一种提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因MaSUS2.2及其应用

一种提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2及其应用。


背景技术：

2.淀粉是高等植物光合产物、碳水化合物的主要储藏形式，也是人类日常饮食碳水化合物、热量和能量的主要来源(chen et al.,1984；vandeputte et al.,2004；munyikwa et al.,1997)；其广泛分布在水稻、小麦、玉米、马铃薯等粮食作物，以及香蕉、猕猴桃、芒果等淀粉转化型果实中(vetrano et al.,2009；徐勇,2011；苗红霞等,2013)。淀粉根据基本组成单元α-d-葡萄糖聚合形态不同，划分为直链淀粉和支链淀粉(rochat et al.,1992)，其中支链淀粉约占总淀粉的70～80％。因此，支链淀粉含量高低直接影响粮食作物或淀粉转化型水果产量、品质及加工性能。
3.蔗糖合成酶(sucrose synthase,sus)是将蔗糖裂解成果糖和尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose,udp-glc)关键酶之一(farrar et al.,2000；fugate et al.,2019；dominguez et al.,2020)。同时，在马铃薯块茎、玉米种子、豌豆胚胎和番茄果实中研究表明，sus是催化糖酵解反应活性的关键酶之一，并为增加库容及糖代谢提供基础物质(zrenner et al.,1995；fan et al.,2019；stein and granot 2019)。sus主要包括susi、susii和susiii三种同工酶，拟南芥突变体中研究显示，三者具有相似表型功能，推测其主要区别可能是基因时空表达模式不同(bieniawska et al.2007)。在酥梨和柑橘果实发育过程中，上调sus基因表达，导致果实体积增大及糖积累增加(islam et al.,2014；abdullah et al.,2018)。胡萝卜中抑制sus1表达，显著减少了根生长和淀粉积累(tang and sturm 1999)。do nascimento等(2000)报道在香蕉果实淀粉积累过程中，sus活性较强；采后成熟过程中，sus活性下降到很低水平；推测sus活性与淀粉代谢可能存在相关性，但一直缺少实验证据证明，sus基因是否直接作用于香蕉果实淀粉合成，不清楚sus基因究竟作用于植物哪种淀粉类型的合成，是直链淀粉合成，还是支链淀粉合成，至今未见相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种可以提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2及其应用。
5.本发明的第一个方面是提供一种提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
6.本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
7.本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2。
8.其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pcambia1304载体质粒或ptrv2载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
9.优选地，所述原始载体为pcambia1304载体质粒，seq id no:1所示核苷酸序列与pcambia1304载体质粒经bgl i和spe i两种限制性内切酶双酶切连接。
10.优选地，所述原始载体为ptrv2载体质粒，seq id no:1所示核苷酸序列与ptrv2载体质粒经xba i和sma i两种限制性内切酶双酶切连接。
11.本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2、或者本发明第三个方面所述的重组载体在调控香蕉masus2.2基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量中的应用。
12.其中，本发明第一个方面所述的提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2、或者本发明第三个方面所述的重组载体提高了香蕉masus2.2基因表达，提高了香蕉果实总淀粉含量，提高了香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量。
13.其中，本发明第一个方面所述的提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2、或者本发明第三个方面所述的重组载体降低了香蕉masus2.2基因表达，降低了香蕉果实总淀粉含量，降低了香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量。
14.本发明的第五个方面是提供一种vigs沉默系统，所述vigs沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒ptrv1，所述表达病毒载体为seq id no:1所示核苷酸序列与ptrv2载体质粒经xba i和sma i两种限制性内切酶双酶切连接的重组载体。
15.优选地，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:5。
16.本发明的第六个方面是提供本发明第五个方面所述的vigs沉默系统在降低香蕉masus2.2基因表达、和/或降低香蕉果实总淀粉含量、和/或降低香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量中的应用。
17.本发明的第七个方面是提供一种调控香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量的方法，采用本发明第三个方面所述的重组载体或者本发明第五个方面所述的vigs沉默系统转染香蕉果实。
18.本发明的提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因masus2.2能够调控香蕉masus2.2基因表达、调控果实总淀粉含量、调控果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量，例如将其导入香蕉果实中，过量表达本发明的基因masus2.2，提高了香蕉中masus2.2表达量、香蕉果实总淀粉含量和香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量，又比如将与ptrv2载体质粒重组后导入香蕉果实中，沉默表达本发明的基因masus2.2，降低了香蕉中masus2.2表达量、香蕉果实总淀粉含量和香蕉果实中支链淀粉含量且基本不影响直链淀粉含量。这些结果显示，本发明的masus2.2基因是调控香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因，对调控支链淀粉含量、改善淀粉品质、培育优质香蕉新品种具有重要意义，为改良香蕉或其他果实支链淀粉品质提供了候选基因资源。
masus2.2重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μl yep液体培养基，28℃，250rpm预培养4～5h；吸取300μl菌液至含有50mg/l rif 的yep固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2～3天，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。
38.(2)根癌农杆菌介导pcambia1304-masus2.2过表达载体转化香蕉果实薄片
39.在超净工作台上将香蕉果实薄片(厚度1mm)浸泡于5ml 75％乙醇的无菌离心管中1min，浸泡期间充分晃动，然后用无菌水冲洗3次；20％次氯酸钠溶液浸泡15min，浸泡期间充分晃动，用无菌水冲洗3次。将已经转化pcambia1304-masus2.2重组载体的根癌农杆菌gv3101菌液取20μl到10ml含有50mg/l kan和50mg/l rif的yep液体培养基中过夜活化培养；吸取活化培养的菌液1ml到新的50ml含有50mg/l kan和50mg/lrif的yep液体培养基中培养至od600＝0.6；将所需浓度的菌液于超净工作台上转移到50ml无菌离心管中，4℃，6000rpm离心5min，弃去上清液，加入等体积(离心前菌液体积)的ms液体培养基将菌体重新悬浮；将菌液转移到100ml无菌三角瓶中，加入0.1％体积(重悬菌液体积)的乙酰丁香酮(as)，充分混匀，然后将香蕉果实薄片转移至农杆菌菌液中浸泡15min，期间摇动菌液使果实薄片于菌液充分接触；将薄片取出置于无菌滤纸上，吸干薄片表面多余的菌液，然后将其转移到含有乙酰丁香酮的ms培养基上，25℃黑暗培养3天；将共培养的香蕉果实薄片用于碘-碘化钾染色、总淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量测定及masus2.2表达分析。
40.2、ptrv2-masus2.2病毒沉默表达载体转化至香蕉果实薄片
41.(1)ptrv2-masus2.2病毒沉默表达载体的农杆菌转化
42.取200μl冰浴上融化的根癌农杆菌gv3101感受态细胞，加入ptrv2-masus2.2重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μlyep液体培养基，28℃，250rpm预培养4～5h；吸取300μl菌液至含有50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的yep固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2～3天，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。
43.(2)根癌农杆菌介导ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒转化香蕉果实薄片
44.取摇至金黄色的菌液15ml，4600rpm离心5min弃上清，重复一次。1.0mm mgcl2重悬菌体，4600rpm离心5min弃上清。10mm mgcl2重悬菌体，取2μl菌液加198μl mgcl2稀释100倍测定od值；按所测的od600值将菌液稀释至od600＝0.6。按照ptrv1:ptrv2-masus2.2＝1:5的比例加入10mm mes和200μm乙酰丁香酮，黑暗静置4～6h。静置2～3h后浸泡香蕉果实薄片(厚度1mm)15min，期间摇动菌液使果实薄片于菌液充分接触；将香蕉果实薄片取出置于无菌滤纸上，然后将其转移到含有乙酰丁香酮的ms培养基上，25℃黑暗培养3d；将共培养的香蕉果实薄片用于碘-碘化钾染色、总淀粉、直链淀粉和直链淀粉含量测定及masus2.2表达分析。
45.四、碘-碘化钾染色分析
46.取浸染后的香蕉果实薄片于培养皿中，倒入0.2n的碘-碘化钾溶液染色5min，无菌水洗脱3次，于吸水纸上晾干，用于拍照。
47.以采收期香蕉果实为材料(见图4a)，pcambia1304-masus2.2重组质粒浸染后的香
蕉果实薄片碘-碘化钾染色结果见图4b，从图4b中可知经pcambia1304-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果肉(实验组)碘-碘化钾染色深度明显深于pcambia1304质粒转化后的对照组；而经pcambia1304质粒浸染后的香蕉果肉(对照组)果心部位能够明显观察到白色(未染上颜色)，且未染色部位的面积明显高于pcambia1304-masus2.2重组质粒浸染后的实验组。
48.以采收期香蕉果实为材料(见图5a)，ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒浸染后香蕉果实薄片碘-碘化钾染色结果见图5b，从图5b中可知经ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后沉默masus2.2的表达，导致香蕉果肉薄片未染色面积明显大于ptrv1质粒 ptrv2质粒浸染后的对照组。
49.五、masus2.2基因qpcr分析
50.以pcambia1304-masus2.2过表达载体或ptrv2-masus2.2病毒沉默表达载体浸染后的香蕉果实薄片cdna为模板，对masus2.2基因在香蕉果实薄片中的表达进行分析，其反应体系及具体实验方法如下：
51.反应体系如下：
[0052][0053]
吸打混匀，离心30秒，于实时荧光定量pcr仪(mx3000p,stratagene)中以magapdh为内参基因进行扩增检测，每个样品重复三次，扩增反应运行程序如下：
[0054][0055]
pcambia1304-masus2.2过表达载体浸染后的香蕉果实薄片中masus2.2基因表达情况见图4c，从图4c中可知经pcambia1304-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，香蕉果实中masus2.2基因相对表达量为20.43，而pcambia1304浸染后的对照组的masus2.2基因相对表达量为1.09，实验组masus2.2基因的表达量高于pcambia1304浸染后的对照组，为对照组的20.4倍，且达到极显著差异水平(p《0.01)。
[0056]
ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中masus2.2基因表达情况见图5c，从图5c中可知经ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，masus2.2基因的表达明显被抑制，香蕉果实中masus2.2基因相对表达量为0.96，而ptrv1质粒 ptrv2质粒浸染后的对照组的masus2.2基因相对表达量为0.43，实验组masus2.2基因的
表达量显著低于对照组，为对照组的44.79％，且达到差异显著水平(p《0.05)。
[0057]
六、总淀粉含量测定
[0058]
以pcambia1304-masus2.2过表达载体或ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2病毒沉默表达载体浸染后的香蕉果实薄片为材料，每个样品三次重复，充分碾磨，用以总淀粉含量的测定，其具体实验方法步骤如下：
[0059]
称碾磨好的样品0.1g装于15ml离心管中。加入5ml80％乙醇，充分震荡混匀，4000rpm离心5min，弃去上清液，然后向沉淀中加入5ml去离子水重新悬浮洗涤。4000rpm离心5min，弃去上清液，然后向沉淀中加入5ml 80％ca(no3)2溶液重新悬浮。将离心管沸水浴中提取10min，冷却后4000rpm离心10min，吸取上清液转移到25ml容量瓶中，其沉淀再用80％ca(no3)2溶液重新悬浮提取二次，离心后取上清合并于25ml容量瓶中。用80％ca(no3)2溶液定容25ml，充分混匀。吸取所提取的淀粉溶液1ml，用80％ca(no3)2溶液补充至2ml，加入100μl 0.01n的i
2-ki溶液，混匀后于620nm波长下测定吸光值，求出测定样品中总淀粉的含量。
[0060]
pcambia1304-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中总淀粉含量测定结果见图4d，从图4d中可知经pcambia1304-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，香蕉果实中总淀粉含量为337.62mg/g，而pcambia1304浸染后的对照组的总淀粉含量为258.98mg/g，实验组总淀粉含量高于对照组约30.37％，且达到差异显著水平(p《0.05)。
[0061]
ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中总淀粉含量测定结果见图5d，从图5d中可知经ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，香蕉果实中总淀粉含量为40.75mg/g，而ptrv1质粒 ptrv2质粒浸染后的对照组的总淀粉含量为124.08mg/g，实验组总淀粉含量相比对照组降低了约67.16％，且达到差异显著水平(p《0.05)。
[0062]
七、直链淀粉和支链淀粉含量测定
[0063]
以pcambia1304-masus2.2过表达载体或ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2病毒沉默表达载体浸染后的香蕉果实薄片为材料，参照张小明等(2002)方法(稍有改动)测定香蕉果肉直链淀粉、支链淀粉含量，具体如下：
[0064]
称取100mg香蕉粉至50ml离心管中，加入1ml 95％乙醇和9ml 1mol/lnaoh，40℃恒温箱内放置24h。将溶液移入100ml容量瓶中并用蒸馏水定容，混匀后取5ml移入新的100ml容量瓶中，加入1ml的1mol/l醋酸和2ml的i
2-ki溶液后，定容至100ml。在30℃恒温箱中静置20min，在620nm波长下测定吸光度值，代入标准曲线，计算样品直链淀粉、支链淀粉含量。
[0065]
取六个5ml离心管分别加入0、50、100、200、500、1000μl的1mg/ml直链淀粉标准溶液，分别向每个离心管中加入20μl的1mol/l醋酸和40μl的i
2-ki溶液，用蒸馏水补充至2ml。在30℃恒温箱中静置20min，在620nm波长下测定吸光度值，以直链淀粉溶液浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。
[0066]
pcambia1304-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中直链淀粉含量测定结果见图4e，从图4e中可知经pcambia1304-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，与对照组相比较，直链淀粉含量无变化。ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中直链淀粉含量测定结果见图5e，从图5e中可知经ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，与对照组相比较，直链淀粉含量无变化。说明瞬时过表达或瞬时沉默表达
masus2.2基因，对香蕉果实直链淀粉合成无影响。
[0067]
pcambia1304-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中支链淀粉含量测定结果见图4f，从图4f中可知经pcambia1304-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，香蕉果实中支链淀粉含量为289.92mg/g，而pcambia1304浸染后的对照组的支链淀粉含量为213.29mg/g，实验组支链淀粉含量相比对照组提高约35.93％，且达到差异显著水平(p《0.05)。
[0068]
ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒浸染后的香蕉果实薄片中支链淀粉含量测定结果见图5f，从图5f中可知经ptrv1质粒 ptrv2-masus2.2重组质粒(实验组)浸染后，香蕉果实中支链淀粉含量为25.19mg/g，而ptrv1质粒 ptrv2质粒浸染后的对照组的支链淀粉含量为107.35mg/g，实验组支链淀粉含量相比对照组降低了约76.53％，且达到极显著差异水平(p《0.01)。通过瞬时过表达或瞬时沉默表达实验说明masus2.2基因是提高香蕉果实支链淀粉含量的关键酶基因，而对直链淀粉合成无影响。
[0069]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。