有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌及其制剂的制备及应用的制作方法

1.本发明涉及一种具有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌菌株及其固定化菌粉和菌球的制备方法及应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.乳酸菌类益生菌是一群可以分解淀粉和糖类产生乳酸的革兰氏阳性乳杆菌和乳球菌，厌氧或兼性厌氧生长，目前已从食品发酵、医药、保健等人体健康领域的广泛应用，延伸至畜禽和水产养殖等领域，是目前我国农业部、美国食品及药物管理局(fda)等国内外政府批准使用的数量最多的一类安全微生物菌种。乳酸菌在水产养殖中的有益作用主要表现为：一方面通过泼洒乳酸菌调节水质，抑制水体病原菌的滋生，降低水产动物患病的概率；另一方面，通过拌饵投喂或饲料发酵投喂，改善胃肠道环境，抑制肠道有害菌的生长，促进饲料营养吸收，增强其对病原菌的抵抗力，显著促进水产动物的生长。相关报道如张孝东等(2017)提供三株乳酸菌菌株胚芽乳杆菌bcrc 910435、戊糖片球菌bcrc 910480以及发酵乳杆菌lf26的混合物提升水产养殖池的溶氧量。沈锦玉等(2017)提供了一株植物乳杆菌grlp-25可以对水产动物养殖中出现的病原菌(阴沟肠杆菌、费氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌、嗜水气单孢菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌)具有敏感的抑菌活性，并且能提高水产动物免疫功能，提高动物健康水平，还可以降低养殖水体中部分有害因子(氨氮和亚硝酸盐)的含量，改善养殖生态环境。赵丽萍等(2020)阐明鼠李糖乳杆菌gg株(lgg)饲喂可以减轻肠道炎症的作用，其机制可能与肠屏障相关分子表达水平增加和肠道致病菌丰度降低有关。此外，乳酸菌与好氧芽孢杆菌益生菌相比较，具有不消耗养殖水体溶氧的优点，克服了芽孢杆菌的好氧特性可能产生养殖水体缺氧风险的问题。因此，乳酸菌在水产养殖中具有巨大的应用价值和发展潜力。
3.但是，目前乳酸菌没有如芽孢杆菌一般在水产养殖中得到广泛应用，主要原因是(1)现有的饲用乳酸菌主要来自青贮饲料发酵，适宜牛羊等反刍动物养殖，如植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌等。适宜水产养殖环境的乳酸菌品种少，对低温含氧养殖水体适应性弱，易失活，缺乏对水产病原菌的拮抗特性。(2)使用成本高。乳酸菌为严格厌氧菌或兼性厌氧菌，大多营养要求高，大规模高密度纯种培养需要厌氧发酵设备和厌氧环境条件，培养成本高，且无芽孢，环境抗逆性差，易失活，难保藏。与枯草芽孢杆菌等好氧菌剂相比，芽孢杆菌的好氧发酵采用通用好氧发酵罐，发酵系统成熟，发酵罐体积可达到50吨以上，而纯种乳酸菌发酵需要专一的厌氧系统，厌氧发酵罐规模小，无法达到好氧发酵的体积规模，因而乳酸菌纯种活菌制剂缺乏规模效应，制造费用高昂，使用成本高。(3)乳酸菌多属严格厌氧或兼性厌氧菌,以泼洒或拌饵投喂方式施用乳酸菌时，一般乳酸菌对氧的耐受能力差，在含氧的养殖水体环境中极易失活，有效时间短，游离乳酸菌在池塘换水时易随水流失，需要重新添加，增加养殖成本。(4)缺乏多功能的新型乳酸菌。目前水产养殖以高密度集约化的静水养殖模式为主，养殖密度高，投喂高蛋白饲料。由于养殖动物对饲料利用率低，如饲料蛋
白的利用率仅在30％左右，饲料中大部分氮磷随着残饵和排泄物排入养殖水体，使养殖水体生态环境恶化，池塘自净与调节能力丧失，水体中氨氮、亚硝酸盐浓度超标，危害养殖动物健康，使其自身免疫能力下降，造成细菌性病害频发，给养殖生产带来极大危害。因此急需开发多功能的新型乳酸菌菌种，发挥降低亚硝酸盐等不良水质因子的净化调节功能，拮抗病原菌，提高饲料利用率，促进养殖动物生长。
4.鼠李糖乳杆菌是目前国际上公认的好的乳酸菌菌种之一，最初由两位美国教授在1983年从健康人体肠道中分离出来，目前已广泛应用在食品和饮料中。guarino a(2009)、yan f(2006)报道，在防治儿童腹泻方面，鼠李唐乳杆菌是其中研究最广泛且临床效果明确的益生菌。李小琼(2010)认为鼠李唐乳杆菌能够在人和猪肠道内定植，通过平衡肠道菌群增强肠粘膜的生理屏障及免疫功能，起到预防和治疗腹泻的作用。产肠毒素性大肠杆菌是引起儿童腹泻和仔猪腹泻的首要共同致病菌，因此在防治仔猪腹泻中具有潜在的应用价值，是具有潜力的抗生素替代品。在水产养殖方面，迄今，日本、英国、澳大利亚、芬兰、挪威等国家对鼠李糖乳杆菌等鱼类益生菌活菌开发与应用研究比国内早。在虹鳟防疫方面，国外报道(2000)在人为实施杀鲑气单胞菌攻击情况下，投喂鼠李糖乳杆菌可使虹鳟死亡率减少60％左右。陈营等(2011)、王福强等(2005)报道在健康的牙鲆(paralichthys olivaceus)肠道内分离得到了鼠李糖乳杆菌，说明鼠李糖乳杆菌也是某些水产动物肠道内固有的细菌之一。目前国内有关鼠李糖乳杆菌应用于养殖业的相关专利较少。专利cn 111876365 b“一种鼠李糖乳杆菌及其用途”是鼠李糖乳杆菌与饲料混合饲喂，促进南美白对虾的生长。专利cn 108148780 b“一种复合菌剂及其制备方法和应用”涉及畜牧业技术，鼠李糖乳杆菌用于解决玉米穗青贮所存在的干物质流失严重，发酵品质低的问题。
5.本发明所述鼠李糖乳杆菌ht4分离自鱼肠道中,兼性厌氧，适应养殖水体环境，不仅对缺氧水体中亚硝酸盐具有良好的降解作用，对多种淡水水产病原菌具有较好的抑菌活性，而且通过单一菌种或与其它益生菌联合发酵棉粕等饲料原料或鱼虾蟹饲料，可以改善棉粕等饲料原料及发酵鱼虾蟹饲料的营养价值，降低植酸、单宁、游离棉酚等抗营养因子的浓度，提高鱼虾蟹饲料的饲料利用率。这些优良的生物学特性与上述报道的鼠李糖乳杆菌不同。此外，通过发酵固定化培养，提高菌体耐氧性能，采用普通好氧发酵罐系统发酵，降低高密度发酵培养成本；采用中空石英球或陶粒与海藻酸钠、二氧化硅等材料，制备固定化鼠李糖乳杆菌培菌球，提高对水体中亚硝酸盐等不良水质因子的持续降解能力，降低使用成本。因此，本发明所述鼠李糖乳杆菌ht4是一株多功能的新型乳酸菌菌种，在水产养殖中具有良好的应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种具有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌菌株(lacticaseibacillus rhamnosus)ht4及其固定化培养制备菌粉和菌球的方法及应用。ht4菌株能够在养殖水体缺氧条件下有效降解亚硝酸盐，对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等水产常见致病菌具有拮抗作用。通过菌种活化、发酵固定化培养和制剂制备得到低成本菌粉、水剂，可以用来发酵棉粕、豆粕等饲料原料或鱼虾蟹饲料；也可以与具有拮抗水产病原菌特性的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ab90008-15、乳酸肠球菌(enterococcus lactis)jlb-15及酿酒酵母
cicc1421进行复配，发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料，降低饲料中植酸、单宁、棉酚等抗营养因子浓度，获得的发酵饲料富含益生菌、可溶蛋白、酸溶蛋白及活性小肽，作为水产养殖功能性饲料，在日粮中添加10％～50％，就能够显著提高水产养殖动物的抗病能力，促进生长，提高增重率、特定增长率，显著降低饵料系数。
7.采用中空石英球或陶粒与海藻酸钠、二氧化硅等材料，制备固定化鼠李糖乳杆菌ht4培菌球，投放在养殖水体中，可以持续降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，抑制气单胞菌等水产病原菌的生长，改善池底缺氧养殖环境。
8.本发明的技术方案，一种鼠李糖乳杆菌ht4，分类命名为鼠李糖乳杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)ht4，保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2022年1月5日，分类命名鼠李糖乳杆菌ht4(lacticaseibacillus rhamnosus)ht4，保藏编号cctcc no：m 20211693。
9.本发明的鼠李糖乳杆菌菌株ht4，革兰氏阳性菌，镜检呈杆状，不产生芽孢，该菌株属于非严格厌氧菌，生长温度范围广，15～45℃均能生长。在mrs平板上厌氧培养48h，表面生长的菌落直径为1.0～3.0mm，形态规则，圆形、表面光滑、湿润、不透明、白色的菌落。
10.鼠李糖乳杆菌ht4属于非严格厌氧菌，兼性厌氧，氧耐受，同型发酵糖类物质生成益生物质l-乳酸(生物相容性好于d-乳酸和dl-乳酸)，能够适应养殖池塘水体及底泥环境，对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等水产常见致病菌具有拮抗作用，其中对维氏气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果尤为显著。同时该菌株能够在养殖水体缺氧条件下有效降解亚硝酸盐。采用中空石英球或陶粒与海藻酸钠、二氧化硅等材料，制备固定化鼠李糖乳杆菌ht4培菌球，投放在养殖水体中，可以持续降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，抑制气单胞菌等水产病原菌的生长，改善池底缺氧养殖环境。
11.通过菌种活化、发酵固定化培养和制剂制备得到鼠李糖乳杆菌ht4菌粉或水剂，可以发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料，也可以与具有拮抗水产病原菌特性的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ab90008-15、乳酸肠球菌(enterococcus lactis)jlb-15及酿酒酵母cicc1421进行复配，发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料，降低饲料中植酸、单宁、棉酚等抗营养因子浓度，获得的发酵饲料富含益生菌，酸溶蛋白及活性小肽，作为水产养殖功能性饲料，在日粮中添加10％～50％，就能够显著提高水产养殖动物的抗病能力，促进生长，提高增重率、特定增长率，显著降低饵料系数。综上所述，鼠李糖乳杆菌ht4是具备发酵饲料和水质改善功能的新型水产养殖用多功能微生物菌株。
12.所述菌株ht4制备具有水产病原菌拮抗特性的制剂的方法，步骤如下：
13.(1)菌种活化：
14.无菌开启鼠李糖乳杆菌ht4的冻干保藏菌种，接种于装有mrs肉汤的试管中，于30～38℃静置培养24～72h，然后转接于mrs肉汤三角瓶中，30～38℃培养活化18～48h；反复活化2～3次，镜检，mrs平板厌氧计数，当菌体浓度108～109cfu/ml时作为种子液；
15.mrs肉汤培养基组成以g/l计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，ph 5.7
±
0.2；
16.(2)固定化发酵培养：
17.三角瓶种子培养液制备：将步骤(1)所得种子液以体积比1％～10％接种量接入装有固定化发酵培养基的5l三角瓶，装液量为体积比90％，于30～38℃静置培养24～48h，平板计数，当菌体浓度达108～109cfu/ml时，作为固定化培养种子液，接入普通好氧发酵罐中进行一级、二级固定化发酵逐级放大扩培，5l三角瓶种子液接入200l发酵罐，再接入2000l发酵罐甚至更大规模的发酵罐，发酵罐间移种以无菌空气压送完成接种；
18.一级发酵罐固定化发酵培养：将固定化培养种子液以体积比1％～10％接种量接入200l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％～90％，无菌空气保持罐压至0.01～0.05mpa，间歇搅拌，转速50r/min，30～38℃培养20～48h，ph为4.0～5.0时，结束培养，得到一级固定化培养液，其中鼠李糖乳杆菌ht4菌体被吸附固定在海藻酸钙 二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，活菌体浓度≥5
×
109cfu/ml；
19.二级固定化培养：将一级发酵罐培养液用无菌空气压送，以体积比1％～10％接种量接入2000l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％～90％，无菌空气保持罐压至0.01～0.05mpa，间歇搅拌，转速50～80r/min，30～38℃培养18～48h，当发酵液ph降至4.0～5.0，培养结束，得到二级固定化培养液，其中鼠李糖乳杆菌ht4菌体被吸附固定在海藻酸钙 二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，菌体浓度≥5
×
109cfu/ml；
20.固定化发酵培养基组成以g/l计：蛋白胨5～15，酵母膏2～10，葡萄糖10～40，吐温-80 0～1.0，磷酸氢二钾1～5，柠檬酸三铵0～2，乙酸钠5，硫酸镁0～0.2，硫酸锰0～0.05，碳酸钙5～40，海藻酸钠1～10，二氧化硅1～10，以自来水定容配制，ph 6.0～7.0，121℃灭菌30min；
21.(3)具有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌ht4制剂的制备：
22.鼠李糖乳杆菌ht4菌粉的制备：将步骤(2)所得二级固定化培养液经6000～10000r/min高速离心收集湿菌体，湿菌体与脱脂奶粉及淀粉的质量比为：湿菌体:脱脂奶粉:淀粉＝1:0.1:2～5进行混合，经20～40℃真空干燥24～48h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，得到鼠李糖乳杆菌ht4菌粉，菌粉中ht4活菌浓度不低于1
×
10
10
cfu/g；
23.鼠李糖乳杆菌ht4水剂的制备：将步骤(2)所得二级固定化培养液进行灌装，获得ht4水剂，菌液水剂中ht4活菌浓度不低于5.0
×
109cfu/ml。
24.步骤(2)中所述鼠李糖乳杆菌ht4的固定化发酵逐级放大扩培，即：5l三角瓶，再200l发酵罐，再2000l甚至更大规模的发酵罐，均在普通好氧发酵罐中进行，发酵罐间移种以无菌空气压送方式完成接种，以无菌空气保持发酵罐罐体正压来防止染菌；发酵培养过程中，鼠李糖乳杆菌ht4菌体被吸附固定在海藻酸钙 二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，并获得进一步增殖生长；固定化发酵培养后，鼠李糖乳杆菌ht4菌体浓度≥5
×
109cfu/ml。
25.所述方法制备的具有水产病原菌拮抗特性制剂的应用：制得的鼠李糖乳杆菌ht4菌粉或水剂用于发酵棉粕、豆粕饲料原料及鱼虾蟹饲料；
26.或鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂的制备：
27.鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂由鼠李糖乳杆菌ht4菌粉、枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15、及酿酒酵母cicc1421四个菌种复配制备。将鼠李糖乳杆菌ht4菌粉与枯草芽孢杆菌ab90008-15菌粉、乳酸肠球菌jlb-15菌粉及酿酒酵母cicc1421菌粉，按质量比1：0.1～1：0.1～1：0.01～1进行混合配制而成鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂。
28.其中鼠李糖杆菌ht4单菌菌粉的制备按以上所述方法进行。枯草芽孢杆菌菌粉、乳
酸肠球菌菌粉及酿酒酵母菌粉的制备按如下方法进行：
29.(a)枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ab90008-15菌粉的制备：
30.(a-1)枯草芽孢杆菌ab90008-15的活化及种子制备：
31.无菌开启枯草芽孢杆菌ab90008-15冻干管保藏菌种，接种于麸皮营养琼脂，于30～37℃培养24～48h，然后转接麸皮营养琼脂斜面，反复活化2～3次，镜检，当枯草芽孢杆菌90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，刮取菌苔，用无菌水制备菌悬液作为枯草芽孢杆菌种子液；
32.麸皮营养琼脂斜面培养基组成以g/l计：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl 5,麸皮10，琼脂15-20，以蒸馏水定容配制，ph 7.0～7.2；
33.(a-2)枯草芽孢杆菌发酵培养及菌粉制备：
34.将步骤(a-1)所得种子菌悬液以体积比1％～10％接种量接入装有发酵培养基的200l发酵罐中进行一级种子罐培养，种子罐装液量为体积比50％～60％，通气量5m3/h，罐压0.05～0.1mpa，转速为80～120r/min，30～37℃培养20～30h后，获得一级种子罐培养液；然后将种子罐培养液以体积比1％～10％接种量，转接2000l发酵罐中进行二级发酵罐培养，发酵罐装液量为体积比50％～60％，通气量50m3/h，罐压0.05～0.1mpa，转速为80～120r/min，30～37℃培养20～24h，得到发酵液；
35.发酵培养基组成以g/l计：麸皮10～50，以自来水定容配制，ph 7.0；
36.将上述枯草芽孢杆菌ab90008-15发酵罐培养液经6000～10000r/min高速离心,收集湿菌体与淀粉和碳酸钙按质量比1：0.5：0.5混合,然后在30～50℃真空干燥，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得枯草芽孢杆菌菌粉，其中菌浓度均不低于5.0
×
109cfu/g。
37.(b)乳酸肠球菌(enterococcus lactis)jlb-15菌粉的制备：
38.(b-1)乳酸肠球菌jlb-15菌种活化及种子：
39.无菌开启乳酸肠球菌jlb-15冻干管保藏菌种，接种于装有mrs肉汤的试管于30～38℃培养24～48h，然后转接于装有mrs肉汤培养基的三角瓶，反复活化2～3次，镜检，平板计数。当乳酸肠球菌菌体浓度﹥108cfu/ml,可以作为种子液；
40.(b-2)乳酸肠球菌jlb-15发酵培养及菌粉制备：
41.一级种子罐培养：将步骤(b-1)所得种子液以体积比1％～10％接种量接入装有一级发酵培养基的200l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％～80％，通气量1～3m3/h，罐压0.03～0.1mpa，50～80r/min搅拌，30～38℃培养24～48h，得到一级种子培养液；
42.一级种子罐培养基组成以g/l计：蛋白胨15，酵母膏4，葡萄糖30，吐温-80 1，柠檬酸三铵2，碳酸钙10，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，七水硫酸镁0.2，以自来水定容配制，ph 6.0
±
0.2；
43.二级发酵罐培养：将一级培养发酵液作为种子液以体积比5％～10％接种量接入装有二级发酵培养基的2000l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％～80％，通气量20～40m3/h，罐压0.03～0.1mpa，50～80r/min搅拌，30～38℃恒温培养24h左右，得到发酵液；
44.二级发酵罐培养基组成以g/l计：蛋白胨5～15，酵母膏4～10，葡萄糖5～20，碳酸钙1～10，以自来水定容配制,ph7.0；
45.将上述乳酸肠球菌jlb-15二级发酵罐培养液经6000～10000r/min高速离心,收集湿菌体与淀粉和碳酸钙按质量比1：0.5：0.5混合,然后在30～50℃真空干燥，粉碎机粉碎，
过0.9mm筛，获得乳酸肠球菌菌粉，其中菌浓度均不低于5.0
×
109cfu/g。
46.(c)酿酒酵母cicc1421菌粉的制备：
47.(c-1)酿酒酵母cicc1421菌种活化及种子制备：
48.无菌开启酿酒酵母cicc1421冻干管保藏菌种，接种于麦芽汁琼脂斜面，于28～30℃培养48～72h,然后转接麦芽汁琼脂斜面，反复活化2～3次，镜检，刮取酵母菌菌苔，转接装有摇瓶种子培养基的三角瓶，体积装量20～40％，150～200r/min，于28～30℃培养24～48h，培养液用次甲基蓝染色液染色后，用血球计数板计数酵母，当酵母菌菌体浓度﹥108cfu/ml时作为酵母菌种子液；
49.麦芽汁琼脂培养基组成：10
°
bx麦芽汁1000ml，琼脂20g/l；
50.酵母菌摇瓶种子培养基组成以g/l计：葡萄糖30～60，磷酸二氢钾0.5～3，蛋白胨5～15，酵母膏0～5，七水硫酸镁0.3～1，尿素0～1，硫酸铁0～1，蒸馏水水定容配制，ph自然；
51.(c-2)酿酒酵母cicc1421发酵培养及菌粉制备：
52.一级种子罐培养：将步骤(c-1)所得种子液以体积比1％～10％接种量接入装有发酵培养基的200l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比60％～70％，通气量3m3～5m3/h，罐压0.05～0.1mpa，搅拌转速为50～100r/min，28～30℃培养24～72h，得到一级种子罐培养液；
53.二级发酵罐培养：将一级种子罐培养液作为种子液，以体积比5％～10％接种量，接入装有二级发酵培养基的2000l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比60％～70％，通气量30～50m3/h，罐压0.05～0.1mpa，搅拌转速为70～100r/min，28～30℃培养20～24h，得到发酵液；
54.酵母菌发酵培养基组成以g/l计：葡萄糖30～60，磷酸二氢钾0.5～3，蛋白胨5～15，酵母膏0～5，七水硫酸镁0.3～1，尿素0～1，硫酸铁0～1，自来水定容配制，ph自然；
55.将上述酿酒酵母cicc1421二级发酵罐培养液经6000～10000r/min高速离心,收集湿菌体与淀粉和碳酸钙按质量比1：0.5：0.5混合,然后在30～50℃真空干燥，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得酿酒酵母菌菌粉，其中菌浓度均不低于5.0
×
109cfu/g。
56.上述步骤制备的鼠李糖乳杆菌ht4单菌制剂及其复合菌剂的应用：
57.①
鼠李糖乳杆菌ht4单菌菌粉、水剂用于发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料。鼠李糖乳杆菌ht4单菌菌粉按质量百分比0.1％～5％与饲料或饲料原料混合，鼠李糖乳杆菌ht4单菌水剂按质量百分比1％～10％与饲料或饲料原料混合，加水调节物料含水量25％～40％，30～35℃密闭发酵3～5天。
58.②
鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂用于发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料：鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂按质量百分比0.1％～5％与棉粕、豆粕等饲料原料或鱼虾蟹饲料混合，加水调节物料含水量25％～40％，30～35℃密闭发酵3～5天。
59.上述鼠李糖乳杆菌ht4单菌或复合菌剂发酵饲料后，无霉变，发酵饲料富含益生菌，酸溶蛋白提高40％～200％，活性小肽提高20％～200％，并且植酸、单宁、游离棉酚含量显著降低。鼠李糖乳杆菌ht4单菌或复合菌剂发酵饲料作为水产养殖功能性饲料，在日粮中添加10％～50％，就能够显著提高水产养殖动物的抗病能力，促进生长，提高增重率、特定增长率，显著降低饵料系数。
60.鼠李糖乳杆菌ht4固定化菌球的制备：鼠李糖乳杆菌ht4菌种活化后，在菌液中添加质量体积比0.1％～1％的二氧化硅，混匀浸泡1h，再添加质量体积比2％～4％海藻酸钠
混匀，将中空石英球或陶粒(市售)在混合液中浸润吸附1h后取出,再浸泡在3％氯化钙溶液中，4～8℃冰箱中固化交联5～20h，即获得固定化鼠李糖乳杆菌ht4培菌球，菌球中菌体浓度不低于2
×
108cfu/g。
61.固定化鼠李糖乳杆菌ht4培菌球的应用：菌球中菌体浓度不低于2
×
108cfu/g，固定化鼠李糖乳杆菌ht4培菌球按100～300g/亩
·
米的用量，以挂袋方式投放在养殖池塘水中，连续使用20天以上，可以持续降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，抑制气单胞菌等水产病原菌的生长，改善池底缺氧养殖环境。
62.鼠李糖乳杆菌ht4抑菌性的测定：将致病菌与鼠李糖乳杆菌ht4菌液共同接入lb肉汤中，使培养基中ht4起始菌浓度为106cfu/ml，致病菌起始菌浓度为106～107cfu/ml，30℃静置培养48h，于0h、24h、48h取样计数，观察ht4对致病菌的拮抗作用。结果显示，鼠李糖乳杆菌ht4对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等水产常见致病菌具有拮抗作用，其中对维氏气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果尤为显著。
63.鼠李糖乳杆菌ht4降解亚硝酸盐能力的测定：mrs肉汤培养基中分别添加2mol/l亚硝酸钠0.1ml、0.2ml、0.3ml，分装50ml/试管，121℃灭菌15min，接种活化后的鼠李糖乳杆菌ht4菌悬液5ml，使ht4起始菌浓为107cfu/ml，对照组接入5ml无菌蒸馏水，35℃静置培养24h，其中0h、5h和24h取样，4000r/min离心5～10min，取上清液，用美国哈希试剂检测亚硝氮浓度。结果显示鼠李糖乳杆菌能够耐受亚硝酸盐浓度高达300mg/l以上，在厌氧条件下，24h内能够显著降解亚硝氮，降解率超过95％。
64.鼠李糖乳杆菌ht4静置厌氧同型发酵产l-乳酸的测定：将鼠李糖乳杆菌ht4接入培养基中，培养基组成以g/ml计为：大米10％ 米糠1％混合糖化液，豆粕酶解液3％，酵母膏0.15％，番茄汁3％，ph6.8，接种后分次添加碳酸钙5％～10％；培养条件：培养温度35～45℃,静置厌氧发酵培养，培养时间24～72h。
65.l-乳酸检测：将发酵液先加热至80～100℃，然后于4000r/min离心5min，取上清液用l-乳酸脱氢酶法测定或以此方法为原理的sba-40c生物传感分析仪(山东科学院生物研究所研制)测l-乳酸含量，测得l-乳酸含量达60g/l，糖酸转化率85％以上。
66.本发明的有益效果：
67.(1)鼠李糖乳杆菌是兼性厌氧乳酸菌菌株，在厌氧条件下生长良好，能耐氧，但在高溶氧条件下生长受到抑制。为了获得高浓度的菌体制剂，传统的做法是采用专一的厌氧罐培养，冷冻干燥获得菌粉，成本高昂，不能满足畜禽渔养殖户低成本使用的需求。本发明利用低成本的普通好氧发酵罐进行鼠李糖乳杆菌固定化发酵培养，利用鼠李糖乳杆菌易被二氧化硅吸附、发酵糖产酸溶解碳酸钙的特性，释放游离钙离子，与海藻酸钠形成海藻酸钙凝胶，将菌体吸附固定在海藻酸钙 二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，隔绝溶氧保护菌体活性，从而实现在好氧普通发酵罐中逐级放大扩培时可以采用无菌空气压送移种，培养过程中能够以无菌空气保持罐体正压来防止染菌。此外，鼠李糖乳杆菌发酵利用糖类物质生长增殖时，代谢生成l-乳酸，其生物相容性好于d-乳酸和dl-乳酸，l-乳酸溶解碳酸钙产生co2，促进菌体能够在含氧条件下获得进一步增殖生长，且菌体增殖效果优于简单的静置培养，显著降低了厌氧乳酸菌从三角瓶至200l普通发酵罐，再至2000l普通发酵罐，甚至更大规模发酵罐的的规模化增殖扩培成本，发酵液中鼠李糖乳杆菌ht4菌浓超过5
×
109cfu/ml；
然后通过真空干燥或低温真空喷雾干燥获得ht4菌浓超过1
×
10
10
cfu/g的高浓度菌粉制剂，从而使得鼠李糖乳杆菌ht4水剂及菌粉制剂的使用成本进一步降低，有利于在畜禽渔生态养殖中推广应用鼠李糖乳杆菌ht4菌剂。综上所述，与一般乳酸菌厌氧发酵所需成本高昂的专一性厌氧发酵罐系统不同，本发明筛选获得的鼠李糖乳杆菌ht4菌株实现了在普通好氧发酵罐中高密度低成本的固定化发酵扩培，此方法可以推广应用至其它厌氧乳酸菌的发酵培养，使得乳酸菌低成本、大规模发酵扩培成为可能。
68.(2)鼠李糖乳杆菌ht4对水产常见病原菌具有广谱拮抗特性，能够有效抑制鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌的生长，其中对维氏气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果尤为显著。因此，在水产养殖中使用鼠李糖乳杆菌ht4活菌制剂能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物病害，保护水产动物健康生长。
69.(3)通过菌种活化、发酵固定化培养和制剂制备得到鼠李糖乳杆菌ht4菌粉、水剂，可以用来发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料，也可以与具有拮抗水产病原菌特性的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ab90008-15、乳酸肠球菌(enterococcus lactis)jlb-15及酿酒酵母cicc1421菌进行复配，制备鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂，发酵棉粕、豆粕等饲料原料及鱼虾蟹饲料；获得的发酵饲料不仅富含益生菌，而且酸溶蛋白及活性小肽浓度提高，植酸、单宁、游离棉酚等抗营养因子浓度降低，从而全面提升了发酵饲料的营养价值。将此发酵饲料作为水产养殖功能性饲料，在日粮中添加10％～50％，可以显著提高水产养殖动物的抗病能力，促进生长，提高增重率和特定增长率，显著降低饵料系数。
70.(4)鼠李糖乳杆菌ht4能够在养殖水体缺氧条件下有效降解亚硝酸盐。采用中空石英球或陶粒与海藻酸钠、二氧化硅等材料，制备固定化鼠李糖乳杆菌培菌球，投放在养殖水体中，可以持续降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，抑制气单胞菌等水产病原菌的生长，改善池底缺氧养殖环境，使用周期大于20天，效果显著优于游离菌的泼洒使用。
71.生物材料样品保藏
72.(1)一种鼠李糖乳杆菌ht4，分类命名为鼠李糖乳杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)ht4，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉武汉大学。保藏编号cctcc m 20211693，保藏日期2021年12月29日。
73.(2)乳酸肠球菌jlb-15，分类命名为乳酸肠球菌(enterococcus lactis)jlb-15，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉武汉大学。保藏编号cctcc m 20211694，保藏日期2021年12月29日。
74.(3)枯草芽孢杆菌ab90008-15，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ab90008-15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号cgmcc no.18684，保藏日期2019年10月15日。
75.(4)酿酒酵母cicc1421，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
附图说明
76.图1鼠李糖乳杆菌ht4基于16s rrna基因序列比对结果以enterococcus faecalis nbrc 100480(ab681178)为外枝构建的neighbor-joining系统发育树。
具体实施方式
77.实施例1：菌种的筛选
78.在无锡鹅湖养殖池塘采集异育银鲫样品，将鱼体解剖取肠道，加入生理盐水，研磨制成匀浆液，取移液枪吸取0.1ml于mrs固体培养基上涂布25～30℃厌氧培养。根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ht4。
79.实施例2：菌种鉴定
80.(1)形态特征：鼠李糖乳杆菌菌株ht4，革兰氏染色为阳性，短杆菌(0.5～1.2)μm
×
(0.5～1.5)μm，无芽孢，无鞭毛，不运动。在mrs平板涂布后厌氧培养生长出的菌落呈白色，不透明，直径1～3mm，倾注培养的深层菌落呈透镜或菱形，平板底部菌落呈扁平圆形，表面辐射状，显微镜(16
×
100)观察，菌体呈短杆状，两端呈圆形略方形态，通常成对链状排列。
81.(2)生化特性：
82.表1菌株ht4生理生化特性
–
酶活、碳源氧化
[0083][0084][0085]
：阳性反应；-：阴性反应；
[0086]
表2菌株ht4生理生化特性
–
利用碳源产酸
[0087]
试剂条对应管/底物检测结果试剂条对应管/底物检测结果0对照-25七叶灵 1甘油-26柳醇 2赤癣醇-27纤维二糖 3d-阿拉伯糖-28麦芽糖-4l-阿拉伯糖-29乳糖 5核糖 30蜜二糖-6d-木糖-31蔗糖 7l-木糖-32海藻糖 8阿东醇-33菊糖-9β-甲基-d-木糖甙-34松叁糖 10半乳糖 35棉子糖-11葡萄糖 36淀粉-12果糖 37糖原-13甘露糖 38木糖醇-14山梨糖 39拢牛儿糖 15鼠李糖-40d-松二糖-16卫茅醇-41d-来苏糖-17肌醇-42d-塔格糖 18甘露醇 43d-岩糖-19山梨醇 44l-岩糖 20α-甲基-d-甘露糖甙-45d-阿拉伯糖醇-21α-甲基-d-葡萄糖甙-46l-阿拉伯糖醇-22n-乙酰-葡糖胺 47葡萄糖酸盐 23苦杏仁甙-48 2-酮基-葡萄糖酸盐-24熊果甙 49 5-酮基-葡萄糖酸盐-[0088]
：阳性反应；-：阴性反应；
[0089]
(3)16s rrna序列分析和系统发育树的构建：
[0090]
鼠李糖乳杆菌菌株ht4的16s rrna基因序列，如seq id no.1所示；与从genbank中已知的核酸序列进行blast分析，挑选同源性较高的序列在cluster x软件完成序列比对，比对结束后使用mega 4.1软件构建系统发育树。
[0091]
鼠李糖乳杆菌菌株ht4基因序列测序结果：将菌株所扩增的16s rrna基因序列在ncbi通过blast进行同源性检索，结果检索出为乳杆菌属的16s rrna基因序列，采用邻接法构建菌株分子发育树，分离菌株在系统发育树上与鼠李糖乳杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus jcm1136(登录号：balt01000058)属同一支(见图1)。结合形态学和生理生化特征将所分离菌株鉴定为鼠李糖乳杆菌。
[0092]
实施例3：鼠李糖乳杆菌ht4对水产致病菌抑菌能力、亚硝酸盐降解能力及产l-乳酸能力的测定
[0093]
(1)鼠李糖乳杆菌ht4对水产致病菌抑菌能力的测定
[0094]
将致病菌与鼠李糖乳杆菌ht4菌液共同接入lb培养基中，30℃静置培养48h，于0h、24h、48h取样计数，观察鼠李糖乳杆菌ht4对致病菌的拮抗作用。测定结果如表3所示：
[0095]
表3鼠李糖乳杆菌ht4与致病菌的共培养测定结果(cfu/ml)
[0096][0097]
在共培养条件下，鼠李糖乳杆菌ht4对维氏气单胞菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、鳗利斯顿氏菌抑制能力强，在23h完全抑制了维氏气单胞菌、溶藻弧菌的生长，在46h时嗜水气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、豚鼠气单胞菌的生长也被完全抑制；对副溶血性弧菌、爱德华氏菌的抑制能力较弱，23h时几乎无抑制作用，46h时使致病菌的增殖减少了一个数量级。
[0098]
(2)鼠李糖乳杆菌ht4降解亚硝酸盐能力的测定
[0099]
mrs肉汤培养基中分别添加2mol/l亚硝酸钠0.1ml、0.2ml、0.3ml，分装50ml/试管，121℃灭菌15min，接种活化后的鼠李糖乳杆菌ht4菌悬液5ml，使起始菌浓为4.5
×
107cfu/ml，对照组接入5ml无菌蒸馏水，每组3个平行，35℃静置培养24h，其中0h、5h和24h取样，4000r/min离心10min，取上清液，用美国哈希试剂检测亚硝氮浓度。数据用spss18.0统计分析，全部结果均用平均值
±
标准误表示，duncan’s多重比较检验各组间的差异。
[0100]
表4结果显示鼠李糖乳杆菌ht4的亚硝酸盐还原酶活性高，能够耐受亚硝酸盐浓度高达300mg/l以上，在厌氧条件下，能够显著降解亚硝氮，24h内降解极其显著，最高降解率达到97.04
±
0.1％。
[0101]
表4鼠李糖乳杆菌ht4降解亚硝氮能力
[0102][0103]
注：同行不同小写字母表示差异显著(p《0.05),同列不同大写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0104]
(3)鼠李糖乳杆菌ht4发酵产l-乳酸能力的测定
[0105]
鼠李糖乳杆菌ht4静置厌氧同型发酵产l-乳酸的测定：将鼠李糖乳杆菌ht4接入下述培养基中，培养基组成以g/ml计为：大米10％ 1％米糠混合糖化液，豆粕酶解液3％，酵母膏0.15％，番茄汁3％，ph6.8，接种后分次添加碳酸钙5％～10％。培养条件：培养温度35～45℃,静置厌氧发酵培养，培养时间24～72h。
[0106]
l-乳酸检测：将发酵液先加热至80～100℃，然后于4000r/min离心5min，取上清液用l-乳酸脱氢酶法测定或以此方法为原理的sba-40c生物传感分析仪(山东科学院生物研究所研制)测l-乳酸含量，测得l-乳酸含量达60g/l，糖酸转化率85％以上。
[0107]
实施例4：鼠李糖乳杆菌ht4活菌制剂的制备
[0108]
(1)菌种活化：无菌开启鼠李糖乳杆菌ht4的冻干保藏菌种，接种于装有mrs肉汤9ml的试管中，于35℃静置培养40h，然后转接于装有90ml mrs肉汤三角瓶中，装液量为体积比90％，35℃静置培养24h，之后按5％接种量活化扩培2次，镜检，培养液检测采用mrs平板36
±
1℃厌氧培养48h后，计数活菌体浓度为108～109cfu/ml，作为种子液转接固定化发酵培养；
[0109]
mrs肉汤培养基组成以g/l计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，ph 5.7
±
0.2；
[0110]
(2)固定化发酵培养：
[0111]
三角瓶种子培养液制备：将上述所得活化种子液以体积比5％接种量接入装有固定化发酵培养基的3个5l三角瓶，装液量为体积比90％，于35℃静置培养24h，mrs平板计数，当菌体浓度达到108～109cfu/ml时，作为固定化培养种子液，接入普通好氧发酵罐中进行一级、二级固定化发酵逐级放大扩培，固定化培养种子液接入200l发酵罐，再接入2000l发酵罐，发酵罐间移种以无菌空气压送方式完成接种。
[0112]
一级固定化发酵培养：将上述三角瓶种子液以体积比5％接种量接入装有固定化发酵培养基的200l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比80％，无菌空气保持罐压至0.02mpa，间隔8h搅拌5min，搅拌转速50r/min，35℃培养24h，ph为4.8时,得到一级固定化培养液，其中鼠李糖乳杆菌ht4菌体被吸附固定在海藻酸钙 二氧化硅形成的凝胶小颗粒中。将培养液用与2mol/ml柠檬酸溶液按体积比1：9混合，20min室温间歇震荡溶解凝胶颗粒，然后采用
mrs平板36
±
1℃厌氧培养48h后，计数活菌体浓度≥5
×
109cfu/ml；
[0113]
三角瓶种子培养基及一级固定化发酵培养基组成以g/l计：蛋白胨10，酵母膏4，葡萄糖25，吐温-80 0.5，磷酸氢二钾3，柠檬酸三铵0，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.01,碳酸钙20，海藻酸钠4，二氧化硅2，以自来水定容配制，ph 6.3，121℃30min灭菌；
[0114]
二级固定化发酵培养：将一级固定化培养液作为种子液以体积比10％接种量用无菌空气移送接入2000l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比80％，无菌空气保持罐压至0.02mpa，间隔8h搅拌5min，转速80r/min，35℃培养28h，当发酵液ph降至4.6时，培养结束，得到二级固定化培养液，其中鼠李糖乳杆菌ht4菌体被吸附固定在海藻酸钙 二氧化硅形成的凝胶小颗粒中。将培养液用与2mol/ml柠檬酸溶液按体积比1：9混合，20min室温间歇震荡溶解凝胶颗粒，然后采用mrs平板36
±
1℃厌氧培养48h后，计数活菌体浓度为≥5
×
109cfu/ml。
[0115]
二级固定化发酵培养基组成以g/l计：蛋白胨10，酵母膏4，葡萄糖25，磷酸氢二钾3，柠檬酸三铵0.5，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，碳酸钙20，海藻酸钠2.5，二氧化硅2，以自来水定容配制，ph 6.5，121℃灭菌30min；
[0116]
(3)鼠李糖乳杆菌ht4菌粉和水剂的制备：
[0117]
鼠李糖乳杆菌ht4菌粉的制备：将步骤(2)所得发酵液经6000～10000r/min离心收集湿菌体，湿菌体与脱脂奶粉及淀粉按质量比湿菌体：脱脂奶粉：淀粉＝1:0.1:2～5进行混合，经20～40℃真空干燥24～48h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，得到鼠李糖乳杆菌ht4菌粉，菌粉中ht4菌浓度为不低于1.0
×
10
10
cfu/ml；
[0118]
鼠李糖乳杆菌ht4水剂的制备：将步骤(2)所得二级发酵液进行灌装，即获得的ht4水剂，水剂中ht4菌浓为6.5
×
109cfu/ml。
[0119]
实施例5：枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15及酿酒酵母cicc1421菌粉的制备
[0120]
(a)菌种活化及种子制备：无菌开启枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15及酿酒酵母cicc1421冻干管保藏菌种，分别接种于装有麸皮营养琼脂、mrs肉汤的试管及麦芽汁琼脂斜面试管，枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15于35℃静置培养48h，酿酒酵母于29℃培养62h。然后，将乳酸肠球菌jlb-15转接于mrs肉汤三角瓶，枯草芽孢杆菌ab90008-15转接于麸皮营养琼脂斜面，酿酒酵母cicc1421转接于麦芽汁琼脂斜面；乳酸肠球菌和枯草芽孢杆菌35℃培养24h，酵母菌29℃培养48h，反复活化2～3次，镜检，平板计数。当乳酸肠球菌菌体浓度﹥108cfu/ml，作为乳酸肠球菌种子液；枯草芽孢杆菌90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，刮取菌苔，用无菌水制备菌悬液作为枯草芽孢杆菌种子液；从酵母菌麦芽汁琼脂斜面上刮取菌苔，转接装有摇瓶种子培养基的三角瓶，体积装量40％，180r/min，于29℃培养24h，培养液用次甲基蓝染色液染色后，用血球计数板计数酵母，酵母菌菌体浓度＞108cfu/ml，作为酵母菌种子液；
[0121]
mrs肉汤培养基组成以g/l计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，ph 5.7
±
0.2；
[0122]
麸皮营养琼脂斜面培养基组成以g/l计：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl 5,麸皮10，琼脂15-20，以蒸馏水定容配制，ph 7.0-7.2；
[0123]
麦芽汁琼脂培养基组成：10
°
bx麦芽汁1000ml，蒸馏水配制，琼脂20g/l
[0124]
酵母摇瓶种子培养基组成以g/l计：酵母培养基：葡萄糖40，磷酸二氢钾2，蛋白胨10，七水硫酸镁0.3，尿素0.1，酵母膏0，硫酸铁0.1，蒸馏水定容配制，ph自然。
[0125]
(b)发酵培养：
[0126]
i、枯草芽孢杆菌发酵培养
[0127]
将步骤(a)所得枯草芽孢杆菌种子菌悬液以体积比1％接种量接入装有发酵培养基的200l发酵罐中进行一级种子罐培养，种子罐装液量为体积比50％～60％，通气量5m3/h，罐压0.1mpa转速为100r/min，35℃培养24h后，获得一级种子罐培养液；然后将种子罐培养液以体积比10％接种量，转接2000l发酵罐中进行二级发酵罐培养，发酵罐装液量为体积比50％～60％，通气量50m3/h，罐压0.1mpa，转速为100r/min，35℃培养24h，得到发酵液；
[0128]
发酵培养基组成以g/l计：麸皮20，以自来水定容配制，ph 7.0。
[0129]
ii、乳酸肠球菌发酵培养：
[0130]
一级种子罐培养：将步骤(a)所得乳酸肠球菌种子液以体积比5％接种量接入装有一级发酵培养基的200l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％，通气量2m3/h，罐压0.05mpa，60r/min搅拌，35℃培养40h，得到一级种子培养液；
[0131]
一级种子罐培养基组成以g/l计：蛋白胨15，酵母膏4，葡萄糖30，吐温-80 1，柠檬酸三铵2，碳酸钙10，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，七水硫酸镁0.2。以自来水定容配制，ph6.0
±
0.2；
[0132]
二级发酵罐培养：将一级培养发酵液作为种子液以体积比10％接种量接入装有二级发酵培养基的2000l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％，通气量30m3/h，罐压0.05mpa，60r/min搅拌，35℃培养24h，得到发酵液；
[0133]
二级发酵罐培养基组成以g/l计：蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖20，碳酸钙5，以自来水定容配制，ph7.0。
[0134]
iii、酵母菌发酵培养
[0135]
一级种子罐培养：将步骤(a)所得酵母菌种子液以体积比1％接种量接入装有一级发酵培养基的200l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比65％，通气量4m3/h，罐压0.05mpa，转速为80r/min，29℃培养24h，得到一级种子罐培养液；
[0136]
二级发酵罐培养：将一级种子罐培养液作为种子液，以体积比10％接种量，接入装有二级发酵培养基的2000l发酵罐中，发酵罐装液量为体积比65％，通气量40m3/h，罐压0.05mpa，转速为80r/min，29℃培养24h，得到发酵液；
[0137]
酵母发酵培养基组成以g/l计：葡萄糖50，磷酸二氢钾20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.3，以自来水定容配制，ph自然。
[0138]
(c)乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌菌粉制备
[0139]
将步骤(b)所得乳酸肠球菌jlb-15、枯草芽孢杆菌ab90008-15及酵母菌cicc1421的发酵液分别经6000～10000r/min离心收集湿菌体，乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌湿菌体分别与淀粉和碳酸钙按质量比1：0.5：0.5进行混合，然后分别在30～50℃真空干燥、粉碎机粉碎，过0.9mm筛，，分别获得乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌菌粉，乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌的菌浓度均不低于5.0
×
109cfu/g。
[0140]
实施例6：鼠李糖乳杆菌ht4单菌及复合菌剂发酵棉粕
[0141]
将实施例4中制备的鼠李糖乳杆菌ht4单菌菌粉与实施例5中制备的枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15及酵母菌cicc1421等菌粉，按鼠李糖乳杆菌：枯草芽孢杆菌：乳酸肠球菌：酵母菌＝1：0.5：0.1：0.1配制成鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂。将棉粕分装体积容量为5l的发酵袋(市售)，每个发酵袋中装1kg棉粕，将上述ht4单菌菌粉、复合菌剂按质量百分比0.5％分别与棉粕(产地新疆)混合，加水调节物料含水量40％，以不发酵的棉粕为对照，每组3个平行，在发酵袋中35℃密闭发酵3天，发酵结果如下表5，数据用spss18.0统计分析，全部结果均用平均值
±
标准误表示，duncan’s多重比较检验各组间的差异。
[0142]
表5鼠李糖乳杆菌ht4单菌菌粉及复合菌剂发酵棉粕的结果
[0143][0144][0145]
注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)
[0146]
上述结果显示：鼠李糖乳杆菌ht4单菌或复合菌剂发酵棉粕后，富含乳酸菌等益生菌，其中乳酸菌大量增殖，浓度高达109cfu/g，ht4复合菌发酵棉粕中芽孢杆菌和酵母菌浓度可达107cfu/g。鼠李糖乳杆菌ht4单菌及复合菌剂发酵棉粕过程中抑制了霉菌的生长，杜绝了棉粕加水后产生的霉变。鼠李糖乳杆菌ht4单菌或其复合菌发酵棉粕后均可改善棉粕的营养价值，ht4复合菌发酵棉粕的功效更为显著：ht4单菌和复合菌发酵棉粕后能够显著提高棉粕的酸溶蛋白和活性小肽含量(p＜0.05)，酸溶蛋白分别提高63.02％和127.33％，活性小肽分别提高51.18％和62.28％；对于棉粕中的植酸、单宁和游离棉酚等抗营养因子的去除，鼠李糖乳杆菌ht4单菌发酵和复合菌发酵均有不同程度的功效。ht4单菌发酵棉粕能够显著降低棉粕中的植酸和游离棉酚浓度(p＜0.05)，植酸下降28.44％，游离棉酚下降60.73％，ht4单菌发酵去除单宁的效果不显著(p＞0.05)；ht4复合菌剂发酵棉粕能够显著降低棉粕中植酸、单宁及游离棉酚等抗营养因子的浓度(p＜0.05)，去除率分别达到57.64％、59.57％和55.45％。综上所述，ht4鼠李糖乳杆菌单菌或复合菌发酵棉粕后，能够有效提高棉粕的饲料营养价值，从提升酸溶蛋白和活性小肽含量并同时降低植酸、单宁及棉酚等抗营养因子的角度来说，鼠李糖乳杆菌ht4与枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15、酿酒酵母cicc1421复配制成的ht4复合菌对发酵棉粕的效果比ht4单菌发酵更好。
[0147]
实施例7：鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵青虾饲料及其养殖青虾的结果(1)鼠李
糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵青虾饲料
[0148]
将实施例4中制备的鼠李糖乳杆菌ht4单菌菌粉与实施例5中制备的枯草芽孢杆菌ab90008-15、乳酸肠球菌jlb-15及酵母菌cicc1421等菌粉，按鼠李糖乳杆菌：枯草芽孢杆菌：乳酸肠球菌：酵母菌＝1：0.5：0.1：0.1配制成鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂。将此ht4复合菌剂按质量百分比0.5％与青虾饲料(配方见表7)混合，加水调节物料含水量25％，以不发酵的青虾饲料为对照，每个5l发酵袋(市售)中装料2kg，每组3个平行，在发酵袋中35℃密闭发酵5天，发酵结果如下表6，数据用spss18.0统计分析，全部结果均用平均值
±
标准误表示。对照组和发酵青虾饲料组用独立样本t检验进行显著性分析。
[0149]
表6结果显示，鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵青虾饲料后，青虾容易利用的可溶性蛋白、活性小肽等营养物质的含量显著提高。
[0150]
表6实施例7鼠李糖乳杆菌ht4复合菌发酵青虾饲料结果
[0151][0152][0153]
注：*表示两组差异显著(p＜0.05)
[0154]
(2)用鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵的青虾饲料进行养殖日本沼虾(俗称青虾)试验
[0155]
选取规格相近的日本沼虾(0.28g
±
0.05)共120尾，随机分成2组，即：对照组投喂常规饲料，试验组投喂75％青虾饲料 25％发酵青虾饲料，每组做3次重复，每个重复60尾日本沼虾，养殖于人工构建15个直径140cm，深100cm的圆柱体养殖缸中。每个养殖池中放一些假树叶，为虾生长创造优良环境。缸体放水至水深45cm，按照分组投放日本沼虾。
[0156]
养殖管理：每日根据饲料分组情况投喂相应的饲料，日投喂量为日本沼虾体重的2％(根据日本沼虾的摄食情况和生长情况调整投喂量，以投喂1h后吃完为宜)，每日投喂3次(8：00、12：00和18：00)，均为饱食投喂。养殖桶水位保持40
±
5cm，定期检测水质指标，保证试验期间溶氧≥6.0mg/l，ph为7.3
±
1.2，氨氮《0.2mg/l,亚硝酸盐《0.005mg/l。每天使用排污管进行排污，每周进行一次换水，保证良好的水质。每天观察日本沼虾的生长和摄食情况，发现死虾后及时捞起，称重并做好记录，养殖试验共进行56d。
[0157]
日本沼虾(青虾)配合饲料配方见下表，发酵青虾饲料的制备见本实施例(1)鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵青虾饲料。
[0158]
表7青虾饲料配方
[0159][0160][0161]
生长性能的测定：养殖试验结束后，记录青虾的起始重量(ibw)，末重量(fbw)，并计算出存活数率(sr)，增重率(wgr)，特定生产率(sgr)，饵料系数(fcr)。另外，选取9只单独测量体长和体重。
[0162]
增重率(wgr)＝100
×
(w
t-w0)/w0，
[0163]
特定生长率(sgr)＝100
×
(lnw
t-lnw0)/t，
[0164]
饵料系数(fcr)＝fi/(w
t-w0)
[0165]
存活率(sr)(％)＝末尾数/初始尾数*100％。
[0166]
其中w0为日本沼虾初始均重量g，w
t
为日本沼虾终末重量g，t为养殖天数，fi表示每只日本沼虾平均摄食饲料总量g。
[0167]
生长数据用spss18.0统计分析，全部结果均用平均值
±
标准误表示。对照组和发酵青虾饲料组用独立样本t检验进行显著性分析，结果如表8所示：
[0168]
表8鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵饲料饲喂日本沼虾56天后的生长效果
[0169]
指标对照组发酵青虾饲料试验组饵料系数3.67
±
0.053.29
±
0.14
*
增重率(％)493.29
±
7.72524.86
±
8.03
*
特定生长率(％/d)2.92
±
0.023.11
±
0.01
*
存活率(％)87.78
±
2.9492.22
±
1.47
[0170]
注：*表示两组差异显著(p＜0.05)
[0171]
通过本实施例的应用，发现在青虾饲料中添加25％鼠李糖乳杆菌ht4复合菌剂发酵青虾饲料，可以显著促进日本沼虾(青虾)的增重率、特定生长率，并且显著降低饲料系数，减少饲料投入成本，提高养殖经济效益。
[0172]
实施例8：鼠李糖乳杆菌ht4固定化菌球对青鱼池塘水中亚硝酸盐的持续降解
[0173]
养殖水体中亚硝酸盐浓度超标对水产养殖动物危害很大，在水体缺氧情况下，亚硝酸盐的蓄积对水产动物十分不利。因此，本实施例模拟养殖水体底部缺氧环境，考察鼠李糖乳杆菌ht4固定化菌球对池塘泥水中亚硝酸盐的降解能力。
[0174]
(1)固定化鼠李糖乳杆菌培菌球的制备
[0175]
按实施例4中(1)进行菌种活化后，10％(v/v)接种量转接于装有1000ml mrs肉汤培养基的三角瓶中(装液量为体积比90％)，35℃静置培养20h，添加质量体积比0.1％的二氧化硅混匀浸泡1h，添加质量体积比2.5％海藻酸钠混匀，将中空石英球(市售)在混合液中中浸润吸附1h后取出,再浸泡在3％氯化钙溶液8℃冰箱中固化交联18h，即获得固定化鼠李糖乳杆菌ht4培菌球，其中菌浓为5
×
108cfu/g,用灭菌的去离子水滤洗后备用。
[0176]
(2)鼠李糖乳杆菌ht4固定化菌球对青鱼池塘泥水中亚硝酸盐的持续降解
[0177]
2021.9.22日，在无锡市锡山区鹅湖镇青鱼养殖池塘采集池塘水和底泥，底泥含水量66％，每kg底泥加10l池塘水，混合泥水获得泥水混合液，在500ml三角瓶中分装400ml，加胶塞，121℃灭菌30min。实验分3组，每组3个平行，对照组不接菌，试验组1接入上述步骤(1)制备获得的鼠李糖乳杆菌ht4固定化培菌球10粒/瓶，试验组2接入鼠李糖乳杆菌ht4菌液(未固定化的鼠李糖乳杆菌ht4游离菌)，终浓度均为107cfu/ml。为了考察鼠李糖乳杆菌ht4在缺氧环境下对亚硝酸盐(亚硝氮)的持续降解能力，各实验组分别在起始第0天、第4天无菌添加1.05mg/l和3.875mg/l亚硝酸钠，静置不通气，模拟池塘底部缺氧环境，在室温26～28℃连续观察32天，在0、2、4、8、12、18、25、32天取样，每次取水样10ml，4000r/min离心，取上清液，，采用美国哈希试剂测定亚硝酸盐浓度。数据处理采用spss(ver.18.0)软件duncan’s多重比较检验各组间的差异，p《0.05表示差异显著。全部结果均用平均值
±
标准误表示。
[0178]
表9鼠李糖乳杆菌ht4对青鱼池塘水中亚硝酸盐的降解
[0179][0180]
注：同列不同大写字母表示差异显著(p《0.05)，同行不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0181]
表9结果显示，在缺氧条件下，亚硝酸盐在无菌的泥水中稳定不降解，鼠李糖乳杆菌ht4则具有亚硝酸盐还原酶活性(实施例3中(2)鼠李糖乳杆菌ht4降解亚硝酸盐能力的测定)，对青鱼塘泥水中的亚硝酸盐同样具有降解能力，在第2～4天内固定化菌球与游离菌对亚硝酸盐的降解差异不显著，降解率分别为86.58％～89.11％和86.57％～88.97％，降解速度分别为0.566～0.291mg/l/d和0.577～0.297mg/l/d。在第4天补充亚硝酸盐后，第4～8天内固定化菌球对亚硝酸盐降解率为69.89％，降解速度为0.698mg/l/d，而游离菌对亚硝酸盐的降解率则为6.7％，降解速度为0.068mg/l/d差异极其显著(p＜0.05)。第8～25天内，固定化的鼠李糖乳杆菌菌球中菌体继续保持亚硝酸盐降解能力，第12、18、25和32天的降解率分别为71.76％、53.61％、60.55％，第25～32天内虽然降解率为33.72％，但亚硝酸盐浓度差异不显著(p＞0.05)，从降解速度来看，第8、12、18、25和32天的降解速度分别为0.698mg/l/d、0.183mg/l/d、0.042mg/l/d、0.018mg/l/d和0.004mg/l/d，第8～25天内固定化菌球对亚硝酸盐的降解速度是逐步显著下降；而游离菌组第8～32天内亚硝酸盐没有进一步降解，菌体失去活性。上述结果显示，在缺氧条件下，青鱼泥水环境中，游离状态的鼠李糖乳杆菌对亚硝酸盐的降解活性容易失活，活性仅能保持4～8天，石英中空材质 二氧化硅 海藻酸钠将鼠李糖乳杆菌吸附并固定在石英中空球内，对鼠李糖乳杆菌的亚硝酸盐降解活性具有良好保护作用，降解效果能够持续25天，不必中途补充添加菌剂，从而有利于降低养殖使用成本。