一种补骨脂素/川芎嗪微乳和微乳凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及药物制剂制备技术领域，具体涉及一种补骨脂素/川芎嗪微乳和微乳凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.白癜风(vitiligo)是一类常见的后天性皮肤色素脱失性疾病，近年来的研究显示，白癜风的引起是由于患者皮肤中的黑素细胞丧失部分功能，以至于不能正常合成黑色素，其具体发病机制目前尚不明确，但通常认为与遗传、氧化应激和自身免疫这三个因素有关，氧化应激是基于白癜风患者的黑素细胞存在一定功能缺陷，更易受到细胞代谢变化产生的影响，黑素细胞在形成黑色素时通过羟化和氧化产生大量的自由基，增加活性氧(ros)的含量并无法及时代谢，细胞发生氧化应激而被破坏，目前认为这一发病机制是导致黑色素含量下降的重要机制。
3.对于白癜风，目前临床上的治疗手段十分复杂，一般常用激素治疗、光疗及光化学治疗、免疫抑制剂治疗、维生素d3衍生物治疗以及移植治疗，对患者患处进行局部或系统处理，但口服或外用糖皮质激素会出现皮肤萎缩、毛细血管扩张等不良反应，应用窄谱中波紫外线进行治疗会出现红斑、瘙痒，治疗效果不仅因人而异，未达预期，且对人体均有不同程度的伤害。因此，白癜风目前的临床研究重点变为对安全有效的治疗方法进行探寻。中医将白癜风称为白癜或白驳风，认为其发病机制除去皮肤黑色素不足外，主要为风邪和气滞血瘀：风邪侵入体内，肝肾不足，血虚以致皮肤局部气血失衡，导致白斑；气滞血瘀，脉络堵塞，进而肌肤失养，导致白斑。因此，对于白癜风的治疗方法探究，中医药也许是一个很好的突破口，迫切需要寻求一种新的治疗白癜风的中药制剂。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种补骨脂素/川芎嗪微乳和微乳凝胶及其制备方法和应用，以解决现有治疗白癜风的药物疗效差及副作用大的问题。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种补骨脂素/川芎嗪微乳，该补骨脂素/川芎嗪微乳包括以下组分：0.2-0.3mt％的补骨脂素，1.5-2.5mt％的川芎嗪，15-25mt％的乳化剂，15-25mt％的助乳化剂，10-20mt％的油相，余量为纯水。
6.本发明的有益效果为：中药材补骨脂为豆科植物补骨脂(psoralea corylifolia linn.)的干燥成熟果实，它是治疗白癜风的一味良药，内服补肾阳、止泻、平喘，外用消白斑，补骨脂素(psoralen)是补骨脂中的一个重要活性成分，补骨脂素有着很好的抗氧化、抗炎、光敏等作用，在日光或是紫外线的照射刺激下，补骨脂素可以吸收光能，形成光加合物，可以通过促进黑素细胞增殖，增加黑素细胞的单位密度，增加黑素细胞内酪氨酸酶活性，激活黑素细胞的正常功能，阻止抗黑变激素的释放，进而加速黑色素的合成过程，使黑色素水平提高，还可以通过抑制线粒体脂质的过氧化来保护线粒体功能的完整性，达到防止细胞氧化应激、防止皮肤白斑形成的目的。
7.中药川芎是伞形科植物川芎(ligusticum chuanxiong hort.)的干燥根茎，在《本草纲目》中被称为“血中气药”、活血化瘀的良药，在川芎众多的化学成分中，川芎嗪这一生物碱类成分是最主要的活性成分之一，川芎嗪可以针对中医理论上白癜风发病机制的风邪、气滞血瘀进行治疗，有着祛风、行气活血的显著药理作用，川芎嗪可以通过舒张患处的微血管对血流速度进行调节，增加血流量，同时可以起到预防血管堵塞的作用，川芎嗪还具有一定程度上的抗氧化应激作用，可以作为还原剂或抗氧化剂减少细胞内活性氧(ros)生成，还可以达到保持线粒体结构及其功能完整性、维持线粒体膜电位、间接防止白斑形成的目的，川芎嗪易溶于热水，不溶于冷水，可溶于有机溶剂，在体内有着分布广、吸收完全的特点，同时川芎嗪具有抑制p-糖蛋白(p-gp)表达，促进药物跨膜吸收的作用。因此，将川芎嗪和补骨脂素联合运用，以期改善补骨脂素的透皮吸收能力，提高其促进黑色素生成的作用，并且川芎嗪和补骨脂素联合运用，基于多靶点联合治疗白癜风，可发挥协同作用，提高治疗效果。
8.将川芎嗪和补骨脂素联合制成微乳制剂，可增加药物成分的稳定性，增加药物溶解度，又因其属于包裹式体系，所以也具有降低药物引起毒副反应概率的作用，更因其有着较低的表面张力，可以促进药物透皮吸收，增加药物透皮含量、加快透皮速度，进而更好的发挥药效作用。
9.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
10.进一步，补骨脂素/川芎嗪微乳包括以下组分：0.27mt％的补骨脂素，2.09mt％的川芎嗪，20.84mt％的乳化剂，20.84mt％的助乳化剂，15.05mt％的油相，余量为纯水。
11.进一步，乳化剂为吐温80或聚氧乙烯蓖麻油。
12.进一步，助乳化剂为异丙醇或聚乙二醇。
13.进一步，油相为油酸聚乙二醇甘油酯或油酸乙脂。
14.本发明还提供上述补骨脂素/川芎嗪微乳的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)将补骨脂素、川芎嗪、乳化剂和助乳化剂按比例混匀至完全溶解，得到混合溶液；
16.(2)在混合溶液中加入油相，于30-40℃条件下搅拌25-35min，然后逐滴加入纯水，搅拌25-35min，制得补骨脂素/川芎嗪微乳。
17.本发明还提供一种补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，包括上述补骨脂素/川芎嗪微乳和凝胶基质。
18.进一步，凝胶基质为卡波姆或壳聚糖。
19.本发明还提供上述补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶的制备方法，包括以下步骤：将凝胶基质加入纯水，放置10-15h充分溶胀，然后加入上述补骨脂素/川芎嗪微乳，于30-40℃条件下搅拌25-35min，得到补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶；其中，凝胶基质和纯水的质量比为0.1-0.3％，补骨脂素/川芎嗪微乳和溶胀后凝胶基质的体积比为1：0.8-1.2。
20.本发明的有益效果为：微乳凝胶的外观均匀透明，呈现低流动性半固体的形态，具有稳定的网状结构，其中均匀分布着微乳液滴，因此微乳的粒径对微乳凝胶的性能影响较大，微乳凝胶结合了微乳与凝胶两种剂型，同时也具备了两种剂型各自的优点，既有微乳增加难溶或不溶药物溶解度、透皮含量、透皮速度和持续释放的优势，又有凝胶黏度大、延展性好、易洗脱的优点，还可以增加药物的生物利用度、产生缓释、降低刺激性药物的毒副反
应等，操作简单，使用方便，同时也便于运输和储存。
21.本发明还提供补骨脂素/川芎嗪微乳在制备治疗白癜风药物方面的应用。
22.本发明还提供补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶在制备治疗白癜风药物方面的应用。
23.本发明具有以下有益效果：本发明将川芎嗪和补骨脂素联合，制成微乳或微乳凝胶制剂，通过多靶点作用，综合发挥药物组分之间的协同作用，再结合制剂的多种促进作用，发挥整体作用，可有效治疗白癜风。
附图说明
24.图1为补骨脂素与川芎嗪混合标准品溶液及样品的hplc图；
25.图2为实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳的外观图；
26.图3为实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳的外观电镜图；
27.图4为实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶载药和未载药时的外观图；
28.图5为施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳滴入苏丹红ⅲ和亚甲基蓝溶液时的效果图；
29.图6为将图5放置5天后的图；
30.图7为实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳的粒径分布图；
31.图8为实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳离心前的图；
32.图9为实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳离心后的图；
33.图10为实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶离心前的图；
34.图11为实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶离心后的图；
35.图12为实施例1、对比例3制得成品中补骨脂素以及游离补骨脂素的皮肤透过量曲线图；
36.图13为实施例1、对比例3制得的成品中川芎嗪以及游离川芎嗪的皮肤透过量曲线图；
37.图14为实施例1、对比例3制得的成品中补骨脂素以及游离补骨脂素的皮肤滞留量图；
38.图15为实施例1、对比例3制得的成品中川芎嗪以及游离川芎嗪的皮肤滞留量图；
39.图16为不同浓度的游离补骨脂素和细胞存活率的关系图；
40.图17为实施例1制得的微乳中不同浓度补骨脂素与细胞存活率的关系图；
41.图18为实施例1制得的微乳凝胶中不同浓度的补骨脂素与细胞存活率的关系图；
42.图19为实施例1-3、对比例1-2和对比例3所制得的成品促黑色素形成的含量图；
43.图20为实施例1-3、对比例1-2和对比例3所制得的成品促络氨酸酶活性图；
44.图21为实施例1制得成品及对比例1-2制得的微乳凝胶促黑色素合成的效果图；
45.图22为为实施例1制得成品及对比例1-2制得的微乳凝胶对活性氧的抑制效果图。
具体实施方式
46.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
47.实施例1：
48.一种补骨脂素/川芎嗪微乳，其制备方法包括以下步骤：
49.(1)将28.2mg补骨脂素、241.1mg川芎嗪、2.135g吐温80和2.135g异丙醇涡旋混匀至完全溶解，得到混合溶液；
50.(2)在混合溶液中加入1.54g油酸聚乙二醇甘油酯，于35℃条件下磁力搅拌30min，然后逐滴加入4.19g纯水，搅拌30min，制得补骨脂素/川芎嗪微乳；
51.一种补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，其制备方法包括以下步骤：
52.取101.5mg卡波姆940于烧杯中，加入50ml纯水，放置12h充分溶胀，然后加入上述的补骨脂素/川芎嗪微乳，于35℃条件下搅拌30min，得到补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶；补骨脂素/川芎嗪微乳和溶胀后卡波姆940的体积比为1：1。
53.实施例2：
54.一种补骨脂素/川芎嗪微乳，其制备方法包括以下步骤：
55.(1)将20.4mg补骨脂素、153.6mg川芎嗪、1.536g吐温80和1.536g异丙醇涡旋混匀至完全溶解，得到混合溶液；
56.(2)在混合溶液中加入1.024g油酸聚乙二醇甘油酯，于35℃条件下磁力搅拌30min，然后逐滴加入5.971g纯水，搅拌30min，制得补骨脂素/川芎嗪微乳；
57.一种补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，其制备方法包括以下步骤：
58.取101.5mg卡波姆940于烧杯中，加入100ml纯水，放置12h充分溶胀，然后加入上述的补骨脂素/川芎嗪微乳，于35℃条件下搅拌30min，得到补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶；补骨脂素/川芎嗪微乳和溶胀后卡波姆940的体积比为1：0.8。
59.实施例3：
60.一种补骨脂素/川芎嗪微乳，其制备方法包括以下步骤：
61.(1)将30.7mg补骨脂素、256.05mg川芎嗪、2.56g吐温80和2.56g异丙醇涡旋混匀至完全溶解，得到混合溶液；
62.(2)在混合溶液中加入2.048g油酸聚乙二醇甘油酯，于35℃条件下磁力搅拌30min，然后逐滴加入2.785g纯水，搅拌30min，制得补骨脂素/川芎嗪微乳；
63.一种补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，其制备方法包括以下步骤：
64.取101.5mg卡波姆940于烧杯中，加入34ml纯水，放置12h充分溶胀，然后加入上述的补骨脂素/川芎嗪微乳，于35℃条件下搅拌30min，得到补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶；补骨脂素/川芎嗪微乳和溶胀后卡波姆940的体积比为1：1.2。
65.对比例1：
66.一种补骨脂素微乳，其制备方法包括以下步骤：
67.(1)将28.2mg补骨脂素、2.135g吐温80和2.135g异丙醇涡旋混匀至完全溶解，得到混合溶液；
68.(2)在混合溶液中加入1.54g油酸聚乙二醇甘油酯，于35℃条件下磁力搅拌30min，然后逐滴加入4.19g纯水，搅拌30min，制得补骨脂素微乳；
69.一种补骨脂素微乳凝胶，其制备方法包括以下步骤：
70.取101.5mg卡波姆940于烧杯中，加入50ml纯水，放置12h充分溶胀，然后加入上述的补骨脂素微乳，于35℃条件下搅拌30min，得到补骨脂素微乳凝胶；补骨脂素微乳和溶胀
后卡波姆940的体积比为1：1。
71.对比例2：
72.一种川芎嗪微乳，其制备方法包括以下步骤：
73.(1)将241.1mg川芎嗪、2.135g吐温80和2.135g异丙醇涡旋混匀至完全溶解，得到混合溶液；
74.(2)在混合溶液中加入1.54g油酸聚乙二醇甘油酯，于35℃条件下磁力搅拌30min，然后逐滴加入纯水，搅拌30min，制得川芎嗪微乳；
75.一种川芎嗪微乳凝胶，其制备方法包括以下步骤：
76.取101.5mg卡波姆940于烧杯中，加入50ml纯水，放置12h充分溶胀，然后加入上述的川芎嗪微乳，于35℃条件下搅拌30min，得到川芎嗪微乳凝胶；川芎嗪微乳和溶胀后卡波姆940的体积比为1：1。
77.对比例3：
78.一种补骨脂素/川芎嗪软膏，其制备方法包括以下步骤：
79.将1.40g十六醇、2.6g司盘-80、2.0油酸、2.0g单硬脂酸甘油酯在80℃水浴加热至融化，作为油相；将水、1.8g吐温80、8.0g甘油水浴加热至80℃，作为水相；将水相加至同温度油相中，200r/min搅拌均匀，待温度降至50℃后，加入28.2mg补骨脂素和241.1mg川芎嗪，搅拌均匀至冷凝，即得补骨脂素/川芎嗪软膏。
80.试验例
81.实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳与补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶的药物含量、表征等参数基本一致，下面以实施例1具体说明。
82.一、含量测定
83.分别将实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳与补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶用高效液相色谱仪进行含量测定，hplc含量测定的具体方法为：分别取适量实施例1所得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，10000r/min离心20min，取上清液适量用甲醇超声破乳，稀释1000倍，过0.22μm微孔滤膜，得到样品溶液，按以下色谱条件分别平行测定3个样品溶液，进行含量检测，色谱条件：色谱柱：zorbax sb-c18(250mm
×
4.6，5μm)；流动相：乙腈：水＝90:10(v/v)；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；进样：10μl；检测波长：290nm。标准曲线回归方程：在高效液相色谱仪上，按照上述色谱条件，对补骨脂素标准品进行测定，得出浓度与峰面积的标准曲线，即得到补骨脂素标准曲线方程y＝102141659*x 24659，x为峰面积，y为浓度，线性指数r2＝0.9999，在0.00026325-0.004212mg/ml浓度范围内线性关系良好，可用于测定样品中补骨脂素的含量；在高效液相色谱仪上，按照上述色谱条件，对川芎嗪标准品进行测定，得出标准曲线，即得到川芎嗪标准曲线方程y＝10045586*x 22061，x为峰面积，y为浓度，线性指数r2＝0.9999，在0.001-0.0162mg/ml浓度范围内线性关系良好，可用于测定样品中川芎嗪的含量。
84.1、补骨脂素/川芎嗪微乳含量测定
85.对补骨脂素与川芎嗪混合标准品溶液及实施例1制得的样品进行测定，结果见图1，由图1可知，在290nm条件下，在补骨脂素与川芎嗪混合标准品溶液及样品中，补骨脂素与川芎嗪均峰面积良好，并且无干扰，因此，能有效地分离并进行含量测定。
86.在高效液相色谱仪上，按照上述色谱条件，将平行的3个样品溶液进行测定，将得
到的峰面积代入相应的标准曲线方程中，计算得到相应的浓度，结果见表1，由表1可知，实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳中，补骨脂素的平均浓度为5.197
±
0.06861mg/ml，川芎嗪的平均浓度为9.669
±
0.3884mg/ml，补骨脂素的平均载药量为0.5778
±
0.005925％，川芎嗪的平均载药量为1.075
±
0.03491％。补骨脂素浓度的rsd为1.320％，载药量的rsd为1.025％。
87.表1川芎嗪-补骨脂素微乳的含量测定
[0088][0089][0090]
2、补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶含量测定
[0091]
在高效液相色谱仪上，按照上述色谱条件，将平行的3个样品溶液进行测定，将得到的峰面积代入相应的标准曲线方程中，计算得到相应的浓度，结果见表2，由表2可知，实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶中，补骨脂素的平均浓度为2.496
±
0.04977mg/ml，川芎嗪的平均浓度为4.570
±
0.1207mg/ml，补骨脂素的平均载药量为0.2823
±
0.002065％，川芎嗪的平均载药量为0.5167
±
0.006286％。补骨脂素浓度的rsd为1.994％，载药量的rsd为0.7315％；川芎嗪浓度的rsd为2.640％，载药量rsd为1.217％。
[0092]
表2川芎嗪-补骨脂素共载微乳凝胶的含量测定
[0093]
[0094]
二、表征
[0095]
(1)外观、形态
[0096]
将实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳外观、形态进行观察，外观观察的具体方法为：取适量实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳于透明西林瓶中，在白色背景下，观察其外观形态，结果见图2，由图2可知，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳呈均一透明的淡黄色液体。形态观察的具体方法为：取适量实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳，稀释20倍后，滴加少许于200目铜网表面，再滴加1滴磷钨酸溶液进行复染，自然干燥，使用透射电镜观察微乳形态，结果见图3，由图3可知，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳100nm以下，均呈现出圆形或椭圆形，外观良好。
[0097]
将实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶按上述方法进行外观观察，结果见图4，由图4可知，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶呈现出均一的微白色胶状，黏度适中，载药微乳凝胶比空白微乳凝胶更为澄清(左边为未载药微乳凝胶，右边为载药微乳凝胶)。
[0098]
(2)微乳类型
[0099]
将实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳采用染色法进行微乳类型判断，具体判断方法为：分别取两份适量的补骨脂素/川芎嗪微乳置于透明西林瓶中，分别加入1滴配制好的苏丹红ⅲ和亚甲基蓝溶液，结果见图5，然后放置5天，结果见图6，由图6可知，水溶性染料亚甲基蓝的扩散速度大于油溶性染料苏丹红ⅲ的扩散速度，确定本发明所制备的川芎嗪-补骨脂素微乳类型为水包油型。
[0100]
(3)粒径及pdi测定
[0101]
分别将实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶取适量，用纯水稀释10倍，用纳米粒度仪进行粒径及pdi的测定，分别平行测定3组，补骨脂素/川芎嗪微乳的测定结果见表3和图7，由表3和图7可知，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳的粒径均在100nm以下，平均粒径为25.89
±
0.2227nm，平均pdi值为0.223
±
0.0142，粒径rsd为0.8602％，分布均匀且范围较窄，对称性良好。
[0102]
表3川芎嗪-补骨脂素微乳粒径及pdi值
[0103][0104]
补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶的测定结果见表4，由表4可知，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶的粒径均在600nm以下，平均粒径为587.52
±
3.7749nm，平均pdi值为0.308
±
0.0352，粒径的rsd为0.6425％，分布范围较窄且分散均匀。
[0105]
表4川芎嗪-补骨脂素微乳凝胶粒径及pdi值
[0106][0107]
(4)离心稳定性
[0108]
将实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳取适量，置于离心管中，见图8，10000r/min离心20min，结果见图9，由图8和图9对比可知，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳在离心后，仍然呈现出均一透明的淡黄色液体，未出现分层及浑浊等现象。将离心后的补骨脂素/川芎嗪微乳用纳米粒度仪测定粒径及pdi，结果见表5，由表5可知，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳离心后，上层、下层粒径均在100nm以下，上层平均粒径为52.660
±
3.1170nm，平均pdi值为0.20622
±
0.017893，下层平均粒径为48.348
±
4.7718nm，平均pdi值为0.21289
±
0.021996。离心稳定性良好。
[0109]
表5川芎嗪-补骨脂素共载微乳粒径及pdi值
[0110][0111]
将实施例1所制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶取适量，置于离心管中，见图10，10000r/min离心20min，结果见图11，由图11和图10对比可知，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶在离心后，仍然呈现出均一的微白色胶状，未出现分层及浑浊等现象，流动性及延展性同离心前保持一致。
[0112]
(5)ph值测定
[0113]
将实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，用纯水稀释10倍，分别取三组平行样品，采用ph计进行ph值测定，结果见表6，由表6可知，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳
凝胶ph值在5.77-5.80之间，平均ph值为5.79
±
0.0153，rsd为0.264％。人体正常皮肤表面的ph值在5.0～7.0之间，皮肤平均ph值在5.8左右，因此该微乳凝胶制剂适合人体外用涂抹，且符合经皮给药制剂的要求。
[0114]
表6补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶ph
[0115][0116]
三、透皮实验
[0117]
(1)皮肤透过量测定
[0118]
分别将实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶、游离补骨脂素、游离川芎嗪以及对比例3制得的补骨脂素/川芎嗪软膏，进行皮肤透过量测定。皮肤透过量测定的具体方法为：将小白鼠背部毛发剪短后，用8％硫化钠溶液脱毛，采用脱颈法处死后，取背部皮肤，生理盐水洗净，处理粘膜及脂肪组织，并用生理盐水浸泡，于4℃下过夜。取处理好的鼠皮，用生理盐水清洗，在水浴温度37
±
0.4℃、磁力搅拌速度200r/min条件下，将鼠皮以皮肤层朝给药池、真皮层朝接受池的形式夹在franz扩散池中，给药池中分别加入游离药物0.25ml、补骨脂素/川芎嗪软膏0.25ml、补骨脂素/川芎嗪微乳0.25ml、补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶0.5ml，接受池内充满20％乙醇-pbs溶液，记录所加接受液的体积，分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、60h采集接受液0.4ml，并迅速补加0.4ml 20％乙醇-pbs溶液，将采集的接受液分别过0.22μm微孔滤膜，在高效液相色谱仪上，按上述hplc含量测定的具体方法进行含量检测。
[0119]
通过测定不同接受液中补骨脂素的含量，处理数据后得出单位面积累积透过量，见图12，由图12可知，补骨脂素在游离态下累积透过量保持着相对稳定的趋势，且均未超过2μg/cm2，说明补骨脂素的透皮性能较低。在微乳和微乳凝胶制剂下，补骨脂素累积透过量呈现逐步增加的趋势，均远大于游离态及软膏组，且微乳凝胶组的数据大于微乳组，说明微乳和微乳凝胶制剂均可以增加补骨脂素的单位面积累积透过量，促进补骨脂素的透过，且微乳凝胶增加幅度更大。
[0120]
通过测定不同接受液中川芎嗪的含量，处理数据后得出单位面积累积透过量，见图13，由图13可知，川芎嗪在游离态下累积透过量也保持相对稳定的趋势，且均未超过40μg/cm2，说明川芎嗪的透皮性能也较低。在微乳和微乳凝胶制剂下，川芎嗪累积透过量也呈现逐步增加的趋势，均远大于游离态及软膏组，且微乳凝胶组的数据也大于微乳组，说明微乳和微乳凝胶制剂均可以增加川芎嗪的单位面积累积透过量，促进川芎嗪的透过，且微乳凝胶增加幅度更大。
[0121]
综上所述，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶均有药物缓释功效，可以有效提高药物的治疗效果，且补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶优于补骨脂素/川芎嗪微乳。
[0122]
(2)皮肤滞留量测定
[0123]
分别将上述皮肤透过量测定过程中所用的皮肤取下，用棉签轻轻擦拭皮肤表面，除去残余药物，生理盐水多次冲洗后，用滤纸吸干水分，剪下有效面积皮肤，充分剪碎，并置于离心管内，精密加入2ml甲醇，涡旋5min后超声30min，3000r/min离心10min，过0.22μm微
孔滤膜，分别将得到的溶液在高效液相色谱仪上，按上述hplc含量测定的具体方法进行含量检测。
[0124]
通过测定不同溶液中补骨脂素的含量，处理数据后得出单位面积皮肤滞留量，见图14，通过测定不同溶液中川芎嗪的含量，处理数据后得出单位面积皮肤滞留量，见图15，由图14和15可知，在给药60h时，对于补骨脂素和川芎嗪在皮肤中的单位面积皮肤滞留量来说，本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳组和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶组显著大于游离组及软膏组，说明本发明制备的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶均可以增加补骨脂素和川芎嗪的皮肤滞留量，具有良好的缓慢控制药物释放的效果，延长了药物的作用时间，避免了短时间连续给药，降低药物毒副作用，达到更好的治疗效果。
[0125]
四、细胞实验
[0126]b16f10
细胞的培养：将冻存的b
16f10
细胞进行融化复苏，接种于含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素、链霉素)的dmem培养基中，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养。待细胞长至融合状态，胰蛋白酶消化，1500r/min离心5min，倾去上清液，用培养基重悬后，1：3传代培养。
[0127]
(一)细胞增殖毒性
[0128]
取实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，采用cck-8法进行细胞增殖毒性测试，具体测试方法如下：
[0129]
细胞个数-吸光度(od值)曲线的建立：将对数生长期的b
16f10
细胞用胰蛋白酶消化，制成细胞混悬液，建立细胞浓度梯度(5.0
×
104个/100μl、2.04
×
104个/100μl、1.0
×
104个/100μl、0.8
×
104个/100μl、0.1275
×
104个/100μl)，接种于96孔板中，100μl/孔，每个浓度设5个复孔，37℃培育24h后除去旧培养基，用100μlpbs溶液清洗，然后每孔加入含10％cck-8的空白培养基溶液，37℃继续孵育2.5h后，利用酶标仪检测450nm波长下，各孔的吸光度，处理得出细胞个数-吸光度(od值)曲线方程y＝0.008804*x 0.001770，x为细胞浓度，y为吸光度，线性指数r2＝0.9996，根据细胞培养过程中所显示的生长状况来看，选择1
×
104个/100μl作为后续实验的种板浓度最佳。
[0130]
将对数生长期的b
16f10
细胞以1.0
×
104个/100μl的密度接种于96孔板中，100μl/孔，37℃培养24h后除去旧培养基，分为空白组、对照组及实验组进行加样处理，每个浓度设5个复孔。37℃培养24h，除去旧培养基，每孔加入含10％cck-8的空白培养基溶液，37℃继续孵育2.5h后，酶标仪检测450nm波长各孔的吸光值，再根据上述细胞个数-吸光度(od值)曲线方程，得出加样后的细胞浓度，加样后细胞浓度和加样前细胞浓度的比值，即为细胞的存活率，得出含不同浓度补骨脂素的不同制剂与细胞存活率的对应关系，选取对b
16f10
细胞产生明显抑制作用的浓度作为毒性浓度。结果见图16-18。
[0131]
实验组：
①
不同浓度的补骨脂素样品：0.25μm、0.5μm、1μm、2.5μm、5μm；
②
含不同浓度补骨脂素的微乳样品：0.05μm、0.25μm、0.5μm、1μm、2μm；
③
含不同浓度补骨脂素的微乳凝胶样品：0.25μm、1.25μm、2.5μm、5μm、10μm。
②
和
③
是将实施例1制得的微乳、微乳凝胶稀释而制得。
[0132]
由图16-18可知，对于游离补骨脂，补骨脂素浓度为2.5μm即会对细胞产生明显毒性作用，因此，游离补骨脂素的毒性浓度为2.5μm，无毒范围则为0-1μm；对于补骨脂素/川芎嗪微乳，微乳中补骨脂素浓度为1μm即会对实验细胞产生明显毒性作用，因此，补骨脂素/川芎嗪微乳的毒性浓度为1μm(微乳中补骨脂素浓度)，无毒范围则为0-0.5μm(微乳中补骨脂
素浓度)；而对于补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶，微乳凝胶中补骨脂素浓度达到10μm才会对实验细胞产生明显毒性作用，因此，补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶的毒性浓度为10μm(微乳凝胶中补骨脂素浓度)，无毒范围则为0-5μm(微乳凝胶中补骨脂素浓度)。
[0133]
由上述可知，虽然微乳制剂的毒性浓度大于补骨脂素的毒性浓度，但是微乳凝胶制剂的毒性浓度是游离药物毒性浓度的4倍，说明将药物制备成微乳凝胶后，大大降低了细胞毒性。
[0134]
(二)生物指标检测
[0135]
(1)相对黑色素含量
[0136]
分别将实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶、对比例1制得的补骨脂素微乳和补骨脂素微乳凝胶、对比例2制得的川芎嗪微乳和川芎嗪微乳凝胶、对比例3制得的软膏利用酶标仪进行相对黑色素含量检测，具体测试方法如下：
[0137]
选择对数生长期的b
l6f10
细胞，用胰蛋白酶消化，以1
×
104个/100μl接种于96孔板中，将培养板放在培养箱内，37℃、5％co2条件下培养24h。将细胞分为空白组、对照组和实验组，吸去旧培养基后，以换液形式加入不同浓度的药物样品，37℃培养36h。加入100μl含10％dmso的1m氢氧化钠溶液，80℃水浴2h，在酶标仪405nm下检测吸光值，计算相对黑色素含量，结果见图19。
[0138]
实验组：
①
实施例1、2、3的微乳样品、对比例1、2的微乳样品、对比例3的样品，样品浓度均为0.25μm；
②
实施例1、2、3的微乳凝胶样品、对比例1、2的微乳凝胶样品、对比例3的样品，样品浓度均为0.25μm。
[0139]
由图19可知，对于实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳、对比例1制得的补骨脂素微乳、对比例2制备的川芎嗪微乳，与空白组相比，均具有极显著性，而对比例3制备的软膏也能一定程度增加黑色素含量，但与补骨脂素/川芎嗪微乳相比，具有显著性差异。说明本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳比对比例1-2制得的仅含单一药物组分的微乳对黑色素合成的促进效果好，共载微乳较单传统软膏剂具有明显优势。对于实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶来说，在药物含量与微乳制剂相同的浓度下，作用36h均能显著性促进黑色素的合成，且对黑色素合成的促进效果明显较微乳的促进效果更好。同时本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶比对比例1-2制得的仅含单一药物组分的微乳凝胶对黑色素合成的促进效果好。
[0140]
综上所述，微乳凝胶制剂对黑色素合成的促进效果比微乳制剂的促进效果更好，同时，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶比对比例1-2制得的仅含单一药物组分的微乳及微乳凝胶对黑色素合成的促进效果好。
[0141]
(2)络氨酸酶活性
[0142]
分别将实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶、对比例1制得的补骨脂素微乳和补骨脂素微乳凝胶、对比例2制得的川芎嗪微乳和川芎嗪微乳凝胶和对比例3制得的软膏，利用酶标仪进行酪氨酸酶活性检测，具体测试方法如下：
[0143]
选择对数生长期的b
l6f10
细胞，用胰蛋白酶消化，以1
×
104个/100μl接种于96孔板中，将培养板放在培养箱内，37℃、5％co2条件下培养24h、36h。将细胞分为对照组、模型组和实验组，吸去旧培养基后，以换液形式同时加入10.8mm的arbutin抑制剂50μl和不同浓度的药物样品，37℃分别培养24h、36h。吸去旧培养基，pbs清洗1次，加入100μl的tritonx-100
溶液，-80℃处理30min，室温融化后，观察细胞是否破裂。将液体吸出于对应离心管，4℃下12000r/min低温离心30min，取上清液50μl至新96孔板中，加入50μl0.2％左旋多巴溶液，37℃培养2h后，在酶标仪475nm处测定吸光值，得出酪氨酸酶活性，结果见图20。
[0144]
实验组：
①
实施例1、2、3的微乳样品、对比例1、2的微乳样品、对比例3的样品，样品浓度均为0.25μm；
②
实施例1、2、3的微乳凝胶样品、对比例1、2的微乳凝胶样品、对比例3的样品，样品浓度均为0.25μm。
[0145]
由图20可知，在所选择的浓度下，模型组能显著抑制酪氨酸酶的活性，实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳、对比例1制得的补骨脂素微乳、对比例2制备的川芎嗪微乳、对比例3制备的软膏，与模型组组相比均具有极显著性，而均能使酪氨酸酶的活性在模型组的基础上有所增加。微乳凝胶制剂对酪氨酸酶活性的促进幅度最大，说明对酪氨酸酶活性的增加作用最好，与相对黑色素含量检测趋势一致，符合实验预期。同时，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶比对比例1-2制得的仅含单一药物组分的微乳及微乳凝胶对黑色素合成的促进效果好。
[0146]
(3)黑色素定性检测
[0147]
分别将实施例1制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶、对比例1制得的补骨脂素微乳凝胶、对比例2制得的川芎嗪微乳凝胶进行黑色素定性检测，具体测试方法如下：
[0148]
选择对数生长期的b
l6f10
细胞，用胰蛋白酶消化，以1
×
104个/100μl接种于96孔板中，将培养板放在培养箱内，37℃、5％co2条件下培养24h。将细胞分为空白组、模型组、和实验组，吸去旧培养基，加入5.4mm的arbutin抑制剂造模24h后，以换液形式加入等体积不同浓度的药物样品，37℃培养24h。吸去废液后，pbs清洗1次，加入10％中性福尔马林固定15min，纯水洗涤3次，加入fontana氨银溶液，锡箔纸包裹，避光浸染过夜。纯水洗涤5次，海波溶液处理5min，纯水洗涤3次，中性红染色液复染5min，纯水洗涤3次，95％乙醇脱水。除去乙醇，用倒置荧光显微镜观察并拍照，结果见图21。
[0149]
由图21可知，补骨脂素微乳凝胶、川芎嗪微乳凝胶、以及共载微乳制剂和共载微乳凝胶，处理24h后，均能促进黑色素的合成，使染色程度加深，且共载微乳凝胶制剂的显色程度最深，说明黑色素合成促进效果最好，与相对黑色素含量和酪氨酸酶活性的检测结果一致。证实本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶比对比例1-2制得的仅含单一药物组分的微乳凝胶对黑色素合成的促进效果好。
[0150]
(4)活性氧ros含量
[0151]
分别将实施例1-3制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶、对比例1制得的补骨脂素微乳凝胶、对比例2制得的川芎嗪微乳凝胶进行活性氧ros含量检测，具体测试方法如下：
[0152]
选择对数生长期的b
l6f10
细胞，用胰蛋白酶消化，以1
×
104个/100μl接种于96孔板中，将培养板放在培养箱内，37℃、5％co2条件下培养24h。将细胞分为空白组、模型组和实验组，吸去旧培养基后，以换液形式加入0.88mmh2o2溶液100μl处理4h，加入等体积不同浓度的药物样品，37℃培养24h。吸去旧培养基，加入25μm的2’，7
’‑
二氯荧光素双乙酸盐(dcfh-da)溶液100μl，37℃培养40min后。pbs洗涤，用倒置荧光显微镜观察拍照，结果见图22。
[0153]
由图22可知，由图22可知，对于微乳制剂和微乳凝胶制剂来说，在所选择的药物浓
度处理24h后，均能使荧光染色程度相对于模型组有所减弱，活性氧的含量降低，且共载微乳凝胶制剂的荧光程度相对最浅，活性氧的含量相对最低，说明对活性氧生成的抑制效果最好。同时，本发明制得的补骨脂素/川芎嗪微乳和补骨脂素/川芎嗪微乳凝胶比对比例1-2制得的仅含单一药物组分的微乳凝胶对活性氧生成的抑制效果好。
[0154]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。