一种用于胰腺癌早期诊断的生物标志物及应用

1.本发明涉及肿瘤早期诊断与鉴别技术领域，具体涉及一种用于胰腺癌早期诊断的生物标志物及应用。


背景技术：

2.胰腺癌是全世界最致命的癌症之一，总体5年生存率不到10％。预计到2030年将成为癌症死亡的第二大原因。手术是治愈胰腺癌患者的唯一方法，但由于发病早期缺乏特异性症状，导致约80％的胰腺癌患者在就诊时已处于局部进展或者远处转移阶段，失去了手术机会。因此，早期诊断胰腺癌是改善预后最有效的方法之一。
3.目前常用的胰腺癌诊断检查方法包括糖类抗原19-9(ca19-9)、腹部影像学检查以及内镜超声引导下细针穿刺活检(eus-fna)等。但这些方法都存在一定的缺陷。ca19-9是唯一被美国食品药品管理局批准用于胰腺癌诊断的血液学检测标志物。然而，ca19-9对胰腺癌的诊断不够准确，因为10％的人群是lewis抗原阴性的，不能表达ca19-9。此外，其他疾病，如胆道梗阻和其他胃肠道肿瘤，也可使ca19-9水平升高，导致误诊。腹部影像学检查中，ct在判断胰腺癌分期、预测手术切除率方面具有一定的优越性,但对直径小于1cm的胰腺癌、淋巴结浸润转移和肝内小转移灶等的准确性不足。mri在诊断肝内转移灶方面优于ct,但由于价格较高、检查费时，不适用于常规早期筛查。eus-fna可作为胰腺癌诊断的金标准，但其属于侵入性操作，存在并发症发生的可能；另外，因为胰腺癌肿瘤间质成分较多，导致穿刺出现假阴性结果的概率较高。因此，寻找合适的胰腺癌早期诊断方法具有重要临床意义。
4.近年来，包括检测循环肿瘤细胞、cfdna和外泌体在内的液体活检已成为癌症诊断的一种新策略。液体活检在胰腺癌的诊断应用中已经进行了深入的研究，外泌体有望成为胰腺癌的生物标记物。外泌体是一种双膜微囊泡结构，几乎所有细胞均能分泌，广泛存在于各种体液中。外泌体中含有大量的rna、蛋白质等物质，其中mirna含量丰富，约占所有rna比例的70％，并且在双膜结构的保护下，稳定性更强，因此是理想的生物标志物。目前有关胰腺癌外泌体mirnas诊断标志物的研究取得一定的进展。例如，takuma goto等人检测发现与22例无胰腺肿瘤的患者相比，血清外泌体来源的mir-191，mir-21和mir-451a在32例胰腺癌和29例胰腺导管内乳头状粘液腺瘤中的表达明显升高；lai等人纳入6例正常人、29例胰腺癌患者以及8例慢性胰腺炎患者，高水平的血浆外泌体mir-10b、mir-21、mir-30c和mir-181a以及低水平的mir-let7a很容易将胰腺癌与正常对照和慢性胰腺炎样本区分开来；中国发明专利(申请号202010717595.8)提示患者血液外泌体mirna生物标志物hsa-mir-95-3p和hsa-mir-26b-5p可与血清中糖类抗原ca19-9结合，作为区分胰腺癌和胰腺炎的生物标志物。但这些研究都是小样本、单中心验证，缺乏大样本、多中心研究，所提供的mirna标志物仅能鉴别慢性胰腺炎和胰腺癌，并无法区分胰腺癌和胰腺其他肿瘤，并且特异性以及敏感性不高，导致其临床应用前景面临较大的不确定性。


技术实现要素：

5.有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种用于胰腺癌早期诊断的生物标志物及应用。利用大样本、多中心研究得到用于胰腺癌早期诊断的血浆外泌体mirnas标志物，血浆外泌体mirnas标志物在制备胰腺癌早期诊断的检测试剂或试剂盒中进行应用，可以用来区分胰腺癌与胰腺炎、胰腺其他肿瘤以及正常人，具有高特异性和高敏感性，并且血浆外泌体mirnas标志物与ca19-9结合后可进一步提升对胰腺癌的诊断与鉴别性能。
6.为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种用于胰腺癌早期诊断的生物标志物，所述生物标志物包括血浆外泌体mirnas标志物，所述血浆外泌体mirnas标志物包括mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069中的至少两种。
8.进一步的，所述血浆外泌体mirnas标志物包括mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069。
9.进一步的，所述生物标志物还包括血清中糖类抗原ca19-9。
10.第二方面，本发明提供上述生物标志物在制备胰腺癌早期诊断的检测试剂或试剂盒中的应用，所述检测试剂或试剂盒检测上述生物标志物的表达量。
11.进一步的，在上述应用中，所述检测试剂或试剂盒为血浆学检测试剂或试剂盒。
12.进一步的，在上述应用中，所述检测试剂或试剂盒包括检测生物标志物的探针或扩增生物标志物的引物。
13.进一步的，在上述应用中，所述检测试剂或试剂盒采用real-time rt-pcr方法检测生物标志物的表达量。
14.进一步的，在上述应用中，所述检测试剂或试剂盒检测生物标志物的表达量后，按照如下分类模型进行判断：
15.①
当鉴别胰腺癌与胰腺其他肿瘤时，
16.y＝-2.377 1.568
×
x
ca19-9
(-0.680)
×
lnx
mir-130a-3p
0.968
×
lnx
mir-21-5p
(-0.039)
×
lnx
mir-223-3p
(-1.454)
×
lnx
mir-7975
(-0.790)
×
lnx
mir-8069
1.371
×
lnx
mir-1228
。若y≥0.586，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为胰腺其他肿瘤；
17.②
当鉴别胰腺癌与慢性胰腺炎时，
18.y＝7.316 1.128
×
x
ca19-9
0.508
×
lnx
mir-130a-3p
0.107
×
lnx
mir-21-5p
(-1.001)
×
lnx
mir-223-3p
(-0.746)
×
lnx
mir-7975
(-0.074)
×
lnx
mir-8069
1.345
×
ln x
mir-1228
。若y≥0.408，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为慢性胰腺炎；
19.③
当鉴别胰腺癌与正常人时，y＝40.789 23.603
×
x
ca19-9
(-1.835)
×
lnx
mir-130a-3p
4.700
×
lnx
mir-21-5p
0.801lnx
mir-223-3p
0.659
×
lnx
mir-7975
0.530
×
lnx
mir-8069
3.132
×
ln x
mir-1228
。若y≥0.812，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为正常人；
20.④
当鉴别胰腺癌与其他所有人(胰腺其他肿瘤、慢性胰腺炎、正常人)时，y＝4.819 2.052
×
x
ca19-9
(-0.091)
×
lnx
mir-130a-3p
0.788
×
lnx
mir-21-5p
(-0.287)
×
lnx
mir-223-3p
(-0.592)
×
lnx
mir-7975
(-0.071)
×
lnx
mir-8069
1.008
×
ln x
mir-1228
。若y≥0.309，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为非胰腺癌；
21.当ca19-9≥34u/l时，x
ca19-9
＝1；当ca19-9＜34u/l时，x
ca19-9
＝0；
22.x
mir-130a-3p
、x
mir-21-5p
、x
mir-223-3p
、x
mir-7975
、x
mir-8069
、x
mir-1228
分别为样本血浆外泌体中
采用rt-qpcr检测mirna相对外参的表达量。
23.本发明的有益效果为：
24.本发明提供一种用于胰腺癌早期诊断的生物标志物及应用。利用大样本、多中心研究得到用于胰腺癌早期诊断的血浆外泌体mirnas标志物，血浆外泌体mirnas标志物在制备胰腺癌早期诊断的检测试剂或试剂盒中进行应用，可以用来区分胰腺癌与胰腺炎、胰腺其他肿瘤以及正常人，具有高特异性和高敏感性，并且血浆外泌体mirnas标志物与ca19-9结合后可进一步提升对胰腺癌的诊断与鉴别性能。
附图说明
25.图1为本发明实施例用于胰腺癌早期诊断的6个血浆外泌体mirnas筛选过程；
26.图2为mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069分别诊断区分胰腺癌与其他胰腺肿瘤、慢性胰腺炎、正常人的roc曲线；
27.图3为传统胰腺癌标志物ca19-9，mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069组成血浆外泌体mirnas联合诊断标志物，mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069组成血浆外泌体mirnas联合诊断标志物结合ca19-9诊断区分胰腺癌(pc)与其他胰腺肿瘤(opt)、慢性胰腺炎(cp)、正常人(nc)以及其他胰腺肿瘤慢性胰腺炎正常人的总体(opt&cp&nc)的roc曲线。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明实施例中mirnas检测所用taqman探针购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号如下：
30.mir-130a-3p：catalog number 4427975，assay id 000454
31.mir-1228：catalog number 4427975，assay id 002919
32.mir-21-5p：catalog number 4427975，assay id 000397
33.mir-223-3p：catalog number 4427975，assay id 002295
34.mir-7975：catalog number 4440886，assay id 466483_mat
35.mir-8069：catalog number 4398987，assay id cttz9eg
36.实施例1、本发明用于胰腺癌早期诊断的6个血浆外泌体mirnas筛选过程
37.发明人于三个胰腺中心(中国医学科学院北京协和医院、山东大学齐鲁医院、华华中科技大学同济医学院附属同济医院)采集的262例研究对象的外周血血浆样本分为三个队列：分为发现阶段、初步验证阶段和扩大验证阶段。发现阶段队列(n＝16)、初步验证阶段队列(n＝56)和扩大验证阶段队列(n＝190)。
38.如图1所示，首先利用exorneasy serum/plasma maxi kit(qiagen)从血浆样本中提取外泌体mirna，通过mirna芯片(agilent human mirna microarray v21.0，8*60k)检测外泌体mirnas的表达水平：使用lima包对原始数据进行归一化处理后，进行后续的分析。原
始数据经归一化后,采用fold-change(表达差异倍数)以及t检验(student's t-test)统计学方法对差异基因进行筛选，挑选条件如下：在胰腺癌与正常人两组间，变化量在2倍以上且检验结果p值≤0.05的mirnas；在胰腺癌与慢性胰腺炎两组间，变化量在1.5倍以上且检验结果p值≤0.05的mirnas。从发现队列(胰腺癌7例、慢性胰腺炎4例、正常人5例)中筛选得到差异表达的10个外泌体mirnas，其中4个mirnas在胰腺癌中下调，6个mirnas在胰腺癌中上调。接着，通过rt-qpcr在初步验证队列(胰腺癌20例、慢性胰腺炎20例、正常人16例)中对发现阶段的10个差异表达mirnas进行了验证，共筛选出6个差异表达的外泌体mirnas，分别为mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069。最后，扩大验证队列(胰腺癌68例、慢性胰腺炎27例、胰腺其他肿瘤34例、正常人61例)中对得到的6个差异表达外泌体mirnas的诊断效能进行了进一步验证。
39.分别以mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069诊断区分胰腺癌与其他胰腺肿瘤、慢性胰腺炎及正常人，运行roc曲线，对其敏感性、特异性进行分析，roc曲线分别如图2所示。
40.图2a～c分别为mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069诊断区分胰腺癌与其他胰腺肿瘤、慢性胰腺炎、正常人的roc曲线；由图2a～c可知，mir-1228能有效将胰腺癌与胰腺其他肿瘤、慢性胰腺炎和正常人鉴别开，其曲线下面积(auc)值分别为0.8901,0.8687和0.9652；mir-130a-3p、mir-21-5p和mir-223可以将胰腺癌与慢性胰腺炎、正常人鉴别出来，但不能区分胰腺癌与胰腺其他肿瘤。mir-7975可以将胰腺癌与胰腺其他肿瘤、正常人鉴别出来，但不能区分胰腺癌与胰腺炎。然而，mir-8069只能鉴别胰腺癌和正常人。
41.实施例2
42.检测传统胰腺癌标志物ca19-9，mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069的表达量，按照如下分类模型诊断区分胰腺癌(pc)与其他胰腺肿瘤(opt)、慢性胰腺炎(cp)、正常人(nc)以及其他胰腺肿瘤慢性胰腺炎正常人：
43.①
当鉴别胰腺癌与胰腺其他肿瘤时，
44.y＝-2.377 1.568
×
x
ca19-9
(-0.680)
×
lnx
mir-130a-3p
0.968
×
lnx
mir-21-5p
(-0.039)
×
ln x
mir-223-3p
(-1.454)
×
lnx
mir-7975
(-0.790)
×
lnx
mir-8069
1.371
×
lnx
mir-1228
。若y≥0.586，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为胰腺其他肿瘤；
45.②
当鉴别胰腺癌与慢性胰腺炎时，
46.y＝7.316 1.128
×
x
ca19-9
0.508
×
lnx
mir-130a-3p
0.107
×
lnx
mir-21-5p
(-1.001)
×
lnx
mir-223-3p
(-0.746)
×
lnx
mir-7975
(-0.074)
×
lnx
mir-8069
1.345
×
ln x
mir-1228
。若y≥0.408，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为慢性胰腺炎；
47.③
当鉴别胰腺癌与正常人时，y＝40.789 23.603
×
x
ca19-9
(-1.835)
×
lnx
mir-130a-3p
4.700
×
lnx
mir-21-5p
0.801lnx
mir-223-3p
0.659
×
lnx
mir-7975
0.530
×
lnx
mir-8069
3.132
×
ln x
mir-1228
。若y≥0.812，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为正常人；
48.④
当鉴别胰腺癌与其他所有人(胰腺其他肿瘤、慢性胰腺炎、正常人)时，
49.y＝4.819 2.052
×
x
ca19-9
(-0.091)
×
lnx
mir-130a-3p
0.788
×
lnx
mir-21-5p
(-0.287)
×
lnx
mir-223-3p
(-0.592)
×
lnx
mir-7975
(-0.071)
×
lnx
mir-8069
1.008
×
ln x
mir-1228
。若y≥0.309，则考虑为胰腺癌，反之则考虑为非胰腺癌；
50.其中，当ca19-9≥34u/l时，x
ca19-9
＝1；当ca19-9＜34u/l时，x
ca19-9
＝0；
51.x
mir-130a-3p
、x
mir-21-5p
、x
mir-223-3p
、x
mir-7975
、x
mir-8069
、x
mir-1228
分别为样本血浆外泌体中采用rt-qpcr检测mirna相对外参的表达量。
52.检测mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069组成血浆外泌体mirnas联合诊断标志物的表达量，区分胰腺癌(pc)与其他胰腺肿瘤(opt)、慢性胰腺炎(cp)、正常人(nc)以及其他胰腺肿瘤慢性胰腺炎正常人的模型为：
53.①
当鉴别胰腺癌与胰腺其他肿瘤时，
54.y＝-2.075 (-0.621)
×
lnx
mir-130a-3p
0.896
×
lnx
mir-21-5p
(-0.015)
×
lnx
mir-223-3p
(-1.589)
×
lnx
mir-7975
(-0.904)
×
lnx
mir-8069
1.473
×
ln x
mir-1228
55.②
当鉴别胰腺癌与慢性胰腺炎时，
56.y＝8.359 0.567
×
lnx
mir-130a-3p
0.080
×
lnx
mir-21-5p
(-1.011)
×
lnx
mir-223-3p
(-0.663)
×
lnx
mir-7975
(-0.113)
×
lnx
mir-8069
(1.346)
×
ln x
mir-1228
57.③
当鉴别胰腺癌与正常人时，
58.y＝30.726 (-0.596)
×
lnx
mir-130a-3p
2.413
×
lnx
mir-21-5p
0.435
×
lnx
mir-223-3p
0.712
×
lnx
mir-7975
0.179
×
lnx
mir-8069
2.188
×
ln x
mir-1228
59.④
当鉴别胰腺癌与其他所有人(胰腺其他肿瘤、慢性胰腺炎、正常人)时，y＝6.905 (-0.014)
×
lnx
mir-130a-3p
0.697
×
lnx
mir-21-5p
(-0.213)
×
lnx
mir-223-3p
(-0.560)
×
lnx
mir-7975
(-0.015)
×
lnx
mir-8069
1.078
×
ln x
mir-1228
60.分别按照上述计算模型，以传统胰腺癌标志物ca19-9，mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069组成血浆外泌体mirnas联合诊断标志物，mir-130a-3p、mir-1228、mir-21-5p、mir-223-3p、mir-7975和mir-8069组成血浆外泌体mirnas联合诊断标志物结合ca19-9诊断区分胰腺癌(pc)与其他胰腺肿瘤(opt)、慢性胰腺炎(cp)、正常人(nc)以及其他胰腺肿瘤慢性胰腺炎正常人的总体(opt&cp&nc)的roc曲线分别如图3a～d所示。
61.由图3可知，在胰腺癌和胰腺其他肿瘤之间的比较中，传统胰腺癌标志物ca19-9的诊断auc值为0.771(95％ci:0.684-0.857)，而血浆外泌体mirnas联合诊断标志物(图中panel)的auc为0.928(95％ci:0.871-0.986)，血浆外泌体mirnas联合诊断标志物结合ca19-9(图中panel ca19-9)的auc值可提高至0.945(95％ci：0.893-0.997)。血浆外泌体mirnas联合诊断标志物(图中panel)在鉴别胰腺癌和慢性胰腺方面的性能也明显高于ca19-9，auc值为0.917(95％ci:0.850-0.983)vs.0.708(95％ci:0.602-0.813)，血浆外泌体mirnas联合诊断标志物结合ca19-9(图中panel ca19-9)的auc值为0.919(95％ci：0.860-0.978)，诊断性能明显改善。血浆外泌体mirnas联合诊断标志物(图中panel)在区分胰腺癌和正常人方面表现出优异的性能，auc为0.986(95％ci：0.972-1.000)，而ca19-9的auc为0.862(95％ci：0.807-0.916)，血浆外泌体mirnas联合诊断标志物结合ca19-9(图中panel ca19-9)的auc值可达到0.997(95％ci：0.991-1.000)。此外，血浆外泌体mirnas联合诊断标志物(图中panel)在区分胰腺癌患者与所有其他患者(慢性胰腺炎 胰腺其他肿瘤 正常人)时，auc为0.929(95％ci：0.894-0.965)血浆外泌体mirnas联合诊断标志物结合ca19-9(图中panel ca19-9)的auc值为0.947；(95％ci：0.918-0.977)，进一步提高了诊断性能。
62.此外，本发明对不同标志物的效能评估及效能验证，得到在不同阈值时固定灵敏度下的特异度、不同阈值时固定特异度下的灵敏度，结果分别如表1～表8所示。
63.表1.不同标志物诊断胰腺癌vs胰腺其他肿瘤的特异度
[0064][0065]
表2.不同标志物诊断胰腺癌vs慢性胰腺炎的特异度
[0066][0067][0068]
表3.不同标志物诊断胰腺癌vs正常人的特异度
[0069][0070]
表4.不同标志物诊断胰腺癌vs(胰腺其他肿瘤 慢性胰腺炎 胰腺癌 正常人)的特异度
[0071][0072]
表5.不同标志物诊断胰腺癌vs胰腺其他肿瘤的灵敏度
[0073][0074]
表6.不同标志物诊断胰腺癌vs慢性胰腺炎的特异度
[0075][0076][0077]
表7.不同标志物诊断胰腺癌vs正常人的特异度
[0078][0079]
表8.不同标志物诊断胰腺癌vs(胰腺其他肿瘤 慢性胰腺炎 胰腺癌 正常人)的特异度
[0080][0081]
由表1～表8可知，本发明提供的血浆外泌体mirnas联合诊断标志物具有高特异性和高敏感性，并且血浆外泌体mirnas标志物与ca19-9结合后，特异性和敏感性进一步提升。
[0082]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。