快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法

1.本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.凝胶是一种介于固体和液体间的形态，根据分散质点的性质及形成凝胶结构时质点间连接的特点，凝胶可分为弹性凝胶和非弹性凝胶。水凝胶是一种由高分子化合物溶液形成的弹性凝胶，它是以水为分散介质，能够吸收并保有大量水且具有交联网络结构，由亲水性的高分子化合物通过离子键、共价键、氢键等交联而成，并具有高分子电解质特性和三维结构。水凝胶有较高的含水量和较多的内部空隙结构，其相互联通的多孔结构为水、养分和药物等的运输提供了通道，为细胞的迁移和增殖提供了一个良好的环境，被认为是用于细胞和生物活性分子包封和传递的良好材料，可用于组织工程和细胞治疗等。
3.丝素蛋白是一种从蚕丝中所提取的天然高分子蛋白，其内部结构分为结晶区和非结晶区。反平行的β-折叠结构组成结晶区，无规则卷曲的结构则属于非结晶区，结晶区一般相对均匀的分散在非结晶区内，无定型区和微晶区中的分子链，顺着丝纤维长轴的方向有序排列，基于结晶区、非结晶区的交错存在和大分子的取向排列，蚕丝纤维拥有着良好的力学性能和柔和的光泽。而丝素蛋白的理化特性，则由氨基酸的排列次序影响分子构象从而决定其理化特性。丝素蛋白拥有着良好的物理机械性能、可调节的生物降解性以及优异的生物相容性。目前，丝素蛋白被广泛应用于组织工程、再生医学等领域。现有技术中，通过物理交联所制备出的丝素蛋白水凝胶凝胶慢，结构稳定性差，机械性能差；通过化学交联的方法所制备出的丝素蛋白水凝胶弹性较差，以上不足限制了丝素蛋白水凝胶在再生医学、组织工程等领域的应用。因此，寻找一种制备兼具优异机械性能和生物相容性的丝素水凝胶的方法，具有非常重要的意义。
4.中国专利申请号200910025440.1，公开日期为2012年07月25日，名称为“一种丝素蛋白水凝胶的制备方法”的专利中公开了一种丝素蛋白水凝胶的制备方法。上述方法中，将家蚕丝经脱胶、溶解、透析处理后得到质量浓度为1～30％的丝素蛋白溶液；接着，在37℃条件下进行超声波振荡处理，得到丝素蛋白水凝胶；最后，将处理过的丝素蛋白溶液倒入模具中，室温放置5分钟后得到丝素蛋白溶液。上述技术方案中，采用超声波振荡的方法制备丝素蛋白水凝胶，丝素蛋白分子在超声波的作用下发生物理交联，丝素蛋白形成β-折叠结晶结构，但所形成的丝素蛋白水凝胶的非常硬脆，强力和柔韧性不能满足后续高强高韧丝素材料的应用需求。
5.中国专利申请号201810662604.0，公开日期为2020年06月02日，名称为“双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用”的专利中公开了双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用。上述技术方案中，先将纤维素溶液、丝素蛋白溶液、环氧氯丙烷混合均匀，搅拌条件下使之交联得到交联溶液；将交联溶液离心脱气泡后倒入模具中，反应固化后得到低密度化学交联纤维素/丝素蛋白水凝胶；将得到的纤维素/丝素
蛋白水凝胶放置于二氧化碳培养箱中进行气氛物理交联；用流水冲洗，即可得到双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。上述技术方案虽可制得高强度水凝胶，但在制备过程中需使用碱溶液及有毒的有机溶液，制备过程复杂，且凝胶所需时间长。
6.有鉴于此，有必要设计一种改进的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种制备简单方便、凝胶速度快、机械性能强、弹性高的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法。
8.为实现上述发明目的，本发明提供了一种快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
9.s1、丝素溶液的制备：将脱胶处理后的蚕丝用去离子水清洗干净后，烘干处理后得到干蚕丝；将所述干蚕丝溶解并经透析处理，制得丝素蛋白溶液i；
10.s2、丝素蛋白基水凝胶的制备：向步骤s1中得到的所述丝素蛋白溶液i中加入交联剂进行化学交联，得到经过化学交联的丝素蛋白溶液ii，再将所述丝素蛋白溶液ii与明胶溶液混合均匀得到混合液iii；将所述混合液iii在低温条件下静置，得到丝素蛋白/明胶水凝胶。
11.优选地，所述快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法还包括如下步骤：
12.s3、将步骤s2得到的所述丝素蛋白/明胶水凝胶依次浸泡于(nh4)2so4溶液和去离子水中，得到丝素蛋白基水凝胶。
13.优选地，所述(nh4)2so4溶液的质量分数为10～20％。
14.优选地，所述丝素蛋白/明胶水凝胶浸泡在(nh4)2so4溶液中的时间为10～12h。
15.优选地，所述丝素蛋白溶液i的质量分数为5～10％，所述明胶溶液的质量分数为5～20％。
16.优选地，所述丝素蛋白溶液ii与所述明胶溶液混合的体积为(1～2)：(0.5～2)。
17.优选地，所述透析处理的温度为0～4℃，时间为24～72h。
18.优选地，在步骤s2中，所述低温条件为0～4℃，在所述低温条件下静置的时间为3～10min。
19.优选地，所述交联剂为mes、nhs以及edc中的一种或几种。
20.优选地，在步骤s3中，所述丝素蛋白/明胶水凝胶在去离子水中的浸泡时间为24h～96h。
21.本发明的有益效果是：
22.1、本发明提供的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，通过以明胶和丝素蛋白为原料经共混、化学交联以及低温处理等工艺制备了双交联高强力的具有三维交联网状结构的水凝胶，与现有技术中制备水凝胶的过程相比，本发明极大缩短了凝胶化所需时间，只需3min即可实现凝胶化，且制得的水凝胶具有机械性能强、弹性高以及生物相容性好的特性。
23.2、本发明提供的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，通过调整实验条件来实现对水凝胶的力学强度的调控，以实现凝胶的可控制备，满足了实际需要中对不同
力学强度水凝胶的需求；充分利用盐溶液对丝素蛋白和明胶的结构进行调控，提升了制得水凝胶的机械性能，使水凝胶更能满足应用需求；通过先对丝素蛋白进行化学交联后再与明胶进行物理交联，实现了丝素蛋白与明胶之间的结合，同时，将化学交联和非共价物理交联相结合，可有效实现高性能与可控性的一体化制备。
24.3、本发明提供的快速凝胶丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，通过调整交联方式和实验过程中使用的两组分的比例含量来实现对水凝胶的力学强度的调控，实现了凝胶的可控制备，满足了实际需要中对不同力学强度的水凝胶的需求，具有快捷、制备条件温和、制备工艺简单的优势，在高强功能化水凝胶的可控制备中具有重要意义。
附图说明
25.图1为本发明的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法的实施例1制得的水凝胶的sem图；
26.图2为实施例2制得的水凝胶的sem图；
27.图3为对比例2制得的水凝胶的sem图；
28.图4为对比例3制得的水凝胶的sem图；
29.图5为本发明的实施例1至2及对比例1至3制得的水凝胶的应力-应变曲线图。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
31.在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
32.另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
33.本发明提供的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
34.s1、丝素溶液的制备：将脱胶处理后的蚕丝用去离子水清洗干净后，在60℃环境下烘干处理，得到干蚕丝；将上述干蚕丝溶解并经透析处理，制得丝素蛋白溶液i；
35.s2、丝素蛋白基水凝胶的制备：向步骤s1中制得的丝素蛋白溶液i中加入交联剂进行交联处理，得到经过化学交联的丝素蛋白溶液ii，再将丝素蛋白溶液ii与明胶溶液混合均匀得到混合液iii；将混合液iii在低温条件下静置后，制得丝素蛋白/明胶水凝胶。
36.s3、将步骤s2得到的丝素蛋白/明胶水凝胶依次浸泡于(nh4)2so4溶液和去离子水中，制得丝素蛋白基水凝胶。
37.其中，在步骤s1中，脱胶处理包括如下步骤：
38.s11、将100g桑蚕丝浸入5l质量分数为0.1％的碳酸钠溶液中，于98～100℃的环境下煮沸处理30min，每次煮沸后将蚕茧取出并用去离子水洗净；
39.s12、将步骤s1中洗净的蚕茧加至新配置的5l质量分数为0.1％的碳酸钠溶液中，
于98～100℃的环境下煮沸处理30min，重复上述步骤三次。
40.具体地，在步骤s1中，透析处理处理的温度为0～4℃，时间为24h～72h；丝素蛋白溶液i的质量分数为5～10％，烘干处理的时间为72h。
41.具体地，在步骤s2中，化学交联的时间为5～10min；丝素蛋白溶液ii与明胶溶液按体积比(1～2)：(0.5～2)混合均匀。
42.其中，步骤s2还需将混合液iii注入模具中，再将模具置于0～4℃的低温条件下静置3～10min，制得丝素蛋白/明胶水凝胶。
43.其中，在步骤s2中，加入的交联剂为脂肪酸甲酯磺酸盐(mes)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)以及二氯乙烷(edc)中的一种或几种；明胶溶液的质量分数为5～20％。
44.具体地，在步骤s3中，(nh4)2so4溶液的质量分数为10～20％，丝素蛋白/明胶水凝胶浸泡于(nh4)2so4溶液中的时间为10～12h，采用的(nh4)2so4溶液的体积为100ml，丝素蛋白/明胶水凝胶浸泡于去离子水中的时间为24～96h。
45.实施例1
46.将100g蚕丝浸入5l质量分数为0.1％的碳酸钠溶液中，于98～100℃的环境下煮沸处理30min，每次煮沸后将蚕茧取出并用去离子水洗净；然后，再将洗净后的蚕茧加入5l质量分数为0.1％的碳酸钠溶液中，重复上述步骤三次，直至使蚕茧脱胶，用去离子水充分洗涤，在60℃条件下，于烘箱中干燥处理72h即得到纯丝素纤维。
47.接着，取5g上述制得的纯丝素纤维溶于25ml溴化锂溶液中，得到质量分数为5％的丝素蛋白溶液，再在4℃将丝素蛋白溶液透析处理72h；透析结束后，向丝素蛋白溶液中加入丝素蛋白溶液质量的20％的mes、丝素蛋白溶液质量的20％的nhs以及丝素蛋白溶液质量的10％的edc作为交联剂进行化学交联，交联时间为5min，得到交联后的丝素蛋白溶液；然后，向上述经交联处理后的丝素蛋白溶液中加入质量分数为10％的明胶溶液，丝素蛋白溶液与明胶溶液的体积比为1：1，混合均匀后，将混合液注入模具中，并放入冰箱中，在4℃的条件下静置3min，制得丝素蛋白/明胶水凝胶；最后，将制得的丝素蛋白/明胶水凝胶浸泡于质量分数为15％的100ml(nh4)2so4中12h，以增强水凝胶的机械性能，浸泡处理后将所得水凝胶浸泡于去离子水中72h除去水凝胶内部和表面吸附的(nh4)2so4，制得丝素蛋白基强力水凝胶，制得的水凝胶的sem图如图1所示，从图中可以看到水凝胶呈三维孔状结构，孔尺寸均匀而密集。
48.实施例2
49.实施例2与实施例1的区别仅在于：制得的丝素蛋白/明胶水凝胶不经(nh4)2so4溶液中浸泡处理，其余步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。制得的水凝胶的sem图如图2所示，从图中可以看到水凝胶呈三维孔状结构，孔尺寸均匀，与实施例1制得的水凝胶相比，孔尺寸有所增大。
50.对比例1
51.对比例1与实施例1的区别仅在于：丝素蛋白溶液经mes/nhs/edc进行化学交联后直接在4℃冰箱中冷冻处理3min，得到丝素蛋白水凝胶，其余步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。
52.对比例2
53.对比例2与实施例1的区别仅在于：将制得的丝素蛋白溶液直接与明胶溶液按体积
比1：1进行混合，得到丝素蛋白溶液与明胶溶液的混合液，然后将上述混合液加入注入模具中，并在4℃冰箱中冷冻处理10min，其余步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。制得的水凝胶的sem图如图3所示，从图3可以看到水凝胶内部呈三维孔状结构，孔尺寸大小均匀且孔结构密集。
54.对比例3
55.对比例3与实施例1的区别仅在于：直接将制得的丝素蛋白溶液注入到模具中，在60℃的条件下，于烘箱中烘干处理72h，其余步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。制得的水凝胶的sem图如图4所示，从图4可以看到水凝胶内部呈三维孔状结构，孔尺寸分布不均匀，且在镜头视野内可以观测到材料内部出现裂痕；实施例1至2及对比例1至3制得的水凝胶的应力应变曲线如图5所示，从图中可以看到应用实施例1中的方法制得的水凝胶具有最高的强度，对比例2和对比例3中水凝胶的强度几乎为0。
56.实施例3至7
57.实施例3至7与实施例1的区别仅在于：经化学交联的丝素蛋白溶液与明胶溶液的体积比设置不同，其余步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述，不同体积比下制得的丝素蛋白/明胶水凝胶的强度如表1所示：从表中数据可以看出，当化学交联后的丝素蛋白溶液与明胶溶液的体积比为1:1时，制得的水凝胶具有最高的强度。
58.表1实施例3-7的体积比设置及该条件下制得的丝素蛋白/明胶水凝胶的强度
[0059][0060]
实施例8至12
[0061]
实施例8至12与实施例1的区别仅在于：丝素蛋白溶液的质量分数与明胶溶液的质量分数设置不同，其余步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述，不同质量分数比下制得的丝素蛋白/明胶水凝胶的强度如表2所示：从表中数据可以看出，当丝素蛋白溶液与明胶溶液二者的质量分数为5％：10％时，制得的水凝胶具有最高的强度。
[0062]
表2实施例8-12的质量分数设置及该条件下制得的丝素蛋白/明胶水凝胶的强度
[0063][0064]
下面对丝素蛋白基水凝胶的形成机理进行说明：
[0065]
交联剂存在条件下，丝素蛋白的残基与交联剂发生反应，促使纤维蛋白与交联剂之间以化学键的方式结合；然后，向经过化学交联的丝素蛋白溶液中加入明胶溶液，并在低温条件下静置，在低温条件下丝素蛋白从无规则结构向β-折叠结构转变，同时，丝素蛋白溶液与明胶溶液之间互相穿插形成大分子结构，在上述两种作用下，可快速实现凝胶化，制得丝素蛋白/明胶水凝胶；当将丝素蛋白/明胶水凝胶浸泡于(nh4)2so4溶液中时，由于(nh4)2so4可诱导水凝胶内发生链缠结、疏水作用以及水凝胶网络中的微相分离区域，由此促使水凝胶的机械性能得到提升。
[0066]
本领域技术人员应当理解，(nh4)2so4的质量分数还可以为10％或20％，此处不以此为限，只需根据实际需要设置即可。
[0067]
综上所述，本发明提供的快速凝胶的丝素蛋白基强力水凝胶的制备方法，以明胶和丝素蛋白为原料经共混、化学交联以及低温处理等工艺制备了双交联高强力的具有三维交联网状结构的水凝胶，制得的水凝胶具有机械性能强、弹性高的特性；通过调整实验条件实现对水凝胶的力学强度的调控，以实现凝胶的可控制备，满足了实际需要中对不同力学强度的水凝胶的需求；充分利用盐溶液对丝素蛋白和明胶的结构的影响，进一步提升了制得的水凝胶的机械性能，使水凝胶更适于应用；通过将化学交联和非共价物理交联相结合，有效地实现了高性能与可控性的一体化。与现有技术中制得水凝胶的方案相比，本发明可实现快速凝胶化，水凝胶的形成只需3min，同时，本发明提供的方法还具有原料来源广、制备条件温和绿色、快捷以及制备工艺简单的优势，在高强功能性水凝胶的可控制备中具有重要意义。
[0068]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。