一种来源于南极细菌的磷脂酶D突变体及其应用

一种来源于南极细菌的磷脂酶d突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学技术获得一种催化稳定性提高的磷脂酶d突变体及其大肠杆菌重组表达制备方法和应用。


背景技术：

2.酶蛋白半衰期是评价酶性能和应用潜力的重要指标，筛选和改造获得温度稳定性较高的酶蛋白成为研究者所关注的焦点。通常，分子改造提高酶蛋白稳定性主要通过随机突变和基于结构进行理性设计两种方法来实现。随机突变因涉及到突变体建库，给后续筛选带来较大的工作量，且筛选效率较低。在酶蛋白结构中理性设计引入二硫键是被公认的可以提高酶蛋白稳定性的方法，但该方法需要了解酶蛋白结构信息，且对于二硫键引入位点的选择上需要综合考虑引入位点之间的空间距离、角度等因素。基于结构的理性设计手段已经被成功用于多种酶蛋白的改造以提高其热稳定性研究中，例如：
ɑ-淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶等。相比于随机突变，虽然大大节省了突变体构建筛选的时间和成本，但仍无法保证所预测设计的位点与预期结果相符。
3.磷脂酶d(pld)作为一种重要的工具酶，被用于磷脂改性，在食品、医药和日化行业中具有极大的应用价值。在应用过程中，酶蛋白催化活力和催化反应稳定性是影响用酶成本的关键因素，开发高活力且高催化稳定性的磷脂酶d具有重要意义。现已报道磷脂酶d的酶活力都普遍较低，且以往对于该类酶的研究主要集中在酶蛋白底物选择性改造上，目前尚无基于二硫键的分子改造技术提升该类酶催化活性和稳定性的报道。


技术实现要素：

4.本发明在前期对来源于南极细菌的pld酶学性质及蛋白结构解析的基础上，尝试基于结构的酶蛋白二硫键引入策略来提升该酶在最适反应温度条件下的催化稳定性，以延长酶反应条件下的半衰期。通过借助分子动力学模拟和二硫键预测手段，在酶蛋白结构中理性设计引入了18个二硫键。在此基础上，开展实验验证，最终在筛选效果较好的两个突变体基础上，通过进一步叠加突变，进一步提升酶蛋白的温度稳定性，为该酶的下游应用奠定基础。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种来源于南极细菌的磷脂酶d突变体，是在氨基酸序列为seq id no:1的亲本序列基础上突变亲本序列中第148和206、225和328相应位点突变为半胱氨酸，从而形成二硫键而获得，其氨基酸序列为seqid no:4或seqid no:6或seqid no:8。
7.一种编码上述磷脂酶d突变体的基因，其核苷酸序列为seqid no:3或seqid no:5或seqid no:7。
8.一种含上述基因的重组基因工程菌。
9.所述重组基因工程菌的制备方法：将所述磷脂酶d突变体的基因克隆到表达载体pet-21a、pet28a或pet32a上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
10.所述磷脂酶d突变体可用于催化合成pa、ps等天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物。
11.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
12.本发明所构建的突变体s148c-t206c和d225c-a328c相比于野生型酶蛋白，在保持其最适反应温度条件不变的情况下，将其在最适反应温度条件下的半衰期提高到原来的1.4和2.0倍。s148c-t206c和d225c-a328c叠加突变后，其在最适反应温度条件下的半衰期提高到原来的3.2倍，且酶活力提高到原来的1.4倍。本发明获得的mspld突变体可适用于磷脂改性，生产磷脂酸及各类天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物，应用于生物、食品、医药、日化、农业、工业等领域。
附图说明
13.图1为野生型mspld表达及纯化效果sds-page电泳图。1：破碎后总菌蛋白；2：破碎总菌蛋白离心后上清液；3：破碎总菌蛋白离心后沉淀；4:破碎上清液过ni
2
亲和层析柱后，200mm咪唑浓度洗脱蛋白。
14.图2为mspld野生型及构建突变体蛋白经脱盐柱纯化后sds-page检测结果图；1:mspld；2:n60c-r283c；3:s62c-v111c；4:e74c-a155c；5:k101c-s162c；6:n145c-t205c；7:s147c-t205c；8:d224c-a327c；9:s449c-v551c；10:s486c-i549c；11:s147c-t205c/d224c-a327c。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
16.实施例1：野生型mspld及突变体重组表达载体及表达菌株的构建
17.(1)参照南极细菌(moritella sp.jt01)脂酶d完整蛋白序列(genbank:kxo13223.1基础上去除n端28个氨基酸获得(命名为mspld)，在编码该蛋白序列的基因上游引入ndeⅰ酶切位点及编码6个his蛋白标签，下游引入xho i，其重组表达完整氨基酸序列如seq idno:1所示。按照大肠杆菌表达密码子偏好性对编码该蛋白序列进行密码子优化，优化后的基因序列如seq id no:2所示；
18.(2)将(1)所合成的mspld基因用限制性内切酶ndeⅰ和xhoi分别对纯化的基因片段和质粒pet21a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌e.colitop10感受态细胞，涂布于lb(含100μg/ml氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过菌落pcr及基因测序。采用质粒提取试剂盒提取获得野生型mspld的pet 21a-mspld重组质粒。
19.(3)采用重叠pcr方法构建本发明所述突变体，反应条件如下：
20.反应条件1：
[0021][0022]
其中突变体构建所用上游引物和下游引物序列为：
[0023]
表1.构建突变体所用的引物列表
[0024]
[0025]
[0026][0027]
注：下划线序列为突变位点序列
[0028]
pcr扩增条件：98℃，3min；98℃，15s；60℃，25s；72℃，130s；30个循环；72℃，2min。扩增产物使用dpnⅰ酶切消化模板质粒，消化体系如下：
t206c和d225c-a328c叠加突变体的催化效率提高到原来的1.4倍。
[0038]
表2.设计突变体重组表达情况及最适反应温度条件下半衰期和催化效率测定结果
[0039][0040]
注：表达情况栏中：“ ”代表能够重组表达，
“‑”
代表无法实现重组表达；t
1/2
栏中，
“‑”
代表表达蛋白无活性。催化效率栏中，
“‑”
代表未测定。
[0041]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。