一种与梅花鹿茸重性状相关的SNP分子标记及其检测引物、试剂盒和应用的制作方法

一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传学技术领域，尤其是涉及一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用。


背景技术：

2.甲硫氨酸亚砜还原酶b3(methionine sulfoxide reductase b3,msrb3)基因是msrb基因家族成员，是一种氧化还原酶，可特异性催化r-甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸(kwak gh等，2017)。msrb3是一种多效基因，在人体中可编码msrb3a和msrb3b两种类型的蛋白，前者位于内质网，后者位于线粒体(kim hy等，2004)。msrb3在衰老和应激耐受中起着关键作用，过表达人msrb3基因的果蝇家系表现出更长的寿命，也提高了其对氧化、冷和热应激的抵抗力(d.h.lim等，2012以及g.h.kwak等2012)。msrb3基因通过p53-p21和p27途径调节细胞生长，敲除该基因抑制小鼠胚胎成纤维细胞和人真皮成纤维细胞的增殖(lee e等，2014)。
3.此外，msrb3基因还可影响耳朵的形状和大小、听觉系统、海马体的大小。在关于畜禽的研究中，主要集中于msrb3基因影响耳型性状。gwas结果表明msrb3基因参与牛骨化和脂肪组织发育过程的调节。wu等发现msrb3基因存在3个插入缺失(insertions and deletions,indels)标记与我国黄牛生长性状显著相关。目前该基因与梅花鹿相关性状研究较少。
4.梅花鹿是最有价值的药用动物之一，其全身是宝，而以鹿茸最具盛名。鹿茸具有增强免疫力、改善性功能、抵抗衰老等作用，在中医临床方面起重要作用(杨洁等，2021；sui z等，2014)。因其较高的药用价值和经济价值，鹿茸产量受到了极大的关注。随着分子生物技术的发展，相关性状的分子标记已广泛应用于畜禽的遗传改良中，极大提高了育种效率，缩短育种周期。因此，有必要继续研究和开发与鹿茸产量性状相关的分子标记。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用。本发明发现msrb3基因上的一个snp位点基因多态性与梅花鹿茸重性状具有显著相关性。本发明可利用对所述snp位点的检测实现对梅花鹿的早期预测和筛选，可将高茸重与低茸重梅花鹿区分开来，可实现帮助选育高鹿茸产量的梅花鹿。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
8.在第一方面，本发明提供了一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记位于msrb3基因上，在g.44455582位存在t/c碱基突变。
9.本发明以梅花鹿为研究对象，应用直接测序法检测msrb3基因的多态性，通过snp分型技术分析基因型，并与鲜茸重性状进行关联分析。在g.44455582
位存在t》c碱基突变，应用于筛选具有高茸重的梅花鹿，为梅花鹿鲜茸重性状的选择提供了新的分子标记基础。
10.在第二方面，本发明提供了一种用于检测或预测梅花鹿茸重性状的引物，所述引物为用于扩增前述snp分子标记的引物组合；
11.优选地，所述引物组合包括pcr扩增引物和延伸引物，所述pcr扩增引物的核苷酸序列如seq id no.22和seq id no.23所示；所述延伸引物的核苷酸序列如seq id no.24所示。
12.在第三方面，本发明还提供了含有前述引物的试剂盒。本领域技术人员很容易根据本发明的分子标记设计出用于扩增该分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针。因此，本发明还包括用于扩增所述分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针以及含有所述引物或探针的试剂盒。
13.在一个实施方案中，所述试剂盒还包括dna聚合酶和pcr反应缓冲液。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包括dntps、mg
2
等。
14.在第四方面，本发明提供了一种snp分型芯片，所述snp分型芯片包含前述snp分子标记。
15.在第五方面，本发明提供了前述的snp分子标记在选育或辅助选育高茸重或低茸重梅花鹿中的应用。
16.在第六方面，本发明提供了前述引物或前述试剂盒在检测梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记中的应用，所述snp分子标记位于msrb3基因上，在g.44455582位存在t/c碱基突变。
17.在一个实施方案中，所述应用包括：使用前述的引物或前述的试剂盒检测梅花鹿在所述snp位点的基因型；选择具有优势等位基因型的梅花鹿进行繁殖或选育。
18.在第七方面，本发明提供了一种选育或辅助选育具有高鹿茸产量的梅花鹿的方法，所述方法包括：
19.(a)提取待测梅花鹿的基因组dna；
20.(b)以所述基因组dna为模板，利用扩增所述snp分子标记的特异性引物进行pcr扩增，获得含所述snp位点的pcr扩增片段；
21.(c)通过所述pcr扩增片段进行测序，确定所述pcr扩增产物的snp位点的基因型；
22.(d)选择基因型为tt型的梅花鹿进行留种或配种。
23.在一个实施方案中，对于基因型为tt的个体来说，其集中于茸重更重的分类；对于基因型为cc或ct的个体而言，其集中于茸重更轻的分类。该snp分子标记与梅花鹿关联分析显示具有显著水平，表明该标记与梅花鹿的茸重(鲜茸重)性状显著关联。当所述snp位点的基因型是tt时，表明梅花鹿个体具有高茸重性状；当所述snp位点的基因型是cc或ct时，表明梅花鹿个体具有低茸重性状。当需要筛选和培育高茸重品系时，选择tt基因型进行筛选和育种。
24.在一个实施方案中，所述高鹿茸产量为产出的鹿茸重量具有显著更高水平，所述鹿茸产量优选为二杠茸产量。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
26.我国梅花鹿育种长期以来主要通过表型选择，然而鹿茸生长受年龄因素影响较
大，生茸公鹿一般需要到5岁龄才能定产，育种周期长、育种效率较低、遗传进展缓慢。分子育种通过相关性状的分子标记进行选择，能够实现早期选种，提高育种效率。然而，鹿茸产量性状相关的可靠的分子标记十分有限，本发明进行梅花鹿产茸性状相关基因及分子标记的研究，提供了一种新的snp分子标记，本发明的snp位点位于梅花鹿msrb3基因内含子上，发现该位点的多态性与产茸性能显著正相关，尤其是二杠茸产量显著相关。通过对与梅花鹿鲜茸重相关的snp分子遗传标记进行检测和分析，能简单、高效的根据突变位置的基因型来帮助预测和筛选具有高鹿茸产量的品种或个体。
27.本发明设计了用于扩增所述snp分子标记的引物和检测试剂盒；进一步提高了筛选分子标记的准确率和效率，为高鹿茸产量品种的选育提供可靠的工具。本发明通过提供了新的snp分子标记，为鹿茸高产性状的标记辅助选择做出来贡献，结合本发明的分子标记与其他分子育种方法一起可进一步更全面的实现鹿茸产量性状的早期筛选和预测。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为msrb3基因pcr扩增结果(m为dl2000 dna maker，2-6：msrb3基因第2-6外显子)；
30.图2为snps位点测序结果(g.44455759c》t)；
31.图3为snps位点测序结果(g.44455582t》c)；
32.图4为snps位点测序结果(g.44414424t》c)；
33.图5为snps位点测序结果(g.44350306t》c)；
34.图6为snps位点测序结果(g.44340734g》c)；
35.图7为snps位点测序结果(g.44340836g》a)；
36.图8为snps位点分型结果(g.44455759c》t)；
37.图9为snps位点分型结果(g.44455582t》c)；
38.图10为snps位点分型结果(g.44414424t》c)；
39.图11为snps位点分型结果(g.44350306t》c)；
40.图12为snps位点分型结果(g.44340734g》c)；
41.图13为snps位点分型结果(g.44340836g》a)；
42.图14为梅花鹿msrb3基因snps连锁不平衡分析。
具体实施方式
43.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂
或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
45.实施例
46.1.材料与方法
47.1.1试验动物
48.在吉林长春东大鹿场选择24月龄饲养条件一致的梅花鹿公鹿314头作为研究对象。静脉采血后，经乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,edta)抗凝处理，冷冻保存备用。称量生长天数45天左右的二杠茸重量并记录数据。
49.1.2主要试剂
50.血液dna提取试剂盒、fastpfu pcr supermix(-dye)均购自北京全式金生物技术有限公司；2
×
es taq mastermix(dye)购自北京康为世纪生物科技有限公司；dna marker、6
×
loading buffer、10
×
loading buffer均购自takara公司。
51.1.3 dna提取与引物合成
52.参照梅花鹿基因组中msrb3基因序列，运用ncbi中的primer-blast设计引物，扩增产物包含全部外显子和部分内含子序列，引物序列如表1所示。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
53.按照dna提取试剂盒说明书，提取梅花鹿血液中的dna样本，用nanodrop 2000检测所提取dna的纯度和浓度，并用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测dna完整性，将质量合格的dna样品保存备用。
54.表1.梅花鹿msrb3基因的引物序列
[0055][0056]
注：msrb3-2为msrb3基因的第2外显子(扩增产物包含内含子序列)，其余引物同理。
[0057]
1.4 pcr扩增及测序分析
[0058]
选取高、低产梅花鹿(高产茸重均在1500g以上；低产茸重均在900g以下)各8头，以其血液dna作为模板进行pcr扩增。pcr体系共25μl：2
×
es taq mastermix 12.5μl，上、下游引物各0.5μl，dna模板1μl，ddh2o补充至25μl。
[0059]
pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(各引物退火温度见表1)30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。pcr产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。应用chromas 2.0软件完成测序峰图分析；应用dnaman软件完成序列比对分析。
[0060]
1.5基因分型
[0061]
对测序结果中的突变位点利用技术进行分型分析，该步骤交由北京阅微基因技术股份有限公司完成，相关分型引物信息如表2所示。
[0062]
表2.snps引物信息表
[0063][0064]
其中，n为单碱基延伸引物。
[0065]
1.6统计分析
[0066]
利用excel 2019、spss 25.0 statistics统计软件整理试验数据，并进行等位基因频率、基因型频率和遗传多样性参数：观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、有效等位基因数(ne)和多态信息含量(pic)，运用χ2适合性检验是否符合hardy-weinberg平衡定律。利用haploview 4.2软件进行单倍型分析。运用一般线性模型(general linear model,glm)分
析snp突变位点基因型以及不同单倍型与茸重性状的相关性，结果用“平均值
±
标准误”表示，以p《0.05为差异显著性判断标准。
[0067]
2.实验结果
[0068]
2.1 msrb3基因pcr扩增结果
[0069]
本试验以梅花鹿血液dna为模板，扩增msrb3基因外显子，结果如图1所示，扩增结果符合预期。图1为msrb3基因pcr扩增结果。
[0070]
2.2测序验证
[0071]
通过对pcr扩增产物进行测序后发现，msrb3基因共存在6个外显子，g.44340734g》c和g.44340836g》a位点位于外显子6，且突变未引起氨基酸改变，属于同义突变。g.44455759c》t、g.44455582t》c、g.44414424t》c和g.44350306t》c位点分别位于内含子1、内含子2、内含子4和内含子5上。图2-图7为snps位点测序结果。
[0072]
2.3质谱分型
[0073]
分型结果显示，4个样本未分型成功，其余310个样本可做后续分析。6个位点均存在aa、ab和bb三种基因型，见图8-图13。
[0074]
2.4梅花鹿msrb3基因多态性分析
[0075]
梅花鹿msrb3基因各位点基因型频率、基因频率、相关遗传多样性参数及卡方合适性检验结果见表3。
[0076]
由多态信息含量(pic)可知，g.44340734g》c属于低度多态(pic《0.25)，而其余位点均属于中度多态(0.25《pic《0.5)。经卡方适合性检验得知，梅花鹿msrb3基因的g.44455759c》t位点不符合hardy-weinberg平衡状态(p《0.05)，其余位点均处于hardy-weinberg平衡状态(p》0.05)。
[0077]
表3.梅花鹿msrb3基因snps位点的群体遗传学分析
[0078][0079][0080]
注：0.25《pic《0.5为中度多态，pic《0.25为低度多态；χ2-0.05＝5.99，χ2-0.01＝9.21
[0081]
2.5 msrb3基因多态性与梅花鹿茸重性状的关联分析
[0082]
msrb3基因6个snps的多态性与梅花鹿茸重性状的关联分析结果见表4(剔除群体数量低于5％的基因型)。结果显示，g.44455582t》c位点的tt基因型茸重极显著高于cc和ct基因型(p《0.01)，可用于梅花鹿茸重性状的选育。而其余各基因型之间茸重差异均不显著(p》0.05)。
[0083]
表4.梅花鹿msrb3基因snps位点各基因型与茸重性状的关联分析
[0084][0085][0086]
注：同一snp位点不同基因型个体比较，不同大写字母表示差异极显著(p《0.01)，无字母表示差异不显著(p》0.05)。
[0087]
2.6 msrb3基因单倍型与梅花鹿茸重性状的关联分析
[0088]
对梅花鹿群体msrb3基因6个snps位点连锁不平衡和单倍型分析，结果见图14。msrb3基因g.44340734g》c和g.44350306t》c、g.44455582t》c和g.44455759c》t位点之间处于强连锁不平衡状态(d
′
》0.96,r2》0.72)。
[0089]
通过连锁不平衡分析，block1和block2区块各存在3种单倍型，分别为gg、ga、ca和ct、tc、cc。运用spss 25.0软件分析梅花鹿msrb3基因单倍型与茸重性状的相关性，结果见表5。block1区块的3种单倍型与茸重性状差异不显著(p》0.05)。block2区块中单倍型tc茸重显著高于单倍型ct(p《0.05)。
[0090]
表5.msrb3基因单倍型对梅花鹿茸重的影响
[0091][0092]
同列数据不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，无字母或相同字母标注表示差异不显著(p》0.05)。
[0093]
本发明通过直接测序法对梅花鹿msrb3基因的snp进行检测，筛选出6个snps位点g.44455582t》c、g.44455759c》t、g.44414424t》c、g.44350306t》c、g.44340734g》c和g.44340836g》a，优势等位基因分别为c、c、t、t、g和g，各位点均产生3种基因型，优势基因型分别为cc、ct、tt、tt、gg和gg。其中g.44340734g》c和g.44340836g》a位于外显子6，属于同义突变。与g.44340734g》c位点相比，g.44455582t》c、g.44455759c》t、g.44414424t》c、g.44350306t》c和g.44340836g》a等5个位点的杂合度和有效等位基因数更高，说明这5个位点的遗传变异更为丰富，等位基因分布更均匀。g.44340734g》c位点的多态信息含量为0.1486属于低度多态(pic《0.25)，而其他5个位点其余位点均属于中度多态(0.25《pic《0.5)，说明该群体有较丰富的遗传基础，具有一定的选择潜力。卡方检验结果表明，g.44455759c》t位点在该群体中不处于hardy-weinberg平衡状态(p《0.05)，可能受到遗传漂变及人工选育的影响，而其他5个位点未受影响，处于hardy-weinberg平衡状态(p》0.05)。单倍型分析结果显示，msrb3基因g.44340734g》c和g.44350306t》c、g.44455582t》c和g.44455759c》t位点存在强连锁，各产生3种单倍型。将msrb3基因各位点产生的基因型和单倍型与梅花鹿茸重性状进行关联分析，结果显示g.44455582t》c位点的tt基因型个体的茸重极显著高于cc和ct基因型个体(p《0.05)，表明该突变位点对梅花鹿茸重有极显著影响。本群体中g.44340734g》c位点的cc基因型个体的数量较少，仅2个个体，该位点对茸重性状的影响还需进一步验证，其余位点各基因型个体之间茸重差异均不显著(p》0.05)。g.44455582t》c和g.44455759c》t位点产生的单倍型tc茸重显著高于单倍型ct(p《0.05)，表明该单倍型对梅花鹿茸重有一定的影响。
[0094]
将msrb3基因各位点产生的基因型与梅花鹿茸重性状进行关联分析，结果显示g.44455582t》c位点的tt基因型个体的茸重极显著高于cc和ct基因型个体(p《0.05)，表明该突变位点对梅花鹿茸重有极显著影响。本群体中g.44340734g》c位点的cc基因型个体的数量较少，仅2个个体，该位点对茸重性状的影响还需进一步验证，其余位点各基因型个体之间茸重差异均不显著(p》0.05)。
[0095]
本发明的snp位点位于内含子上。已有研究发现，内含子可以直接影响mrna稳定性和翻译活性，改变其生物学功能(蓝贤勇，2007)；通过影响核质成分、位置等调节基因的表达水平(dvinge h等，2015和rose ab，2008)；还可参与基因的剪切过程，通过影响基因翻译的剪切效率或准确性改变氨基酸的编码，从而改变个体表型(mayo o，2008)。杨晓斌等检测牦牛乳铁蛋白(lactoferrin,lf)基因多态性发现内含子4基因型a2b2对牦牛乳脂率有显著
影响，可作为甘南牦牛乳品质性状的潜在遗传标记。路遥等在农华白鸭视黄醇结合蛋白4(retinol-binding protein 4,rbp4)基因内含子1上发现g.266t》g位点对蛋品质性状产生极显著的影响。赵拴平等检测pax3基因第4和第6内含子发现存在4个多态性位点对大别山牛部分生长性状产生显著或极显著影响。这些研究均表明基因内含子突变与生产性能密切相关。综上所述，msrb3基因内含子2上的g.44455582t》c突变位点极显著影响梅花鹿茸重性状，单倍型tc茸重性状有显著影响，对为后续梅花鹿茸重性状分子选育提供参考。
[0096]
结论：本发明结果表明，梅花鹿merb3基因具有多态性，存在2个同义突变和4个内含子突变，其中内含子突变g.44455582t》c位点对24月龄梅花鹿茸重有极显著影响。因此，在梅花鹿分子育种中，可将该位点作为茸重性状选择的候选分子标记。
[0097]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。