一种重组亚单位微针疫苗及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物微针技术领域，具体涉及其中包含生物微针并且能够由该生物微针进行肺部相关病毒疫苗注射的重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗，本发明具体涉及一种重组亚单位微针疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前的肺炎的肺部相关病毒疫苗包括灭活肺部相关病毒疫苗、重组亚单位肺部相关病毒疫苗、腺病毒载体肺部相关病毒疫苗、核酸肺部相关病毒疫苗这几种，主要的使用方式为肌肉注射。
3.而肌肉注射存在一些难以克服的问题，比如：必须要冷链储存，冷链储存会造成运输、储存、使用过程中的成本大大增加；肌肉注射需要有一定的注射量才能产生作用，通常要进行一针剂或两针剂及以上的注射，不管是对于医疗资源的使用还是被接种者的时间安排都有一定的问题。
4.微针给药是一种新型的局部经皮给药技术，结合了贴膏剂的便捷性和皮下注射给药的有效性，规避了其它给药方式的不足，具有不触及神经、安全、无痛、高效渗透等多种优点。现有技术中将使肺部相关病毒疫苗存在于微针贴片中，是十分困难的。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种重组亚单位微针疫苗及其制备方法和应用，通过负载在微针中含有重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液，将该微针施用到皮肤后实现快速的免疫应答，达到肺部相关病毒疫苗的长效稳定释放以及高速反应。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种重组亚单位微针疫苗，包含背衬和附着于背衬侧面的含有重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液的微针阵列，含有重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液的微针阵列包含多根微针，其中每根微针包含基体以及负载在基体中的重组亚单位。
7.优选的，重组亚单位肺部相关病毒疫苗是通过化学分解或控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出具有免疫活性的片段式肺部相关病毒疫苗。
8.优选的，基体是通过将包含以下物质中的一种或多种的水溶液进行交联和/或干燥固化后形成的：聚乙二醇双丙烯酸酯、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，优选甲基丙烯酸酯明胶和/或透明质酸，更优选甲基丙烯酸酯明胶。
9.优选的，背衬是通过将包含以下物质中的一种或多种的水溶液进行交联和/或干燥固化后形成的：聚乙二醇双丙烯酸酯、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，优选透明质酸。
10.优选的，每根微针具有尖端和底端，尖端远离背衬，微针经由底端附着于背衬，尖
端至底端的距离为200μm-1mm，底端直径为100μm-500μm，相邻的微针尖端之间间距为300μm-800μm。
11.一种重组亚单位微针疫苗的制备方法，步骤如下：
12.(1)制备重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液：通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成肺部相关病毒疫苗溶液；
13.(2)向由步骤(1)获得的含有重组亚单位的液体培养基中添加能够形成基体的基体材料形成混合溶液，在混合溶液中，基体材料占混合溶液总重量的20-40％，优选25-35％，更优选30％；
14.(3)准备微针模具；
15.(4)将由步骤(2)获得的混合溶液置于微针模具的成型孔中并填充成型孔容积的至少一部分，优选填满成型孔；
16.(5)在成型孔中包含的基体材料和重组亚单位的混合溶液进行交联，优选紫外交联5秒-15秒，优选10秒，和/或进行干燥固化，优选热固化，从而在成型孔内形成微针，多个微针构成重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列，每根微针具有尖端和底端，微针的尖端相对于微针的底端远离上表面；
17.(6)在微针的底端表面和微针模具的未被微针遮盖的上表面上施加包含背衬材料的溶液以形成背衬溶液层，将背衬材料进行交联形成连续的背衬层，从而使重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列附着于背衬溶液层或背衬层；
18.(7)将由步骤(6)获得的背衬溶液层或背衬层与重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列进行干燥固化形成亚单位微针疫苗。
19.优选的，微针模具包含上表面和从上表面向下延伸的成型孔，其中成型孔包括尖端和底端，尖端远离上表面，底端平面与上表面齐平，尖端至底端的距离为200μm-1mm，底端直径为100μm-500μm，相邻尖端之间的间距为300μm-800μm。
20.一种重组亚单位微针疫苗在生产治疗肺炎医用装置或药物中的应用。
21.因此，本发明采用上述一种重组亚单位微针疫苗及其制备方法和应用，充分利用了微针自身的优点和重组亚单位肺部相关病毒疫苗的优点，通过源自致病性细菌或病毒的某些成分，这些成分是高度纯化的蛋白质或合成肽，可以引起机体免疫反应。存在于微针贴片中的肺部相关病毒疫苗，不仅可以长效的使肺部相关病毒疫苗发生作用，还减轻了肺部相关病毒疫苗肌肉注射给被接种者带来的不适以及医疗资源的使用。
22.微针制品通常包括多根长度一般不超过1mm的微针，微针能够在皮肤角质层形成微型通道，突破皮肤角质层的阻隔，促进药物的渗透，从而减少药物在角质层的蓄积量，增加到达表皮、真皮及皮下组织的药物剂量，促进小分子、大分子药物的透皮吸收。
23.本发明的具体技术效果如下：
24.(1)本发明的亚单位微针疫苗通过工程化细胞，生产一种重组蛋白，生产工艺稳定可靠，可以快速实现国内外大规模产业化生产，显著降低了肺部相关病毒疫苗生产成本，且存储和运输便捷。
25.(2)本发明的亚单位肺部相关病毒疫苗仅有几种主要表面蛋白质，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少肺部相关病毒疫苗的副反应和肺部相关病毒疫苗引起的相
关疾病。
26.(3)本发明的亚单位微针疫苗制品可刺破限制药物吸收的皮肤角质层，促进重组亚单位蛋白的向人体的扩散，且不至于引起疼痛。
27.(4)本发明以微针模板倒模制备微针，方法简单，操作方便，价格低廉，可重复利用，不需要很高的技术要求，且易对微针阵列的基本外形进行控制，安全性强，适宜推广。
28.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
29.图1是重组亚单位微针疫苗中部分结构的侧视图；
30.图2是重组亚单位微针疫苗的微针模具的侧视图。
31.附图标记：
32.100、重组亚单位微针疫苗；110、微针；120、背衬；200、微针模具； 201、成型孔；202、上表面。
具体实施方式
33.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
34.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
35.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
36.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
37.还应当理解，以上的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
38.本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、“外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中
使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其
±
50％，
±ꢀ
40％，
±
30％，
±
20％，
±
10％，
±
5％或
±
1％范围内。
39.本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
40.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
41.本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
42.实施例一
43.一种重组亚单位微针疫苗100包含背衬120和附着于背衬120的一个侧面的重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列，重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列包含多根微针110，其中每根微针110包含基体以及负载在基体中的重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液。
44.亚单位微针疫苗100中，形成基体的基体材料没有特别限制，只要本领域中采用的制备微针的常用基体材料都可用于本发明。然而，考虑到在本发明的情况下所形成的微针110需要具有一定的机械强度，并且固化后微针110 还需要具有一定的孔隙度，基体是通过将包含以下物质中的一种或多种的水溶液进行交联和/或干燥固化后形成的：聚乙二醇双丙烯酸酯、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，优选甲基丙烯酸酯明胶和/或透明质酸，更优选甲基丙烯酸酯明胶。
45.进一步地，基体优选甲基丙烯酸酯明胶和/或透明质酸。甲基丙烯酸酯明胶(gelma)是由甲基丙烯酸酐(ma)与明胶(gelatin)制备获得，其中使它们在光敏剂介导下经紫外光照射发生交联，形成具有一定强度的孔状结构。 gelma具有优异的生物相容性。透明质酸是一种粘多糖，具有保护皮肤的作用，可应用于加速伤口的愈合。
46.亚单位微针疫苗100中，形成背衬120的背衬材料没有特别限制，只要本领域中采用的制备微针的常用背衬材料都可用于本发明。然而，在本发明中，考虑到所形成的背衬120需要具有一定的机械强度和柔韧性，背衬120 优选是通过将包含以下物质中的一种或多种的水溶液进行交联和/或干燥后形成的：聚乙二醇双丙烯酸酯、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，优选透明质酸。
47.进一步地，透明质酸是一种粘多糖，具有保护皮肤的作用，可应用于加速伤口的愈合，因此优选在本发明中用作背衬材料。
48.此处，所形成的背衬120的厚度没有限制，但考虑到背衬120要具有一定的强度和柔韧性，优选背衬120的厚度为0.1至15mm，更优选1至10 mm，最优选2至3mm。
49.进一步地，在一些情况下，本发明的亚单位微针疫苗100中，形成基体和背衬120的材料是相同的。在这些情况下，微针110和背衬120的结合更稳固，并且在如下的制备亚单位微针疫苗100的方法中，可以使微针阵列和背衬120一体成型，简化了制备过程。在另一些情况下，基体和背衬120的材料是不同的，例如，基体材料是甲基丙烯酸酯明胶，背衬材料是透
明质酸。在这种情况下，微针110具有一定强度并具有孔状结构和优异的生物相容性，同时背衬120对皮肤有更好的保护作用，可用于加速伤口的愈合。
50.需要说明的是，本领域技术人员完全有能力根据希望应用的情况对基体材料和背衬材料做出适当选择。
51.另外，在本发明的亚单位微针疫苗100中，微针110的尺寸和形状没有特别限制，其可根据本发明的亚单位微针疫苗制品100所施用的部位而在宽范围内变化。
52.如图1所示，在本发明的亚单位微针疫苗100中，每根微针110具有尖端和底端，尖端远离背衬120，微针110经由底端附着于背衬120，尖端至底端的高度没有特别限制，但优选200μm至1mm。高度不低于200μm，否则微针110不易刺穿一些动物体，优选人体的某些部位的皮肤角质层。然而，高度也不高于1mm，否则会刺穿一些动物体，优选人体的某些部位的皮肤角质层达到神经层，从而引起疼痛。
53.如图1所示，在本发明的亚单位微针疫苗100中，微针110底端的直径为100μm-500μm。底端直径优选不小于100μm，否则会使得微针110 的机械强度不足，容易折断。另外，底端直径不大于500μm，否则会在将本发明的亚单位微针疫苗100施用到一些动物体，优选人体的某些部位后，在皮肤上留下较大的孔洞，导致关于皮肤美观和愈合方面的问题。
54.另外，在本发明的亚单位微针疫苗100中，微针110的立体形状没有特别限制，其可以是圆柱形、锥形、圆台形等或它们的结合，优选是规则的或不规则的圆锥、类圆锥、三棱锥、四棱锥或更高级棱锥等形状，并且这些圆锥、类圆锥、三棱锥、四棱锥或更高级棱锥可以是正锥体或斜锥体。
55.如图1所示，在本发明的亚单位微针疫苗100中，相邻的微针110尖端之间间距为300μm至800μm。间距在此范围内可使得本发明的亚单位微针疫苗制品100在刺入角质层深度等多方面均实现最优化效果。
56.需要说明的是，本领域技术人员有能力根据实际应用情况对本发明的亚单位微针疫苗100的微针110的形状和尺寸等做出适当选择。
57.实施例二
58.重组亚单位微针疫苗100的制备方法，步骤如下：
59.(1)制备重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液；在大分子抗原携带的多种特异性的抗原决定簇中，只有少量抗原部位对保护性免疫应答起作用。通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成肺部相关病毒疫苗溶液；
60.(2)向由步骤(1)获得的含有重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液中添加能够形成基体的基体材料以形成混合溶液。
61.步骤(2)中，在混合溶液中，基体材料的浓度没有特别限制，只要其量能够确保形成本发明的最终重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗100中的微针 110即可。然而，优选基体材料在液体培养基中重量百分比含量为20-40％，优选25-35％，更优选30％。在这个范围内，由基体材料形成的微针110既具有足够的机械强度，又具有一定的孔隙度，从而能够使产氢效率最佳。
62.(3)提供微针模具200，如图2所示，微针模具200包含上表面202并包含从上表面202向下延伸的成型孔201，其中成型孔201具有尖端和底端，尖端远离上表面202，底端平面
与上表面202齐平。
63.步骤(3)中，在微针模具200中，成型孔201的立体形状要与希望形成的微针110的形状相匹配。如上的，其可以是圆柱形、锥形、圆台形等或它们的结合，优选是规则的或不规则的圆锥、类圆锥、三棱锥、四棱锥或更高级棱锥等形状，并且这些圆锥、类圆锥、三棱锥、四棱锥或更高级棱锥可以是正锥体或斜锥体。
64.成型孔201应当具有与微针110的高度、底面宽度和尖端间距相对应的成型孔201的高度、底面宽度和尖端间距。然而，在一些情况下，成型孔201 还可以具有大于微针110的高度和底面宽度的成型孔201的高度和底面宽度。在后者的情况下，所形成的微针110并不会充满成型孔201。
65.进一步地，微针模具200的上表面202(其包括成型孔201的内表面)可涂覆有防粘层。
66.在本发明中，微针模具200是可商购获得的，例如其可以是商购自台州微芯医药科技公司的定制的pdms模具，模具参数可根据如上的针体尺寸的需要进行定制。具体地，在本发明实施例中所采用的微针模具200中，所有成型孔201的高度为600μm，底面宽度为320μm，尖端间距为500μm，微针模具200整体长
×
宽＝15mm
×
15mm。
67.(4)将由步骤(2)获得的混合溶液置于成型孔201中并填充成型孔201 容积的至少一部分。
68.在步骤(4)中，混合溶液填充成型孔201的容积量没有特别限制，但优选填充成型孔201容积量的至少1/4，至少1/3、至少1/2、至少2/3，至少 3/4，最优选填满成型孔201。在不填满成型孔201的情况下，成型孔201容积的未被微针110填充的部分应当在以下步骤(6)中被背衬材料溶液所填充。
69.(5)使在成型孔201中的包含基体材料和重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液的混合溶液进行交联和/或干燥固化，从而在成型孔201内形成微针110，多个微针110构成重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列。
70.(6)在微针110的底端表面和微针模具200的未被微针110遮盖的上表面202上施加包含背衬材料的溶液以形成背衬溶液层，从而重组亚单位肺部相关病毒微针疫苗阵列附着于背衬溶液层。
71.在步骤(6)中，如上文关于本发明的亚单位微针疫苗制品100的部分的，背衬材料优选选自聚乙二醇双丙烯酸酯、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们中的两种或更多种的混合物，优选透明质酸。
72.(7)将由步骤(6)获得的背衬溶液层和任选同时将附着于背衬溶液层的微针阵列进行干燥固化形成亚单位微针疫苗制品100。
73.在如上步骤(6)和(7)中，干燥步骤优选使微针110和背衬120中的水含量低于20％，优选低于10％，最优选低于5％。
74.实施例三
75.实施例一制得的亚单位微针疫苗与实施例二亚单位微针疫苗的制备方法在制备预防肺炎的医疗装置和药物中的应用。
76.在本实施例中，亚单位微针疫苗及其制备方法方面描述的技术特征及其优选范围
仍然适用。
77.试验测试
78.选取体重大致为40g的健康小鼠70只，随机分为10组，每组7只，通过对照组与试验组对小鼠进行感染试验，其中试验组的5组小鼠分别施用实施例四制备的微针疫苗，对照组的5组小鼠分别使用空白微针，空白微针为不含此发明中微针疫苗的重组亚单位制剂，进行实验。
79.将小鼠胸部毛发刮净，并将微针疫苗以及空白微针分别附于其胸部。在疫苗贴附7天后，将微针贴片取下，并向小鼠感染模拟病毒。通过elisa测单抗的ec50，从而判断小鼠感染情况。
80.使用上述微针肺部相关病毒疫苗制品与空白微针进行小鼠实验，将微针贴片贴于小鼠肺部所在位置对应点的外皮上，向小鼠感染模拟病毒。
[0081][0082][0083]
因此，本发明采用上述一种重组亚单位微针疫苗及其制备方法和应用，通过负载在微针中含有重组亚单位肺部相关病毒疫苗溶液，将该微针施用到皮肤后实现快速的免疫应答，达到肺部相关病毒疫苗的长效稳定释放以及高速反应。
[0084]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。