
tm
bca protein assay kit测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书配制反应液及标线。最终纯化蛋白产物加入蛋白酶抑制剂(pmsf终浓度1mmol/l)保存于-80℃冰箱。
38.实施例2：nlvgn蛋白处理水稻显著提高茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸共轭物的合成。
39.1)水稻处理：每株水稻叶鞘部位先用3#昆虫针针刺80下，然后均匀涂抹40μl的nlvgn纯化蛋白溶液，以水稻叶鞘部位针刺80下，然后均匀涂抹40μl的空载体纯化产物溶液
a.attraction of the parasitoid anagrus nilaparvatae to rice volatiles induced by the rice brown planthopper nilaparvata lugens[j].journal of chemical ecology,2005,31(10):2357-2372。
[0054]
从图5可见，nlvgn蛋白处理后，水稻挥发物对褐飞虱卵寄生蜂稻虱缨小蜂具有显著的吸引作用，表明nlvgn蛋白处理能提高水稻对褐飞虱的间接抗性。
[0055]
实施例6：过表达nlvgn的转基因品系水稻的获得。
[0056]
1)利用特异性引物(见下)，通过rt-pcr扩增nlvgn全长orf；利用dna亚克隆方法将其连入pcambia-1301载体，获得过表达载体，如图6所示。通过电击法，将过表达载体转入农杆菌eha105中，用于后续植物转化。引物如下：
[0057]
nlvgn-f2:f2:
[0058]
nlvgn
–
r2:
[0059]
其中下划线位置为酶切位点，斜体为his tag，粗体为终止密码子。
[0060]
2)用含有过表达载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织。经过筛选和分化，得到完整的t0代植株。
[0061]
3)t0代转基因植株获得的t1代种子，经gus染色筛选，去除未转入nlvgn基因的植株，并单株种植，收获t2代种子。对每个单株的种子进行鉴定。获得转nlvgn基因的纯合品系oe-1和oe-3，用于后面的生物学功能分析。
[0062]
实施例7：nlvgn过表达品系显著降低稻飞虱卵孵化率。
[0063]
1)将供试水稻(xs11，oe-1，oe-3品系)去除黄叶后，单株移至约含有500ml营养液的塑料杯中(用海绵固定水稻带孔的塑料板上)；每株水稻的基部罩以两头通透的圆柱形玻璃罩(直径4cm，长8cm，筒壁均匀分布48个直径0.88mm的小孔)，水稻恢复2-3天供实验用。
[0064]
2)按照实施例3中的方法，测定不同水稻品系上3种稻飞虱，包括褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱，卵的孵化率，每种处理各设置10个生物学重复。
[0065]
从图7可见，在水稻中过表达nlvgn能够显著降低3种稻飞虱的卵孵化率，即显著提高了水稻对稻飞虱的直接抗性。