基因工程菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及一种基因工程菌及其应用，特别是一种产交沙霉素的基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.大环内酯类抗生素是目前临床上应用十分广泛的一类天然抗生素，这类抗生素的临床应用价值始于1952年红霉素的发现，之后研究人员又陆续发现了麦迪霉素、交沙霉素、罗红霉素、阿奇霉素等多种此类的抗生素。它们的抗菌活性逐渐加强，不良反应也更少。到现在为止，大环内酯类抗生素已有20多种在临床上使用，并且取得了良好的治疗效果。十四元环的大环内酯类抗生素最先被应用于临床，随着缺点的逐渐暴露，临床效果也显著降低。而十六元环的大环内酯类抗生素无诱导耐药性，胃肠道反应小，药物间相互作用少，特别是对一些耐药菌有较好的抗菌活性，交沙霉素作为十六元环抗生素可以作为红霉素的替代药物，弥补其在临床上的应用的不足。
3.交沙霉素的分子式为c
42h69
no
15
，分子量为828，结构式如下图所示。交沙霉素最早是由日本山之内制药株式会发现的，由那波链霉菌交沙霉素变种(streptomyces narbonensis var.josamyceticus)经过发酵产生。其抗菌谱与红霉素相似，相比于其他同类抗生素毒副作用较小，无诱导耐药性，与青霉素、链霉素、四环素、氯霉素无交叉耐药性。
[0004][0005]
交沙霉素的抗菌作用机制与其他同类抗生素相似。都是通过与细菌核糖体上50s大亚基的特殊位点以及核糖体蛋白质的一定部位结合，来从空间上阻碍蛋白质的合成，达到使细菌细胞死亡的目的。交沙霉素对g 菌及部分g-菌都有很高的抗菌活性，常见的菌种有金黄色葡萄球菌、双球菌脑膜炎、溶血性链球菌、淋球菌、支原体、衣原体等。对螺旋体、立克次体及大型病毒也有效。
[0006]
交沙霉素目前只能通过发酵或者化学合成的方法产生，其生物合成受聚酮合酶基因控制。但是由于交沙霉素的生物合成途径不清楚，难以进行分子水平的研究。为了开拓新的提高交沙霉素产量的方法，确定其生物合成途径尤为重要。并且，现今国内菌种的生产水平不足以在工业上大量生产，这给交沙霉素的产业应用带来了很大的阻碍。因此，必须寻找新的方法以提高其生产水平。


技术实现要素：

[0007]
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺少交沙霉素高产菌株的不足，提供一种基因工程菌及其应用，特别是一种产交沙霉素的基因工程菌及其应用。所述基因工程菌过表达与交沙霉素生物合成途径中与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因，增加交沙霉素的产量。
[0008]
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0009]
本发明的第一方面提供一种生产交沙霉素的基因工程菌，所述基因工程菌为过表达聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的那波链霉菌交沙霉素变种(streptomyces narbonensis subsp.josamyceticus)；
[0010]
所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因包括：如seq id no:1所示核苷酸序列的第9474-10607位和/或如seq id no:1所示核苷酸序列的第65176-66387位。
[0011]
在本发明一较佳实施方案中，所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的核苷酸序列如seq id no:1中第9474-10607位所示。
[0012]
在本发明另一较佳实施方案中，所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的核苷酸序列如seq id no:1中第65176-66387位所示。
[0013]
较佳地，所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因还包括：如seq id no:1所示核苷酸序列的第16425-17633位和第64467-65132位。
[0014]
更佳地，所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因还包括：如seq id no:1所示核苷酸序列的第1-1125位、第1118-1447位、第1444-2328位以及第18055-19116位。
[0015]
在本发明一具体实施方案中，所述基因工程菌含有包含32个基因开放阅读框(orf)的生物合成基因簇，具体如下：1)聚酮合酶基因orf18-24；
[0016]
2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因orf1-3、9、16-17、28-29；
[0017]
3)与糖基合成相关基因orf5-6、11-13、15、31和36，共8个基因；
[0018]
4)与糖基转移相关基因orf4、14、25-27；
[0019]
5)与抗性相关基因orf30；
[0020]
6)与生物合成调控相关基因orf7-8、33。较佳地：所述orf18的核苷酸序列如seq id no:1中第19380-32426位所示；所述orf19的核苷酸序列如seq id no:1中第32476-38571位所示；所述orf20的核苷酸序列如seq id no:1中第38698-43422位所示；所述orf21的核苷酸序列如seq id no:1中第43419-50345位所示；所述orf22的核苷酸序列如seq id no:1中第50404-55056位所示；所述orf23的核苷酸序列如seq id no:1中第55107-56834位所示；所述orf24的核苷酸序列如seq id no:1中第56828-60940位所示；
[0021]
所述orf1的核苷酸序列如seq id no:1中第1-1125位所示；所述orf2的核苷酸序列如seq id no:1中第1118-1447位所示；所述orf3的核苷酸序列如seq id no:1中第1444-2328位所示；所述orf9的核苷酸序列如seq id no:1中第9474-10607位所示；所述orf16的核苷酸序列如seq id no:1中第16425-17633位所示；所述orf17的核苷酸序列如seq id no:1中第18055-19116位所示；所述orf28的核苷酸序列如seq id no:1中第64467-65132位所示；所述orf29的核苷酸序列如seq id no:1中第65176-66387位所示；
[0022]
所述orf5的核苷酸序列如seq id no:1中第3984-4595位所示；所述orf6的核苷酸序列如seq id no:1中第4648-5730位所示；所述orf11的核苷酸序列如seq id no:1中第
11246-12676位所示；所述orf12的核苷酸序列如seq id no:1中第12758-13789位所示；所述orf13的核苷酸序列如seq id no:1中第13773-14651位所示；所述orf15的核苷酸序列如seq id no:1中第15835-16434位所示；所述orf31的核苷酸序列如seq id no:1中第68653-69633位所示；所述orf36的核苷酸序列如seq id no:1中第72469-73032位所示；
[0023]
所述orf4的核苷酸序列如seq id no:1中第2555-3874位所示；所述orf14的核苷酸序列如seq id no:1中第14678-15838位所示；所述orf25的核苷酸序列如seq id no:1中第60940-61653位所示；所述orf26的核苷酸序列如seq id no:1中第61818-63041位所示；所述orf27的核苷酸序列如seq id no:1中第63120-64394位所示；
[0024]
所述orf30的核苷酸序列如seq id no:1中第66563-68221位所示；
[0025]
所述orf7的核苷酸序列如seq id no:1中第5902-7854位所示；所述orf8的核苷酸序列如seq id no:1中第7908-9080位所示；所述orf33的核苷酸序列如seq id no:1中第70070-70618位所示。
[0026]
较佳地，所述那波链霉菌交沙霉素变种的保藏编号为atcc17835。
[0027]
本发明的第二方面提供一种交沙霉素的生物合成基因簇，包括32个基因开放阅读框(orf)，具体为：
[0028]
1)聚酮合酶基因orf18-24，共7个基因；
[0029]
2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因orf1-3、9、16-17、28-29，共8个基因；
[0030]
3)与糖基合成相关基因orf5-6、11-13、15、31和36，共8个基因；
[0031]
4)与糖基转移相关基因orf4、14、25-27，共5个基因；
[0032]
5)与抗性相关基因orf30-31，共2个基因；
[0033]
6)与生物合成调控相关基因orf7-8、33，共3个基因；
[0034]
其中，orf18-24合成交沙霉素的大环内酯骨架；orf1-3、9、16-17和28-29合成交沙霉素延长单位及后修饰；orf5-6、11-13、15和31参与糖基的合成；orf4、14和25-27转移糖基侧链；orf30负责将合成的交沙霉素分泌至胞外。较佳地：
[0035]
所述orf18的核苷酸序列如seq id no:1中第19380-32426位所示；所述orf19的核苷酸序列如seq id no:1中第32476-38571位所示；所述orf20的核苷酸序列如seq id no:1中第38698-43422位所示；所述orf21的核苷酸序列如seq id no:1中第43419-50345位所示；所述orf22的核苷酸序列如seq id no:1中第50404-55056位所示；所述orf23的核苷酸序列如seq id no:1中第55107-56834位所示；所述orf24的核苷酸序列如seq id no:1中第56828-60940位所示；
[0036]
所述orf1的核苷酸序列如seq id no:1中第1-1125位所示；所述orf2的核苷酸序列如seq id no:1中第1118-1447位所示；所述orf3的核苷酸序列如seq id no:1中第1444-2328位所示；所述orf9的核苷酸序列如seq id no:1中第9474-10607位所示；所述orf16的核苷酸序列如seq id no:1中第16425-17633位所示；所述orf17的核苷酸序列如seq id no:1中第18055-19116位所示；所述orf28的核苷酸序列如seq id no:1中第64467-65132位所示；所述orf29的核苷酸序列如seq id no:1中第65176-66387位所示；
[0037]
所述orf5的核苷酸序列如seq id no:1中第3984-4595位所示；所述orf6的核苷酸序列如seq id no:1中第4648-5730位所示；所述orf11的核苷酸序列如seq id no:1中第11246-12676位所示；所述orf12的核苷酸序列如seq id no:1中第12758-13789位所示；所
述orf13的核苷酸序列如seq id no:1中第13773-14651位所示；所述orf15的核苷酸序列如seq id no:1中第15835-16434位所示；所述orf31的核苷酸序列如seq id no:1中第68653-69633位所示；所述orf36的核苷酸序列如seq id no:1中第72469-73032位所示；
[0038]
所述orf4的核苷酸序列如seq id no:1中第2555-3874位所示；所述orf14的核苷酸序列如seq id no:1中第14678-15838位所示；所述orf25的核苷酸序列如seq id no:1中第60940-61653位所示；所述orf26的核苷酸序列如seq id no:1中第61818-63041位所示；所述orf27的核苷酸序列如seq id no:1中第63120-64394位所示；
[0039]
所述orf30的核苷酸序列如seq id no:1中第66563-68221位所示；
[0040]
所述orf7的核苷酸序列如seq id no:1中第5902-7854位所示；所述orf8的核苷酸序列如seq id no:1中第7908-9080位所示；所述orf33的核苷酸序列如seq id no:1中第70070-70618位所示。
[0041]
本发明的第三方面提供一种制备交沙霉素的方法，包括将如第一方面所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养。
[0042]
所述发酵培养基可为本领域常规，较佳地，所述发酵培养基包括：80g/l的豆油、20g/l的淀粉、10g/l的棉籽饼粉、0.0015g/l的硫酸锰和3g/l的碳酸钙；所述发酵培养基的ph为7.0～7.2。
[0043]
本发明的第四方面提供如第一方面所述的基因工程菌在制备交沙霉素中的应用。
[0044]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0045]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0046]
本发明的积极进步效果在于：
[0047]
(1)本发明通过在交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种(streptomyces narbonensis subsp.josamyceticus)中导入与交沙霉素生物合成途径中与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的表达载体，实现了交沙霉素产量的提高(可达23％)，并获得了提高交沙霉素产量的基因工程菌。
[0048]
(2)本发明通过对交沙霉素产生菌的基因组分析，获得了交沙霉素生物合成基因簇，并通过正调控基因或限速基因的过表达和敲除验证，绘制了交沙霉素的生物合成途径；对于在分子水平上改造交沙霉素的合成途径(例如中断不必要的次级代谢过程)，提高交沙霉素的产量具有积极意义。
附图说明
[0049]
图1为本发明交沙霉素生物合成路线示意图。
[0050]
图2为实施例3中orf9过表达重组质粒构建示意图。
[0051]
图3为实施例3中orf29过表达重组质粒构建示意图。
[0052]
图4为交沙霉素液相图谱；
[0053]
其中：箭头所示为交沙霉素的产物峰位置；
[0054]
a为jos-2-40菌株发酵提取物；b为jos-orf9菌株发酵提取物；c为jos-orf29菌株发酵提取物；d为jos-δorf19菌株发酵提取物；e为jos-δorf20菌株发酵提取物；f为jos-δorf24菌株发酵提取物。
具体实施方式
[0055]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0056]
实施例中所使用的培养基
[0057]
tsb培养基：配制时称取3g tsb培养基粉末(美国bd公司，lot：8053765)，用蒸馏水定容至100ml，ph 7.0，按25ml/250ml分装至摇瓶中，121℃灭菌30min。
[0058]
lb培养基(g/l)：nacl 10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，121℃灭菌30min。
[0059]
ms培养基(g/l)：黄豆饼粉20，甘露醇20，琼脂20，121℃灭菌30min。
[0060]
斜面培养基(g/l)：酵母提取物4，麦芽浸粉10，葡萄糖4，琼脂20，121℃灭菌30min。
[0061]
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，玉米淀粉10，黄豆饼粉15，mgso4·
7h2o 2，k2hpo
4 1，caco
3 3，ph 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
[0062]
发酵培养基(g/l)：豆油80，淀粉20，棉籽饼粉10，mnso
4 0.0015，caco
3 3，ph 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
[0063]
实施例中所使用的试剂配方
[0064]
1m tris-hcl：称取tris(生工生物工程股份有限公司，lot：d505ba0021)121.2g，hcl 35ml，加入约600ml蒸馏水，用hcl将ph调至8.0，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌30min，室温保存。
[0065]
0.5m edta：称取18.7g edta-na
2-2h2o(生工生物工程股份有限公司，lot：d503ba0009)，加入约80ml蒸馏水，用naoh将ph调至8.0，蒸馏水定容至100ml，121℃灭菌30min，室温保存。
[0066]
te缓冲液：量取5ml 1m tris-hcl(ph 8.0)和1ml 0.5m edta(ph 8.0)，加入约400ml蒸馏水均匀混合，将溶液定容到500ml，121℃灭菌30min，室温保存。
[0067]
2％ctab溶液：称取ctab(生工生物工程股份有限公司，lot：e718ba0018)4g，nacl(国药集团化学试剂有限公司)16.364g，量取20ml 1m tris-hcl，8ml 0.5m edta，加入约70ml蒸馏水，再定容至200ml，121℃灭菌30min，室温保存。
[0068]
实施例1交沙霉素产生菌总dna提取
[0069]
本实施例使用菌株atcc17835，为使用方便，称为jos-2-40。本实施例的操作为本领域常规，具体包括：
[0070]
(1)将菌株jos-2-40接种于25ml tsb培养基中，28℃摇床培养40h，以10％移种量移种于25ml tsb培养基，28℃摇床培养12h。
[0071]
(2)取2ml培养液12000rpm离心去上清收集菌体，沉淀物重悬于te缓冲液中，加溶菌酶(生工生物工程股份有限公司，lot：bcbm4658v)，37℃培养30min。
[0072]
(3)加入30μl 10％(w/w)sds(生工生物工程股份有限公司，lot：ea10ba0024)和3μl蛋白酶k(生工生物工程股份有限公司，lot：f423bad026)，混匀，37℃培养1h。
[0073]
(4)加入100μl 5m nacl，混匀，再加入80μl 2％ctab溶液，混匀，65℃保温10min。
[0074]
(5)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24/1)混匀，12000rpm离心4-5min，将上清转移到一个新ep管中。
[0075]
(6)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25/24/1)混匀，12000rpm离心4-5min，
将上清转移到一个新ep管中。
[0076]
(7)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀至dna沉淀下来，将沉淀转移到新的ep管中，用70％(v/v)乙醇洗两次，100％(v/v)乙醇洗一次，离心，弃上清，室温干燥。
[0077]
(8)将dna溶解于dd h2o中，-20℃保存提取的总dna。
[0078]
实施例2交沙霉素生物合成基因簇和生物合成途径分析
[0079]
本实施例对实施例1中提取的总dna进行测序，确定了整个基因组的碱基序列。对全基因组采用antismash version 5.0.0进行分析，得到了预测的交沙霉素的生物基因合成簇。接下来对所述生物基因合成簇中的基因进行blast分析，对簇上的几个关键基因进行过表达与敲除实验，确定其在交沙霉素合成过程中的重要作用，并绘制了交沙霉素的生物合成途径。
[0080]
所述交沙霉素的生物基因合成簇全簇共有38个基因开放阅读框(orf)，核苷酸序列全长73893bp，控制聚酮合酶基因的阅读框有7个(orf18-24)，包括8个模块，37个结构域，与聚酮合成延长单位及修饰相关的orf有8个(orf1-3、9、16-17、28-29)，与糖基合成相关的orf有8个(orf5-6、11-13、15、31和36)，与糖基转移相关的orf有5个(orf4、14、25-27)，与抗性相关的orf有1个(orf30)，与调控可能相关的orf有3个(orf7-8、33)。未知功能基因有6个(orf10、32、34、35、37、38)。这些核苷酸序列的具体信息如表1所示，各基因功能如表2所示，聚酮合酶各结构域以及氨基酸的位置如表3所示。
[0081]
表1交沙霉素基因合成簇中各个基因的位置、大小及方向
[0082]
[0083][0084]
表2交沙霉素基因合成簇中各基因功能
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089][0090]
表3聚酮合酶基因各结构域及其氨基酸的位置
[0091]
[0092][0093]
交沙霉素的生物合成途径如图1所示，主要包括以下几个阶段：首先是丙二酰基-coa、甲基丙二酰基-coa、乙基丙二酰基-coa和甲氧基丙二酰基-coa等聚酮前体物质的合成，涉及orf1-3、16；然后各前体物质经过pks催化逐步合成聚酮链，聚酮链经过环化得到一个大环内酯的基本骨架，涉及orf18-24；再通过添加核苷二磷酸活化葡萄糖，经过脱氧化，还原甲基化等合成糖基侧链，涉及orf5-6、11-15、25-27、31和36；最后通过各种修饰反应包括酰化、甲基化、氧化、还原、特异性糖加成等得到交沙霉素，涉及orf4、9、17和28-29。
[0094]
实施例3制备合成交沙霉素的基因工程菌
[0095]
选取实施例2中基因簇上两个酰基转移酶基因orf9和orf29进行过表达，获得交沙霉素突变菌株，并通过实验证明这两个基因的过表达可以提高菌株生产交沙霉素的能力，说明这两个基因在交沙霉素的合成中起到了重要的作用。具体如下：
[0096]
根据上述编码基因，以及上下游序列设计引物，并在其中插入酶切位点。引物序列如表4所示：
[0097]
表4基因过表达实验所设计使用的引物序列
[0098][0099]
如图2所示，根据本领域常规技术，利用设计好的引物经pcr从基因组上扩增orf9和orf29两个基因，将扩增的基因片段经同源重组与链霉菌整合型载体pset152连接，构建成为重组质粒，将重组质粒转化进入大肠杆菌甲基化缺陷型菌株et12567/puz8002中，再经过接合转移转化进入交沙霉素产生菌中，经抗性筛选获得基因过表达的工程菌jos-orf9和jos-orf29，选择阳性的接合子进行发酵验证。
[0100]
工程菌jos-orf9、jos-orf29与出发菌株jos-2-40的发酵产物经hplc检测后验证的结果如表5所示，相比于出发菌株jos-2-40，orf9基因过表达的工程菌发酵产物中交沙霉素的产量提高了23％、orf29基因过表达工程菌的发酵产物中交沙霉素的产量提高了15％，表明这两个酰基转移酶的过表达可提高交沙霉素的产量。
[0101]
表5交沙霉素基因过表达发酵单位对比
[0102][0103]
实施例4通过基因阻断验证基因功能
[0104]
选取实施例2中基因簇上聚酮合酶的几个基因orf19、20、24进行基因阻断实验，获得突变菌株，并通过实验证明这些突变菌株可使交沙霉素的产量发生变化，或者不再产生交沙霉素，说明这些基因是交沙霉素合成过程中的必须基因。具体如下：
[0105]
根据上述编码基因，以及上下游序列设计引物，并在其中插入酶切位点。引物序列如表6所示：
[0106]
表6基因阻断实验所设计使用的引物序列
[0107][0108][0109]
根据本领域常规技术，利用设计好的引物经pcr从基因组上扩增相应的同源片段，采用相应的酶切位点，并插入筛选标记抗性基因，连接到链霉菌温敏型质粒载体pkc1139上，获得含有同源基因的重组质粒，经接合转移转入交沙霉素产生菌中，培养后单菌落分离获得含同源片段双交换的基因阻断菌株jos-δorf19、jos-δorf20和jos-δorf24。
[0110]
发酵实验及对产物的hplc检测发现，聚酮合酶基因被破坏后，菌株不再生产交沙霉素，说明本发明提供的交沙霉素基因合成簇参与交沙霉素的合成。
[0111]
效果实施例1交沙霉素产生菌jos-2-40基因突变菌株发酵及产物活性检测
[0112]
对实施例3和4中的jos-2-40基因突变菌株jos-orf9、jos-orf29、jos-δorf19、jos-δorf20和jos-δorf24进行发酵及产物活性检测，采用本领域常规技术，具体包括：
[0113]
将单菌挑至斜面培养基，28℃培养7d，挖块接种于装量为25ml培养基的250ml的锥形种子瓶中，28℃培养2d，以10％(v/v)接种量转接至装量为25ml培养基的250ml的锥形发酵瓶中，28℃培养7d，得到发酵液。
[0114]
样品的处理：取200μl发酵液，加入800μl甲醇，超声震荡30min,12000r/min离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，得到的样品通过hplc进行检测。
[0115]
hplc条件：色谱柱为反相柱(填料为hypersil ods c18，4.6mm
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150mm)；柱温为30℃；检测波长：232nm；流速：1ml/min；进样量：20μl；流动相：甲醇：0.02mol/l kh2po4(ph 3)＝60:40。
[0116]
以交沙霉素标准品(上海源叶生物科技有限公司，货号：s24061)作为对照，对突变株发酵产物进行验证，结果如图4所示。
[0117]
由图4可知，聚酮合酶基因(orf19、20和24)被破坏后，菌株不再生产交沙霉素；相比于出发菌株jos-2-40，orf9基因过表达的工程菌发酵产物中交沙霉素的产量提高了
23％、orf29基因过表达工程菌的发酵产物中交沙霉素的产量提高了15％。