一种高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺的制作方法

1.本发明涉及大豆磷脂技术领域，特别涉及一种高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺。


背景技术：

2.大豆磷脂是从大豆中提取的产物，是由甘油、脂肪酸、胆碱或胆胺所组成的酯，能溶于油脂及非极性溶剂。大豆磷脂的组成成分复杂，主要含有卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂等。大豆磷脂不仅具有较强的乳化、润湿、分散作用，还在促进体内脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤等方面发挥很重要的作用。为了更好地将大豆磷脂从大豆中提取出来，现有的工艺会采用溶剂萃取法或超临界流体萃取法，但这些方法得到的大豆磷脂的活性和亲水性都较低。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提出一种高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺，旨在解决现有技术得到的大豆磷脂的活性和亲水性都较低的问题。
4.为实现上述目的，本发明提出一种高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺，包括以下步骤：
5.向大豆油脚中加入软化水，搅拌后离心，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂；
6.将所述增活大豆磷脂溶于无水乙醇，加入氯化锌水溶液，离心后取沉淀，用乙醇水溶液去除沉淀中的氯化锌，得到纯化卵磷脂；
7.将所述纯化卵磷脂加入氯化钙水溶液中，再加入磷脂酶a2，酶解后分离出磷脂，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
8.可选地，所述向大豆油脚中加入软化水，搅拌后离心，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂的步骤中，所述离心的离心力为500～1000g。
9.可选地，所述向大豆油脚中加入软化水，搅拌后离心，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂的步骤中，所述离心的时间为2～4h。
10.可选地，所述向大豆油脚中加入软化水，搅拌后离心，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂的步骤中，每300g所述大豆油脚加入220～250ml所述软化水。
11.可选地，所述将所述增活大豆磷脂溶于无水乙醇，加入氯化锌水溶液，离心后取沉淀，用乙醇水溶液去除沉淀中的氯化锌，得到纯化卵磷脂的步骤中，每20g所述活性磷脂加入280～300ml所述无水乙醇。
12.可选地，所述氯化锌水溶液中，氯化锌的体积浓度为40～50％。
13.可选地，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积浓度为20～30％。
14.可选地，所述将所述纯化卵磷脂加入氯化钙水溶液中，再加入磷脂酶a2，酶解后分离出磷脂，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂的步骤中，每20g所述纯化卵磷脂加入60～
80ml所述氯化钙水溶液。
15.可选地，所述氯化钙水溶液中，氯化钙的浓度为0.3～0.5mmol/l。
16.可选地，所述将所述纯化卵磷脂加入氯化钙水溶液中，再加入磷脂酶a2，酶解后分离出磷脂，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂的步骤中，所述纯化卵磷脂和所述磷脂酶a2的质量之比为1：(0.002～0.004)。
17.本发明的技术方案中，首先是通过大豆油脚与软化水反应，分离出大豆磷脂中的非活性磷脂，而由于非活性磷脂相比活性磷脂表面活性更低，通过非活性磷脂的去除，提高了增活大豆磷脂的活性；而后，通过增活大豆磷脂与氯化锌的结合以提高卵磷脂的纯度，使得纯化卵磷脂的卵磷脂纯度更高，进一步提高产品活性；最后，加入磷脂酶a2对纯化卵磷脂进行酶改性，通过磷脂酶a2提高纯化卵磷脂的亲水性，最终得到的高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1为本发明提出的高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺的一实施例的流程示意图。
20.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
21.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
22.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.大豆磷脂是从大豆中提取的产物，是由甘油、脂肪酸、胆碱或胆胺所组成的酯，能溶于油脂及非极性溶剂。大豆磷脂的组成成分复杂，主要含有卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂等。大豆磷脂不仅具有较强的乳化、润湿、分散作用，还在促进体内脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤等方面发挥很重要的作用。为了更好地将大豆磷脂从大豆中提取出来，现有的工艺会采用溶剂萃取法或超临界流体萃取法，但这些方法得到的大豆磷脂的活性和亲水性都较低。
24.鉴于此，本发明提出一种高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺。图1为本发明高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺的一实施例。
25.请参照图1，在本发明实施例中，所述高亲水性高活性酶解大豆磷脂的提取工艺包括以下步骤：
26.步骤s10、向大豆油脚中加入软化水，搅拌后离心，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂。
27.大豆油脚一般包括大豆磷脂、油脂和胶体杂质，而大豆磷脂又包含能够与软化水结合成水化磷脂的活性磷脂和以钙镁盐形式存在的非活性磷脂。于是，向大豆油脚中加入软化水，离心后会发生分层，下层是活性磷脂与软化水形成的液晶态液体，中层是水，上层是油脂、胶体杂质和非活性磷脂。之后，将下层液晶态液体干燥脱水，即可得到去除了非活性磷脂的大豆磷脂，也即增活大豆磷脂。而由于非活性磷脂相比活性磷脂表面活性更低，通过非活性磷脂的去除，提高了增活大豆磷脂的活性。
28.其中，纯化水是指温度大于25℃时，电阻率大于0.1x10^6ω*cm的水。
29.其中，每300g所述大豆油脚加入220～250ml所述软化水。大豆油脚中大豆磷脂的含量在40％左右，相对于大豆磷脂中活性磷脂需要结合的软化水量，在上述用量比值下的软化水量是过量的，使得活性磷脂被充分结合。
30.步骤s10中采用了离心的方式使各组分沉降以实现分层，相对于自然沉降，离心沉降的方式效率更高，能够更快地实现分层。进一步地，步骤s10中，所述离心的离心力为500～1000g。当离心力小于500g，未完全分层；当当离心力大于1000g，会使离心带来较大噪声。
31.步骤s10中，所述离心的时间为2～4h。时间优选为2～4h，有效提高活性磷脂与软化水结合生成水化磷脂的产率，且使分层更彻底。若时间小于2h，水化磷脂的产率低，也即下层液晶态液体的层厚较小；若时间大于4h，占用设备时间太长，影响效率和产能，增加成本。
32.步骤s20、将所述增活大豆磷脂溶于无水乙醇，加入氯化锌水溶液，离心后取沉淀，用乙醇水溶液去除沉淀中的氯化锌，得到纯化卵磷脂。
33.卵磷脂与氯化锌可生成沉淀，而后去除沉淀中的氯化锌，即可得到卵磷脂纯度较高的纯化卵磷脂。
34.步骤s20中，用乙醇水溶液去除沉淀中的氯化锌时，可按照以下步骤进行：将沉淀溶于氯仿，用乙醇水溶液萃取去除氯化锌，有机层蒸去除氯仿，再用乙醚、丙酮清洗沉淀多次，蒸去乙醚，得到纯化卵磷脂。
35.步骤s20中，每20g所述活性磷脂加入280～300ml所述无水乙醇。当大于上述用量比时，活性磷脂不易完全溶解，当小于上述用量比时，无水乙醇过量，浪费原料。
36.进一步，所述氯化锌水溶液中，氯化锌的体积浓度为40～50％。在该体积浓度下，得到纯化卵磷脂的卵磷脂纯度更高。
37.此外，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积浓度为20～30％。在该体积浓度下，得到纯化卵磷脂的卵磷脂纯度更高。
38.步骤s30、将所述纯化卵磷脂加入氯化钙水溶液中，再加入磷脂酶a2，酶解后分离出磷脂，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
39.磷脂酶a2是一种三酰甘油水解酶，具有位置专一性，水解磷脂的sn-2位酰基，生成
溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶a2来源方便，成本低廉。通过将纯化卵磷脂与磷脂酶a2反应，能够实现对卵磷脂的酶改性，从而提高卵磷脂的亲水性。
40.步骤s30中，分离出磷脂时，按照以下步骤进行：收集酶解产物，向所述酶解产物加入丙酮，搅拌后过滤，将过滤得到的固体溶于三氯甲烷，再加入甲醇，搅拌，过滤，得到滤液，将所述滤液浓缩，然后依次用三氯甲烷、甲醇和水洗脱，收集洗脱液，浓缩去除有机溶剂，真空干燥，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
41.步骤s30中，每20g所述纯化卵磷脂加入60～80ml所述氯化钙水溶液。氯化钙水溶液中的钙离子能够激活磷脂酶a2，使磷脂酶a2更有效地与卵磷脂反应。本发明实施例中优选纯化卵磷脂和氯化钙水溶液的用量比在上述比值下，使得卵磷脂充分溶解于氯化钙水溶液中，保证磷脂酶a2的改性效果。
42.进一步地，所述氯化钙水溶液中，氯化钙的浓度为0.3～0.5mmol/l。当浓度小于0.3mmol/l时，钙离子浓度不足以充分激活磷脂酶a2；当浓度大于0.3mmol/l时，氯化钙过量，提高了后续去除的难度，降低了磷脂的提取效率。
43.步骤s30中，所述纯化卵磷脂和所述磷脂酶a2的质量之比为1：(0.002～0.004)。在上述质量之比之下，保证卵磷脂被充分改性。
44.本发明的技术方案中，首先是通过大豆油脚与软化水反应，分离出大豆磷脂中的非活性磷脂，而由于非活性磷脂相比活性磷脂表面活性更低，通过非活性磷脂的去除，提高了增活大豆磷脂的活性；而后，通过增活大豆磷脂与氯化锌的结合以提高卵磷脂的纯度，使得纯化卵磷脂的卵磷脂纯度更高，进一步提高产品活性；最后，加入磷脂酶a2对纯化卵磷脂进行酶改性，通过磷脂酶a2提高纯化卵磷脂的亲水性，最终得到的高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
45.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
46.实施例1
47.(1)向300g大豆油脚中加入235ml软化水，搅拌后离心(离心力740g，时间为4h)，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂。
48.(2)将20g所述增活大豆磷脂溶于300ml无水乙醇，加入氯化锌水溶液(氯化锌的体积浓度为50％)，离心后取沉淀，将沉淀溶于氯仿，用乙醇水溶液(乙醇的体积浓度为30％)萃取去除氯化锌，有机层蒸去除氯仿，再用乙醚、丙酮清洗沉淀多次，蒸去乙醚，得到纯化卵磷脂。
49.(3)将20g所述纯化卵磷脂加入60ml氯化钙水溶液(氯化钙的浓度为0.4mmol/l)中，再加入0.06g磷脂酶a2，收集酶解产物，向所述酶解产物加入丙酮，搅拌后过滤，将过滤得到的固体溶于三氯甲烷，再加入甲醇，搅拌，过滤，得到滤液，将所述滤液浓缩，然后依次用三氯甲烷、甲醇和水洗脱，收集洗脱液，浓缩去除有机溶剂，真空干燥，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
50.实施例2
51.(1)向300g大豆油脚中加入234ml软化水，搅拌后离心(离心力760g，时间为2h)，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂。
52.(2)将20g所述增活大豆磷脂溶于285ml无水乙醇，加入氯化锌水溶液(氯化锌的体
积浓度为46％)，离心后取沉淀，将沉淀溶于氯仿，用乙醇水溶液(乙醇的体积浓度为25％)萃取去除氯化锌，有机层蒸去除氯仿，再用乙醚、丙酮清洗沉淀多次，蒸去乙醚，得到纯化卵磷脂。
53.(3)将20g所述纯化卵磷脂加入70ml氯化钙水溶液(氯化钙的浓度为0.3mmol/l)中，再加入0.04g磷脂酶a2，收集酶解产物，向所述酶解产物加入丙酮，搅拌后过滤，将过滤得到的固体溶于三氯甲烷，再加入甲醇，搅拌，过滤，得到滤液，将所述滤液浓缩，然后依次用三氯甲烷、甲醇和水洗脱，收集洗脱液，浓缩去除有机溶剂，真空干燥，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
54.实施例3
55.(1)向300g大豆油脚中加入236ml软化水，搅拌后离心(离心力500g，时间为3h)，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂。
56.(2)将20g所述增活大豆磷脂溶于295ml无水乙醇，加入氯化锌水溶液(氯化锌的体积浓度为45％)，离心后取沉淀，将沉淀溶于氯仿，用乙醇水溶液(乙醇的体积浓度为24％)萃取去除氯化锌，有机层蒸去除氯仿，再用乙醚、丙酮清洗沉淀多次，蒸去乙醚，得到纯化卵磷脂。
57.(3)将20g所述纯化卵磷脂加入71ml氯化钙水溶液(氯化钙的浓度为0.5mmol/l)中，再加入0.08g磷脂酶a2，收集酶解产物，向所述酶解产物加入丙酮，搅拌后过滤，将过滤得到的固体溶于三氯甲烷，再加入甲醇，搅拌，过滤，得到滤液，将所述滤液浓缩，然后依次用三氯甲烷、甲醇和水洗脱，收集洗脱液，浓缩去除有机溶剂，真空干燥，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
58.实施例4
59.(1)向300g大豆油脚中加入220ml软化水，搅拌后离心(离心力1000g，时间为3.2h)，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂。
60.(2)将20g所述增活大豆磷脂溶于290ml无水乙醇，加入氯化锌水溶液(氯化锌的体积浓度为44％)，离心后取沉淀，将沉淀溶于氯仿，用乙醇水溶液(乙醇的体积浓度为23％)萃取去除氯化锌，有机层蒸去除氯仿，再用乙醚、丙酮清洗沉淀多次，蒸去乙醚，得到纯化卵磷脂。
61.(3)将20g所述纯化卵磷脂加入73ml氯化钙水溶液(氯化钙的浓度为0.45mmol/l)中，再加入0.07g磷脂酶a2，收集酶解产物，向所述酶解产物加入丙酮，搅拌后过滤，将过滤得到的固体溶于三氯甲烷，再加入甲醇，搅拌，过滤，得到滤液，将所述滤液浓缩，然后依次用三氯甲烷、甲醇和水洗脱，收集洗脱液，浓缩去除有机溶剂，真空干燥，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
62.实施例5
63.(1)向300g大豆油脚中加入250ml软化水，搅拌后离心(离心力750g，时间为2.8h)，取下层液晶态液体，干燥脱水，得到增活大豆磷脂。
64.(2)将20g所述增活大豆磷脂溶于280ml无水乙醇，加入氯化锌水溶液(氯化锌的体积浓度为40％)，离心后取沉淀，将沉淀溶于氯仿，用乙醇水溶液(乙醇的体积浓度为20％)萃取去除氯化锌，有机层蒸去除氯仿，再用乙醚、丙酮清洗沉淀多次，蒸去乙醚，得到纯化卵磷脂。
65.(3)将20g所述纯化卵磷脂加入80ml氯化钙水溶液(氯化钙的浓度为0.35mmol/l)中，再加入0.05g磷脂酶a2，收集酶解产物，向所述酶解产物加入丙酮，搅拌后过滤，将过滤得到的固体溶于三氯甲烷，再加入甲醇，搅拌，过滤，得到滤液，将所述滤液浓缩，然后依次用三氯甲烷、甲醇和水洗脱，收集洗脱液，浓缩去除有机溶剂，真空干燥，得到高亲水性高活性酶解大豆磷脂。
66.测得实施例1-5得到的高亲水性高活性酶解大豆磷脂的丙酮不溶物含量，结果见于表1。
67.表1实施例1-5的丙酮不溶物含量
[0068] 丙酮不溶物含量(％)实施例197实施例298实施例396实施例499实施例598gb30607-2014≥50
[0069]
由表1可知，实施例1-5的高亲水性高活性酶解大豆磷脂具有较高的丙酮不溶物含量，说明通过本发明实施例提供的高亲水性高活性酶解大豆磷脂的的提取工艺能够提高产物大豆磷脂中的磷脂含量，也即提高大豆磷脂的活性，获得高活性的大豆磷脂；此外，本发明实施例提供的高亲水性高活性酶解大豆磷脂的的提取工艺中又增加了磷脂酶a2酶改性的步骤，有效对大豆磷脂进行了酶改性，以提高其亲水性，最后获得高亲水性高活性的酶解大豆磷脂。
[0070]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。