一株芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.微生物诱导矿化作用(microbial induced carbonate precipitation，micp)，是指利用微生物诱导环境中钙离子沉淀为碳酸钙的矿化过程，具有巨大的现实应用潜在，具体应用例如：重金属离子污染治理、放射性核素的修复、混凝土裂缝修复、砂土地基抗液化、石质文物覆膜、防风固沙等等。
3.微生物矿化技术的关键在于微生物。部分微生物可以自身分泌脲酶，从而分解尿素以生成碳酸根。生成的碳酸根再与自然界游离的钙离子结合，从而生成具有胶结性的沉淀物质。但现有研究所提供的这类微生物，存在诸多应用限制：(1)一种微生物难以满足多种材料的修复需求；(2)钙矿化或修复效率不理想，无法满足修复需求；(3)环境适应能力不强，在极端温度、ph、重金属存在等环境中，无法良好生存或即使生存也无法发挥修复效果；在新的环境中，生长对数期短，快速繁殖时间短。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株芽孢杆菌及其应用。
5.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一株芽孢杆菌(bacillus sp.)，于2021年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23446。
6.相应的，所述芽孢杆菌在重金属离子污染治理中的应用。
7.优选的，所述重金属为镍、铅中的一种或两者混合。
8.相应的，所述芽孢杆菌在产脲酶中的应用。
9.相应的，所述芽孢杆菌在诱导环境中的钙离子沉积中的应用。
10.优选的，所述应用包括含钙离子的土地、石块、地基、混凝土修复。
11.优选的，所述应用包括石质文物覆膜、防风固沙。
12.相应的，一种含所述芽孢杆菌的混凝土修复材料，材料包括：载有所述芽孢杆菌的膨胀珍珠岩、水泥、骨料、石砂、硅灰、所述芽孢杆菌的菌液、水、尿素、氯化钙、减水剂。
13.相应的，一种所述芽孢杆菌的石灰岩修复材料，材料包括：所述芽孢杆菌的菌液、cacl2、尿素、葡萄糖。
14.相应的，一种所述芽孢杆菌的大理石修复材料，材料包括：所述芽孢杆菌的菌液、cacl2、co(nh2)2、白云石砂。
15.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种全新的芽孢杆菌，具有极强的环境适应能力，可以在极端温度环境、ph环境和高含量重金属环境下良好生存，并具有高产高活性脲酶能力，钙矿化/沉钙效率高，达到平均97.66％，工业应用前景大。
附图说明
16.图1为本发明提供的ml-1菌株的电镜扫描图；
17.图2为本发明提供的ml-1菌株更大尺寸的电镜扫描图；
18.图3为本发明提供的ml-1菌株的系统发育树；
19.图4为ml-1菌株与模式菌株生长情况对比示意图；
20.图5为ml-1菌株与模式菌株产生脲酶活性对比示意图；
21.图6为ml-1菌株产脲酶活性随时间变化示意图；
22.图7为ml-1菌株钙矿化沉积物衍射分析示意图；
23.图8为ml-1菌株沉淀的碳酸钙扫描电镜图(2000倍)；
24.图9为ml-1菌株沉淀的碳酸钙扫描电镜图(5000倍)。
具体实施方式
25.本发明提供了一株芽孢杆菌属(bacillus sp.)ml-1菌株，于2021年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号cgmcc no.23446。所述芽孢杆菌具有高产脲酶活性，能快速矿化钙离子并将其转化为碳酸钙。所述芽孢杆菌环境适应能力极强，在0～50℃、ph为5～12、高重金属含量等各类极端环境下均可存活并可产脲酶。优选的生存环境为20～35℃、ph为6～9。所述芽孢杆菌对数生长期也极长，可快速大量增殖，非常适合工业化推广应用。
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
27.实施例使用培养基包括：
28.液体富集nbu培养基：每1000ml水中含有蛋白胨5g/l、牛肉膏1.5g/l、yeast extract 1.5g/l、氯化钠5g/l、pb
2
100mg/l、氯化镍0.01g/l、氯化铵10g/l、尿素20g/l、ph＝7.0。
29.重金属固体培养基：蛋白胨5g/l、牛肉膏1.5g/l、yeast extract1.5g/l、氯化钠5g/l、尿素20g/l、pb
2
100mg/l、琼脂20g/l、ph＝7.0。
30.产脲酶筛选培养基：蛋白胨1g/l、氯化钠5g/l、磷酸二氢钾2g/l、尿素20g/l、葡萄糖0.1g/l、酚红溶液(0.2％，质量分数)4ml/l、琼脂20g/l、ph＝7.0。
31.所有培养基在使用前高温高压灭菌备用。使用1mol/l的稀盐酸和1mol/l的氢氧化钠调节ph。
32.实施例一：微生物的筛选、鉴定与保藏
33.1、微生物筛选。
34.(1)初筛。将来自湖南省郴州市矿山的土壤过20目～50目筛。在超净无菌操作台中称量过筛土壤样品1g，加入5ml无菌水振荡、搅拌均匀呈悬液状，置室温下静止4h。将吸取1ml所述悬液状土壤样品的上清液，接种到重金属固体培养基中，30℃培养72h，培养过程中定期观察菌落生长状况。培养完成后，获得数个单菌落，完成初筛。
35.(2)复筛。将初筛获得的单菌接种至产脲酶筛选培养基上进行复筛，以模式菌(巴
氏芽孢八叠球菌，保藏编号：atcc 11859)作参照，30℃下避光培养，根据产脲酶筛选培养基的变色情况(培养基由无色变为紫色，证明有产脲酶能力)，判定脲酶的产生从而选出耐重金属的脲酶高产菌株，命名为菌株ml-1。
36.2、菌株生理生化特征鉴定。在显微镜下观察ml-1菌株，发现该菌株在细胞内形成的一个圆形或椭圆形的芽孢，生成的芽孢壁厚、含水量低、抗逆性强，菌落边缘不整齐，淡黄色，色素不扩散。该细菌具有很强的环境抵抗性，在0～50℃、ph为5～12、高重金属含量等各类极端环境下均可存活并可产脲酶。菌株呈杆状，1.2～1.9μm长，0.5μm～1.0μm宽，电镜照片如图1、2所示；革兰氏染色为阳性。其生理生化特征如表1所示。
37.表1ml-1菌株生理生化鉴定结果对照表
[0038][0039]
3、菌株序列分析鉴定。取复筛培养结果细菌悬液2ml于无菌离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，取下部沉淀用于分析菌株基因组。序列分析采用细菌全基因组抽提试剂盒(北京擎科生物科技有限公司成都分公司)，提取上述纯菌株的全基因组。以通用引物擎科1
×
tse101金牌mix进行纯化菌株全基因组16s rdna序列扩增。对扩增的pcr产物进行纯化处理，用琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计检测浓度与纯度合格后进行测序分析。
[0040]
将所得16s rrna基因序列在genebank进行序列同源性比较。结果显示纯化菌株为芽孢杆菌属(bacillus sp.)，与bacillus sp.(in:bacteria)stain fjat-25528、bacillus acidinfaciens、bacillus acidinfaciens stain 3-2-2、bacillus freudenreichii stain nctc4823、lowg c gram-positive bacterium sscs10、lowg cgram-positive bacterium sscs20等同源性较高。在mega7.0中用邻近加入算法进行聚类分析并构建系统发育树，结果如图3所示。鉴定纯化菌株是一种芽孢杆菌属(bacillus sp.)的新菌株，命名为ml-1菌株。
[0041]
将该微生物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌保中心，邮编100101；保藏日期2021年9月18日，保藏编号cgmcc no.23446。
[0042]
4、在相同条件下(30℃、150rpm，产脲酶筛选培养基)培养ml-1菌株和模式菌株巴氏芽孢八叠球菌(sporosarcinapasteurii)。模式菌株在12h进入平台期，而ml-1菌株的对数生长期特别长，在72h左右才进入平台期(如图4所示)，说明ml-1菌株的生长能力特别强，远优于普通的芽孢杆菌，在实际应用中能保持较长时间的快速大量增殖。
[0043]
5、测试ml-1菌株产生脲酶的活性，测试方法为苯酚钠-次氯酸盐比色法。结果如图
5所示。结果显示：该菌株的脲酶活性与巴氏芽孢杆菌接近，而巴氏芽孢杆菌的活性远高于其他微生物(现有已知微生物产脲酶的活性如表2所示)，证明ml-1产生的脲酶活性也高于大部分普通微生物。
[0044]
表2一般微生物产脲酶的活性对照表
[0045][0046][0047]
将培养有ml-1菌株培养基保存在室温、避光环境，每隔5天测一次脲酶活性，结果如图6所示。一直到30天左右，脲酶活性依然保持较高水平。
[0048]
实施例二：ml-1菌株的钙矿化培养
[0049]
1、将实施例一获得的纯化好的ml-1菌株接种在液体富集nbu培养基中，30℃、150rpm恒温振荡培养24h，培养至对数期(od
600
＝1.0)，获得种子液。在无菌操作台吸取10ml种子液在4℃、8000rmp离心5min，在无菌操作台倒掉上清液，加入10ml高温灭菌后的纯净水，涡旋3min后，吸取2ml，接种至含有0.25mol/l cacl2的60ml液体富集nbu培养基中，设置3个平行，空白对照组菌液用纯净水代替，在30℃、150rpm恒温振荡培养条件下培养4d。
[0050]
5d后，用移液器吸取5ml菌株培养液至10ml离心管中，使用ph计读取菌株培养液ph值。再将装有菌液的离心管在离心机下5000rpm离心3min，经0.22μm滤膜过滤获取上清液，原子吸收光谱仪测定上清液中钙离子含量。结果如表3所示。
[0051]
表3培养液钙离子和ph变化情况对照表
[0052]
[0053][0054]
2、将步骤(1)钙矿化培养5d结束后的实验组锥形瓶中菌液在4℃、10000rpm离心5min，用纯净水洗涤两次后，放入55℃烘箱干燥，进行矿物学和晶体形态分析。
[0055]
使用x射线衍射仪(x-ray diffraction，xrd)检测沉积物的矿物成分、元素组成分析及晶体形态特征。使用panalytic的x'pert系统对固体颗粒物样品衍射分析，扫描速率为8
°
/min，步长0.02
°
；用jade6软件分析衍射图。检测结果如图7所示，图7是ml-1菌株晶体xrd衍射图，图中下部竖线为标准方解石卡片。结果表明：检测样品为碳酸钙，且以方解石结构存在。
[0056]
对ml-1菌株产生的碳酸钙晶体进行扫描电镜(scanning electron microscope，sem)观察。将干燥的晶体粉末安装在铝短棒上，在10kv下用扫描电子显微镜观察涂层样品。ml-1菌株沉淀物主要是方解石晶体。晶体表面粗糙，直径在10μm～80μm之间。结果如图8、9所示。图8、9是ml-1菌株沉淀的碳酸钙扫描电镜图，图8是放大倍数2000电镜图，图9是放大倍数5000电镜图。
[0057]
结果显示：芽孢杆菌属(bacillus sp.)ml-1菌株在培养过程中促成了钙离子矿化，诱导形成了碳酸钙晶体。培养过程中，培养液逐渐变为碱性，也更利于碳酸钙晶体形成。
[0058]
实施例三：ml-1菌株的生长和耐受环境测试
[0059]
1、ml-1菌株生长和耐受温度测试。将纯化好的ml-1菌株接种在液体富集nbu培养基中，30℃、150rpm恒温振荡培养24h，培养至对数期(od
600
＝1.0)，获得种子液。在无菌操作台吸取10ml种子液在4℃、8000转离心5min后在无菌操作台倒掉上清液加入10ml高温灭菌后的纯净水，涡旋3min后吸取2ml接接种至60ml液体富集nbu培养基中，设置3个平行，空白对照组菌液用纯净水代替，分别置于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃培养，150rpm恒温振荡培养条件下培养48h，试验重复3组。结束培养后，从培养物中取样，分光光度法检测样品中细菌浓度，并测试各组产脲酶的情况和脲酶活性。结果显示：ml-1菌株在0℃～45℃下生长良好，且能正常生产脲酶，20℃～35℃下生长更优，30℃为最适生长温度。
[0060]
2、ml-1菌株生长和耐受ph测试。将纯化好的ml-1菌株接种在液体富集nbu培养基中30℃、150rpm恒温振荡培养24h,培养至对数期(od
600
＝1.0)，获得种子液。在无菌操作台吸取10ml种子液在4℃、8000rpm离心5min，在无菌操作台倒掉上清液加入10ml高温灭菌后的纯净水，涡旋3min后吸取2ml接接种至ph＝3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的60ml液体富集nbu培养基中，每组设置3个平行，在30℃、150rpm恒温振荡培养条件下培养48h。结束培养后，从培养物中取样，分光光度法于检测样品中细菌浓度，并测试各组产脲酶的情况和脲酶活性。结果显示ml-1菌株在ph＝5～11下生长良好，且能正常生产脲酶，最适ph＝7。
[0061]
实施例四：利用ml-1菌株制备矿化沉积修复再生混凝土
[0062]
1、按重量份数，裂缝自修复再生混凝土原料包括：载有ml-1菌且已包裹表面的膨胀珍珠岩颗粒100份、水泥420份、再生粗骨料575份、天然石子575份、砂500份、硅灰24份、ml-1菌悬浮液(活菌浓度为5.5
×
107个/ml)23份、水202份、尿素8份、氯化钙8份、减水剂4份。减水剂使用业内常见减水剂例如木质素磺酸盐类化合物即可，本实施例使用的是木质
素磺酸钠。
[0063]
载有ml-1菌株且已包裹表面的膨胀珍珠岩颗粒的制备方法为：
[0064]
(1)载体制备：用1mol/l倍半碳酸钠无菌溶液(每升各组成成分含量：碳酸氢钠42g、无水碳酸钠53g)将上述液体富集nbu培养基的ph值调整为7.0，121℃高温灭菌20min，然后将ml-1菌种按常规方式接种至调节ph后的液体富集nbu培养基中，振荡培养48h，获得菌液。将所得菌液用离心机以转速8000rpm离心10min，获得菌泥。将菌泥在灭菌后的蒸馏水中重悬，然后稀释至菌液所含菌体浓度为5.5
×
107个/ml，再采用真空浸渍法将菌液浸渍到膨胀珍珠岩颗粒的表面和内部孔隙中，保证膨胀珍珠岩颗粒被充分浸渍。用干燥箱对上述吸附ml-1菌的膨胀珍珠岩在45
±
2℃下进行干燥。对干燥后的吸附ml-1菌的膨胀珍珠岩颗粒表面喷洒氯化钙和酵母膏混合溶液(每升各组成成分含量：蒸馏水1l、氯化钙7g、酵母提取物1g)，并对其进行45
±
2℃下的第二次干燥。
[0065]
(2)载体表面包裹：称取偏高岭土与相应的激发剂混合(二者质量比为1:1)，并对其拌合3～5min；其中，激发剂为浓度为15％(质量分数)的硅酸钠溶液。将拌合后的偏高岭土浆体添加到喷枪的料桶中，调节空压机的气压(压力设定为0.6mpa)，然后对载体颗粒表面的一侧进行喷涂。翻转载体颗粒，对颗粒表面另一侧进行喷涂，如此反复喷涂3次。将喷涂包裹完毕的载体颗粒在常温下干燥。
[0066]
2、基于ml-1矿化沉积的裂缝自修复再生混凝土的制备方法包括如下步骤：
[0067]
用水稀释ml-1菌株至活菌浓度为5.5
×
107个/ml，再按配方称取对应尿素加入菌液中，搅拌1min。再将表面已包裹的膨胀珍珠岩与30％重量份数的水投入搅拌机中，拌和30s后，再将水泥、天然石子、再生粗骨料、砂、硅灰、氯化钙、减水剂以及剩余重量份数的水均匀投入搅拌机中，搅拌1min。再将加有尿素的菌液倒入搅拌机中搅拌3min，加入到混凝土裂缝，室温下静置4h以上。即可实现混凝土裂缝的自修复。
[0068]
3、测试结果：将现场放置样块取回进行单轴拉伸试验，平均抗拉强度0.43mpa，填入部分色泽与原混凝土基本一致，相容性好，完全达到粘结效果。
[0069]
实施例五：利用ml-1菌株进行石灰岩裂缝修复
[0070]
按实施例四的方法制备ph为7.0的液体富集nbu培养基，将ml-1菌种接种至液体培养基中，30℃、150rpm摇床培养至od6
00
值大于1，获得菌液。配制0.25mol/l cacl2作为固定液；配制0.8mol/l尿素、0.25mol/l cacl2和0.5g葡萄糖的混合液作为胶结液。采用与待修复裂缝材料一致的、0.1mm～0.2mm(40目)单一级配的石灰砂作为填充材料。
[0071]
将准备好的石灰砂少量多次加入裂缝，每次加入石灰砂的同时，分别用蠕动泵泵入菌液、固定液和胶结液。加入顺序和方式为：先加入菌液，菌液泵入速度0.25ml/min，连续泵60min后菌液添加结束；纯净水洗涤蠕动泵管，防止产生沉淀，纯净水浸泡静置10min后，再以0.13ml/min注入固定液，连续泵10min；纯净水浸泡静置20min，再以0.13ml/min将胶结液加入裂缝中，连续泵60min后添加完毕。以上为一轮滴注，在3轮滴注后重新添加适量石灰砂填充，滴注15～20轮修复完成。
[0072]
现场试验效果：滴注18轮，将现场放置样块取回进行单轴拉伸试验，平均抗拉强度0.30mpa，其材料稳定性在进行冻融循环机中(-20
±
20℃)循环10次后取出，其质量损失率为15％，填入部分色泽与砂岩样块基本一致，相容性好，完全达到粘结效果。
[0073]
实施例六：利用ml-1菌株进行大理石裂缝修复
[0074]
按实施例四的方法制备ph为7.0的液体富集nbu培养基，将ml-1菌种按常规方式接种至液体培养基中，30℃、150rpm摇床培养48小时；菌液od
600
平均值为1.5，单体酶活平均值为6.8mm/min/od6
00
。配置0.25mol/lcacl2作为固定液，0.5mol/l的cacl2和0.5mol/l co(nh2)2混合溶液为胶结液。填充材料为白云石砂，颗粒粒径为0.10mm～0.25mm。
[0075]
为了提高样品均匀性，注浆方式为双向注浆，具体为：每两轮注浆后轮换一次注浆方式。每轮注浆：菌液35.3ml、固定液4.4ml、胶结液176.625ml。第一轮和第二轮修复注浆方向为从注射器底部到顶部，第三轮和第四轮四轮注浆从注射器顶部注入到注射器底部(泵驱动方向相反以实现反向注浆)，即完成大理石裂缝修复。
[0076]
现场试验效果：修复后的大理石的四点弯曲强度为6.30
±
3.63mpa，抗折强度均值为0.61mpa。
[0077]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。