含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的周期循环低温制备方法及应用与流程

1.本发明涉及医用生物静电纺丝材料技术领域，特别涉及一种含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的周期循环低温制备方法及应用。


背景技术：

2.静电纺丝技术是制备纳米纤维最常用的方法之一，已经被广泛应用到医药，生物，环境，能源等多个领域。传统静电纺丝技术受到制备方法的限制，在强电场和高速滚筒的双重作用下，只能用于制造伸直状态下的纳米纤维，难以制作具有弯曲形态的纳米纤维，这就阻碍了静电纺丝纳米纤维技术的推广和应用。
3.目前，通过单独控制温度参数调节静电纺丝制备效果的报道较少，少数研究立足于降低静电纺丝溶液粘度的目的来提高加工温度。而低温环境增加了溶液粘度一定程度阻碍了静电纺丝加工造成人们潜意识中将低温控制排除在常规静电纺丝制备方法之外，影响了相关研究的进展。
4.细胞外基质的拓扑结构对细胞行为产生重要影响，细胞外基质的微观拓扑结构复杂多样，以适应和调节不同的生理微环境。例如，肌腱细胞外基质的胶原纤维存在卷曲结构，以促进组织在拉伸下的非线性硬化，具有卷曲形态的纤维膜比伸直状态的纤维膜能够吸收更多的张力，从而缓冲附着的肌肉或骨骼产生的机械负荷。此外，卷曲结构的类似弹簧的行为可以保护肌肉在收缩时免于撕裂。有研究发现细胞边缘弯曲行为可以促进细胞机械力学强度的积累，促进细胞成骨分化。传统仅具有直线型的静电纺丝纳米纤维表面难以适应于复杂的生命活动需要。因此，改变静电纺丝膜拓扑结构限制，制备具有卷曲形态的纳米纤维材料是目前研究的重点。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的周期循环低温制备方法；本发明的目的之二在于提供所述方法制备的纳米纤维的静电纺丝膜在促进细胞粘附中的应用；发明的目的之三在于提供所述方法制备的纳米纤维的静电纺丝膜在促进干细胞成骨分化中的应用。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的周期循环低温制备方法，包含如下步骤：
8.(1)称取原料，加入溶剂，搅拌使其完全溶解，制得静电纺丝预制液；
9.(2)将步骤1制备的静电纺丝预制液进行低温预处理，制得静电纺丝工作液；
10.(3)将步骤2制备的静电纺丝工作液灌入静电纺丝针管中，装配至静电纺丝机上，保持周期循环低温，安装正极、负极，调节静电纺丝参数，制备静电纺丝纳米纤维膜。
11.本发明优选的，步骤(1)中，所述原料包括但不限于聚己内酯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚醚砜，壳聚糖，明胶中的一种或者多种，所述原料的分子量为5000～
1000000。
12.本发明优选的，步骤(2)中，所述低温预处理的温度为-40～10℃，低温预处理的时间为30～60min。
13.本发明优选的，步骤(3)中，所述周期循环低温的温度为-10～10℃，周期间隔为0～120min。
14.2、所述方法制备的含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜在促进细胞粘附中的应用。
15.本发明优选的，所述细胞为脂肪来源的间充质干细胞hascs，或骨髓间充质干细胞bmsc，或小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3，或小鼠成纤维细胞l929，或人脐静脉内皮细胞huvec。
16.3、所述方法制备的含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜在促进干细胞成骨分化中的应用。
17.本发明优选的，所述干细胞为脂肪来源的间充质干细胞hascs，或/和骨髓间充质干细胞bmsc。
18.本发明优选的，所述含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的最佳纤维曲率为0.15～0.5μm-1
。
19.本发明优选的，所述静电纺丝膜使用前需经过无菌处理。
20.本发明的有益效果在于：本发明公开一种含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的低温周期循环制备方法，使用溶剂溶解原料制备静电纺丝液，采用低温预冷却静电纺丝液，并准确控制纺丝环境周期循环温度，通过调整静电纺丝参数，制备出含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜材料，该材料用于细胞培养时，具有促进细胞粘附与诱导间充质干细胞的分化的作用。
21.本发明首次提出周期循环低温控制静电纺丝的方法，既避免了溶液粘度增加对纺丝的阻碍，又探寻了低温环境对静电纺丝的影响，制备出具有卷曲状结构的静电纺丝膜，弥补了该领域的技术空白。
22.与目前现有的静电纺丝技术相比，本发明弥补现有静电纺丝设备仅能制备直线型材料的不足，极大的拓宽了静电纺丝技术的适用范围，丰富了模拟细胞外基质的生物医用材料种类，可用于探究材料界面对细胞行为的影响。本发明制备的纳米纤维材料具有良好的生物相容性，化学稳定性和可降解性，并且成本低廉，工艺简单可调节，作为新型生物医用材料具有很好的研究和应用前景。
附图说明
23.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
24.图1为环套式周期循环低温静电纺丝装置示意图；
25.图2为静电纺丝膜扫描电子显微镜图(straight：传统伸直状态纳米纤维膜表面形貌；curved：卷曲状态纳米纤维膜表面形貌)；
26.图3为纤维曲率统计(straight：传统伸直状态纳米纤维曲率统计；curved：卷曲状态纳米纤维曲率统计)；
27.图4为碱性磷酸酶(alp)测定的间充质干细胞7天成骨分化结果图(a：传统伸直状态纳米纤维膜诱导细胞分化结果；b：卷曲状态纳米纤维膜诱导细胞分化结果)；
28.图5细胞粘附铺展图(a：传统伸直状态细胞铺展；b：卷曲状态细胞铺展)；
29.图6细胞边缘曲率统计(straight：传统伸直状态纳米纤维膜黏附的细胞边缘曲率统计；curved：卷曲状态纳米纤维膜黏附的细胞边缘曲率统计)；
30.图7细胞顶点数统计(straight：传统伸直状态纳米纤维膜黏附的细胞顶点统计；curved：卷曲状态纳米纤维膜黏附的细胞顶点统计)；
31.图8为不同循环温度所得静电纺丝膜培养间充质干细胞七天后的碱性磷酸酶(alp)表达量；
32.图9为不同循环周期所得静电纺丝膜培养间充质干细胞七天后的碱性磷酸酶(alp)表达量。
33.附图标记说明：
34.1-纺丝液存储注射管；2-静电纺丝液；3-稳定电场铝箔层；4-正极夹；5-纺丝针头；6-静电纺丝膜；7-接收滚筒；8-底座；9-负极；10-温度控制机。
具体实施方式
35.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
36.本发明实施例采用的环套式周期循环低温静电纺丝装置如图1所示，该装置包含如下组件：纺丝液存储注射管1；静电纺丝液2；稳定电场铝箔层3；正极夹4；纺丝针头5；静电纺丝膜6；接收滚筒7；底座8；负极9；温度控制机10。
37.实施例1、含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的周期循环低温制备
38.一种含有卷曲状纳米纤维的静电纺丝膜的周期循环低温制备方法，通过如下步骤实现：
39.(1)将聚己内酯或其他高分子材料原料称量后加入到六氟异丙醇等溶剂中，搅拌3～24h使其完全溶解，得到静电纺丝预制溶液；其他高分子材料原料包括但不限于聚己内酯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚醚砜，壳聚糖，明胶等，分子量在5000～1000000之间。
40.(2)将静电纺丝预制溶液放入-20℃冰箱预冷30～60min，得到静电纺丝工作液；
41.(3)将所述预冷后的静电纺丝工作液加入静电纺丝针管中，固定在静电纺丝机上，通过周期循环低温准确控制环境温度(-10～10℃)，安装正极、负极，调节静电纺丝参数调如下：电压为10～30kv，注射速度为0.008～0.1ml/min，接收滚筒转速为100～1000rpm，针头为21～28号，正极针头到接收辊距离为5～30cm，纺丝时间为1～10h，可得到卷曲状纳米纤维，静电纺丝膜厚度在1-5000μm之间，纤维直径均在50～900nm之间；纤维曲率在0.001-200μm-1
之间。
42.采用周期循环低温法制备的卷曲状纳米纤维膜，经过75％酒精灭菌处理后，无菌pbs清洗5次后，接种间充质干细胞(hasc，bmsc)，或成纤维细胞(nih3t3,l929)，或内皮细胞(huvec)，弯曲现为形貌可促进细胞粘附，诱导间充质干细胞(hasc，bmsc)成骨分化，并检测与分析相关结果。
43.如图2所示，通过静电纺丝膜扫描电子显微镜图可知，传统10-40℃制备的纳米纤维膜表面形貌伸直状态(straight)，而本发明周期循环低温条件下制备的纳米纤维膜表面
形貌呈卷曲状态(curved)；
44.如图3所示，通过统计纤维曲率可知，传统伸直状态纳米纤维曲率范围为0-0.16μm-1
(straight)；而本发明周期循环低温条件下制备的卷曲状态纳米纤维曲率范围为0.02-0.78μm-1
；
45.碱性磷酸酶(alp)是反应骨组织中分解代谢水平的一种标志酶，在钙化中起着关键作用。钙离子在alp作用下沉积于胶原上，完成基质矿化过程，骨组织是通过骨基质钙化而形成，而骨基质由成骨细胞合成、分泌；在基质开始钙化时，成骨细胞的alp活性最高，在钙化接近结束时活性则最低，其活力在一定程度上反映成骨细胞的分化程度和功能状态。如图4所示，通过碱性磷酸酶(alp)测定的间充质干细胞7天成骨分化结果可知，与传统伸直状态纳米纤维膜诱导细胞分化结果(图4，a)相比，卷曲状态纳米纤维膜诱导细胞分化效果更好。
46.如图5所示，通过细胞粘附铺展效果可知，细胞在直纤维上只能贴合纤维走向粘附(图5，a)，但是在卷曲纤维上可以横跨多条纤维(图5，b)。通常认为，只有细胞粘附足够良好，才能够有力量完成跨越粘附，这是细胞施展自身功能和行为的必要条件。直纤维上细胞通常都是被限制在直纤维的框架中，更多只能贴着纤维的边缘伸展，实际受到纤维一定程度的空间限制。因此我们说卷曲状的纤维膜上细胞铺展的更好。
47.如图6所示，通过细胞边缘曲率统计可知，与传统伸直状态纳米纤维膜黏附的细胞边缘曲率0.06-0.64μm-1
(straight)相比，卷曲状态纳米纤维膜黏附的细胞边缘曲率0.14-0.72μm-1
(curved)更大；
48.如图7所示，通过细胞顶点数统计可知，与传统伸直状态纳米纤维膜黏附的细胞顶点0-11(straight)相比，卷曲状态纳米纤维膜黏附的细胞顶点2-21(curved)的。
49.很显然细胞在卷曲纤维上呈现出的边缘弯曲效果并不是受到卷曲纤维的形貌空间限制造成的，这是细胞在不同纤维上形成跨越式的粘附所塑造的。细胞的这些悬空的弧状边缘是对细胞粘附影响的关键信息。研究发现，细胞形成的这种悬空式的圆弧结构需要自身细胞骨架维持，在这些圆弧处会有高表达的细胞骨架蛋白聚集，塑造出独特的细胞行为，激活相关信号通路，有助于细胞黏附，促进细胞谱系分化。细胞顶点数目的增加与细胞弧的增多有关，在此定义细胞边缘曲率超过1即可设定为1个顶点区域，两个顶点之间是一个跨越式的弧状结构，另一方面顶点的增多也表示细胞主动感知周围细胞外基质的能力更强，有更多的粘附位点。而直纤维的边缘通常呈现的是依附于纤维的铺展，不需要在这些区域聚集更多的细胞骨架以维持结构，这和上述的细胞与纤维非接触的跨越式的弧状结构是不同的，不能形成细胞骨架蛋白的聚集，不能形成刺激细胞行为和功能的特殊通路。
50.实施例2、确定最佳循环周期温度和时间
51.为了获得诱导细胞成骨分化最佳的卷曲静电纺丝参数，针对周期循环的温度和时间分别进行分析，通过碱性磷酸酶(alp)测定的间充质干细胞7天成骨分化结果确定优选的最佳周期循环温度和循环时间。其他参数均保持在实施例1所示最佳静电纺丝制备设置的范围内。
52.一、确定循环周期时间为10min，设定循环温度范围如表1所示：
53.表1
[0054][0055]
通过设置不同循环温度所得静电纺丝膜培养间充质干细胞，七天后进行检测，碱性磷酸酶(alp)表达量如下图8所示，可以确定最佳循环温度为5℃～-5℃，0℃～-10℃。
[0056]
二、保持最佳循环温度范围5℃～-5℃，0℃～-10℃，确定循环周期范围如表2所示：
[0057]
表2
[0058]
分组循环温度范围(℃)循环周期(min)15～-510、20、30、6020～-1010、20、30、60
[0059]
通过设置不同循环周期所得静电纺丝膜培养间充质干细胞，七天后进行检测，碱性磷酸酶(alp)表达量如下图9所示，最终确定最佳循环温度和循环时间为如3所示：
[0060]
表3
[0061]
分组循环温度范围(℃)循环周期(min)15～-52020～-1010
[0062]
上述两组最佳循环温度和循环周期所得卷曲状静电纺丝最佳纤维曲率约为0.15μm-1
～0.5μm-1
。
[0063]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。