调控1型糖尿病CD4+T细胞分化和增殖的生物标记及应用的制作方法

调控1型糖尿病cd4 t细胞分化和增殖的生物标记及应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及调控1型糖尿病cd4 t细胞分化和增殖的生物标记及应用。


背景技术：

2.1型糖尿病(t1dm)是一种以自身反应性t细胞介导的胰岛β细胞破坏和胰岛素功能障碍为特征的器官特异性自身免疫性疾病，尽管近几十年来关于t1dm的研究取得了重大进展，但t1dm自身免疫的具体机制尚未完全确定。虽然目前可进行包括gada、ia-a2和znt8a在内的联合抗体检测，但仍有许多具有与t1dm一致的临床特征的患者的抗体呈阴性，t1dm直系亲属抗体检测阳性预示着其存在t1dm发病的高风险，针对这些抗体设计的免疫干预措施至今没有成功的案例。所以，抗体阳性仅对t1dm的诊断有意义，却无法提供t1dm的干预靶点和时机。因此，若能够在此类患者或其亲属中发现一种预示着疾病将要发生的生物标记物，对于指导此病的干预策略和时机的研究具有十分重要的意义。


技术实现要素：

3.基于以上问题，本发明提供调控1型糖尿病cd4 t细胞分化和增殖的生物标记及应用，本发明有助于t1dm诊断和治疗靶点的研究。
4.为解决以上技术问题，本发明提供了调控1型糖尿病cd4 t细胞分化和增殖的生物标记，所述生物标记为circrna000324，所述circrna000324的序列见seq id no.1，所述circrna000324通过circrna000324-mirna675-5p-mapk14和circrna000324-mirna675-5p-syk中的任意一种或两种通路调控cd4 t细胞的分化和增殖。
5.为解决以上技术问题，本发明还提供了生物标记在制备预测或防治1型糖尿病的药物或试剂盒中的应用。
6.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明为t1dm自身免疫的机制研究提供了新的靶点，为非编码rna(ncrna)和相关cernas网络在t1dm发病中的作用机制提供了新的证据，为预测或防治1型糖尿病提供了更多的可能性。
附图说明
7.图1为本发明的实施例的样本聚类图；
8.图2为本发明的实施例的geo数据图；
9.图3为本发明的实施例的circrna-mirna网络图；
10.图4为本发明的实施例的样本聚类图和mirna的表达谱；
11.图5为本发明的实施例的表达水平结果图；
12.图6为本发明的实施例的白质相互作用网络图；
13.图7为本发明的实施例的go分析结果图；
14.图8为本发明的实施例的kegg分析图；
15.图9为本发明的实施例的circrna-mirna-mrna网络图；
16.图10为本发明的实施例的两个circrna的验证结果图。
具体实施方式
17.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
18.实施例：
19.本实施例的t1dm患者(实验组)均为青岛大学附属医院内分泌代谢科住院患者，对照组为青岛大学附属医院健康检查中心的健康志愿者，所有对照组受试者均排除自身免疫性疾病病史和家族史，该研究得到青岛大学附属医院伦理委员会批准，并按照《赫尔辛基宣言》的原则进行。
20.本实施例对实验组和对照组均进行了cd4 t细胞的分离与提取、rna制备、rna芯片表达谱、生物信息学分析与目标预测、qrt-pcr验证等实验，实验结果见下文。
21.本实施例共有8组临床样本数据，包括4组关于t1dm患者的数据(gsm3902728、gsm3902729、gsm3902730和gsm3902731)和4组关于正常样本的数据(gsm3902724、gsm3902725、gsm3902726和gsm39027)，使用geo数据库(gse133225)中t1dm患者和健康志愿者捐献的pbmc执行，由于再现性差，样品gsm3902728和gsm3902724被排除在外。最后获得了3例t1dm患者和3例标准化正常样本的数据用于识别circrna，如附图1中的a所示，可能具有相似生物学功能的基因被聚集成同一簇，与对照组相比，p值《0.05的circrna被选为显著去circrna。对这些样本及其基因进行分层聚类后，该数据库中t1dm患者和健康志愿者组之间共有3182个差异表达circrna(1817个上调，1365个下调)，具体见附图1b。
22.见附图2和表1，通过与微阵列数据中的257个差异表达circrna和上述geo数据库中的3182个circrna交叉，获得了三个差异表达circrna(hsa_circ_0000324、hsa_circ_0001853和hsa_circ_0068797)，与正常对照组相比，它们在geo数据和circrna测序中均显著上调。
23.表1t1dm患者中三个差异表达circrna在cd4 t细胞中的表达水平
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本实施例通过序列结合算法预测了3个差异表达circrna的mirna靶点，大量证据表明，大多数circrna可能作为mirna海绵或竞争性内源性rna调节其下游靶点的表达，在自身的circrna-mirna网络中作为mirna海绵存在。miranda预测了hsa_circ_000324、hsa_circ_0001853和hsa_circ_0068797的circrna-mirna网络，并使用cytoscape软件构建网络图。见附图3，表明这些circrna分别与80余个mirna结合(分别为图4中的84、88和89)，这一结果支持了发明人的假设，即这些环状rna可能作为mirna海绵调节靶基因的表达。
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根据前面的描述，本实施例还从geo数据库(gse133217)中获得了显著差异性表达的mirna(demirna)。本实施例使用pbmc进行mirna数据分析，包括3例t1dm患者(gsm 390246、gsm3902467和gsm3902468)和3例正常样本(gsm3902464、gsm3902465和
gsm3902466)。见附图4和附图5，与对照组相比，126个p值《0.05的mirna被筛选为demirna，在这126个mirna中，只有11个差异表达并可能与circrna结合，也包括在261个靶mirna中。
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本实施例预测了mirna的目标mrna，并且仅选择了其中三个或更多数据库中同时显示的56497个mrna。见附图1c，将这些目标mrna与从geo数据库(gse133225)下载的2349个demrna进行了比较，结果表明，交叉口mrna共542个。进一步分析基因相互作用，将研究物种定义为“人”，最低要求的相互作用得分为0.4，见附图6，结果显示，只有198个mrna参与蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络，见表2，本实施例定义了前18位mrna，其相互作用基因大于7(度)，作为关键基因。
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表2蛋白质相互作用网络中的枢纽基因
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go分析表明，这542个基因主要与生物过程、细胞成分和分子功能有关。根据go分析中预测基因的分布，对基因数量进行统计分析，并对每个go项进行显著富集，以阐明基因功能。见附图7，主要富集在细胞成分、分子功能和生物进程三个方面，其中细胞成分主要富集如ficolin-1颗粒内腔(go:1904813)、ficolin-1颗粒(go:0101002)、泛素连接酶复合物(go:0000151)和晚期内体膜(go:0031902)方面；分子功能主要富集在蛋白质特异结合域(go:0019904)、干扰素受体活性(go:0004904)、激酶结合(go:0019900)和细胞因子受体活性(go:0004896)方面；生物进程主要富集在人类寡聚化反应(go:0051260)、t细胞选择(go:0045058)、细胞因子介导的信号通路(go:0001959)、细胞因子介导的炎症反应的产生(go:0002532)方面。
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kegg分析结果显示，有些候选基因的功能途径显著变化。见附图8，这些基因中有39条通路，前30条富集途径显示在富集散点图中，其中，破骨细胞分化信号通路、toll样受体信号通路、nf-κb信号通路、th1和th2细胞分化信号通路富集显著。
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为了充分探索t1dm中与免疫机制相关的关键基因，使网络更加简洁有效，发明人根据文献和前一步go和kegg通路分析的结果，进一步排除了与免疫机制无关的mrna；然后选择了8个参与免疫相关功能和信号通路的关键mrna(mapk14、syk、cd86、atm、tlr6、traf2、il2rb和cd3e)。
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根据海绵机制理论，上调的circrna可导致mirna下调并抑制mrna的表达，因此，附图5中只有四个下调的靶向mirna，即hsa-mir-3152-3p、hsa-mir-6071、hsa-mir-609和hsa-mir-675-5p，被用于构建circrna-mirna相互作用网络。对circrna-mirna相互作用和网络的预测发现，只有两个decircrna(hsa_circ_0000324和hsa_circ_0068797)与这四个mirna相互作用。这四个靶mirna与8个免疫相关关键mrna之间的mirna-mrna相互作用预测关系表明，只有4个mrna(mapk14、syk、cd86和tlr6)与这些mirna相互作用。因此，共预测了由两个circrna(hsa_circ_0000324和hsa_circ_0068797)、四个mirna(hsa-mir-3152-3p、hsa-mir-6071、hsa-mir-609和hsa-mir-675-5p)和四个mrna(mapk14、syk、cd86和tlr6)构建的8条网络通路，见附图9。
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8条通路中的所有ncrna和mrna均经qrt-pcr验证，见附图10，结果显示，与对照组相比，两个mrna(mapk14和syk)显著上调，四条mirna中只有一条(hsa-mir-675-5p)显著下调；最后，只有两个预测的基因网络(hs a_circ_0000324-hsa-mir-675-5p-mapk14和hsa_circ_0000324-hsa-mir-675-5p-syk)被成功验证并符合海绵机制的原理。
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上述实验证明circrna000324(序列为：gcagggccgg aagccagggc acgccccgcg agccgcaccc acagcacaca cccaagggcg gcaacacgcg aaaacgccac acagagggga cgcccccacg aggccgaagg ccagagcggc cacggcaggg ggacagaggc cggaagcccc gcgcgcagaa gaaggcccgc accaaggggg aggcgaa)可以通过circrna000324-mirna675-5p-mapk14和/或circrna000324-mirna675-5p-syk通路调控cd4 t细胞的增殖和分化,即hsa_circ_0000324-hsa-mir-675-5p-mapk14和hsa_circ_0000324-hsa-mir-675-5p-syk具有调控1型糖尿病cd4 t细胞分化和增殖潜力，它作为靶点可用于制备预测和防治1型糖尿病的基因药物。circrna000324可以通过circrna000324-mirna675-5p-mapk14和circrna000324-mirna675-5p-syk中的任意一种或两种通路调控cd4 t细胞的分化和增殖，机体中circrna000324的表达上升意味着免疫细胞激活的启动，cd4 t细胞朝着t1dm发病的方向分化和增殖，进而激活cd8 t细胞导致胰岛β细胞的免疫损伤以及t1dm的发生和发展。所以，在t1dm或其直系亲属中检测到circrna000324的高表达时，可对其干预的时机和靶点的选择提供客观证据。
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如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。