人源BMP2及其类似物的制备方法与流程

人源bmp2及其类似物的制备方法
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，涉及人源bmp2细胞因子的原核重组表达、制剂、体外活性检测和临床应用。


背景技术：

2.骨折修复是一个缓慢而痛苦的过程，目前临床上继续促进骨折修复的药物研发。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein)是骨基质分泌的一类转化生产因子(tgf-β)。最早由uris等在1965年提出，并在1982年首次从牛骨的脱钙骨基质中分离获得。到目前为止，共发现8个家族成员(bmp2、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp9、bmp12、bmp14)。其中，bmp2具有明显的诱导骨细胞分化作用从而促进异位固形成和促进骨折修复作用。
3.bmp2蛋白具有tgf-β家族蛋白的典型特征：7个半胱氨酸，其中6个半胱氨酸形成分子内二硫键(15-80，44-112，48-114)，两个分子中的cys78形成分子间二硫键。1982年wozney最早报道了基于cos-1细胞表达bmp2。1992年，israel di报道了基于cho细胞表达bmp2。美国medtronic公司在2002年获批上市的用于治疗椎间盘退化性疾病的infuse是基于细胞表达bmp2研发的腰椎融合器械。cho表达蛋白虽然可以形成完整的蛋白结构，但是表达量低，生产成本高。目前亦有基于大肠杆菌表达和复性bmp2的报道，但是普遍存在复性效率低，工艺复杂的特点。开发完整的基于大肠杆菌表达体系开发适合于工业化生产的包括表达、复性、纯化、制剂等关键步骤的bmp2生产工艺，将有利于降低bmp2的生产成本，扩大临床应用和造福病患。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种人源bmp2及其类似物的制备方法。
5.一种人源bmp2及其类似物的制备方法，按照如下步骤进行：
6.(1)向受体大肠杆菌细胞中导入人源bmp2及其类似物的编码基因得到重组大肠杆菌细胞；
7.(2)对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包含体；
8.(3)对所述包含体进行变性，得到变性蛋白；
9.(4)对所述变性蛋白进行复性和纯化，最终得到纯化后的人源bmp2及其类似物。
10.所述人源bmp2及其类似物的编码基因分别为bmp2-t、ds-bmp2-t，其核苷酸序列分别如序列表seq id no：1、seq id no：3。
11.所述人源bmp2及其类似物分别为bmp2-t、ds-bmp2-t，其氨基酸序列分别如序列表seq id no：2、seq id no：4。
12.所述制备产物为bmp2-t时：
13.在步骤(3)中，所述的包含体变性缓冲液为50mm三羟甲基氨基甲烷，8m尿素，1mm乙二胺四乙酸，20mm二硫苏糖醇，ph8.5；
14.在步骤(4)中，所述的包含体复性缓冲液为100mm三羟甲基氨基甲烷，0.25m甜蜜素，2m尿素，2mm乙二胺四乙酸，ph8.5，1mm胱氨酸，3mm半胱氨酸；所述的复性条件为变性缓冲液:复性缓冲液＝1:20，4℃复性2天后室温复性至少2天。
15.所述制备产物为ds-bmp2-t时：
16.步骤(3)所述包含体为含有错误折叠目的蛋白；对含有错误折叠目的蛋白的菌体破碎上清进行变性，得到全长融合trx标签的含有胶原结合多肽的bmp2蛋白；
17.步骤(4)对所述全长融合trx标签的含有胶原结合多肽的bmp2蛋白进行复性、纯化、酶切、纯化，得到纯化后的ds-bmp2-t蛋白；
18.步骤(4)所述复性缓冲液为100mm三羟甲基氨基甲烷，0.75m盐酸精氨酸，0.5m尿素，1m氯化钠，2mm乙二胺四乙酸，ph8.5，3mm半胱氨酸，1mm胱氨酸。所述的最佳复性方法为：按照变性液:复性液＝1:20的比例将变性液稀释至复性缓冲液中并4℃复性2天，室温复性2天。
19.本发明的有益效果：本发明以大肠杆菌为表达体系，基于bmp2的理论序列设计和构建不同序列组成的bmp2类似物，并比较其工艺成本和活性等相关参数。最终获得了适合于工业化生产的突变体蛋白的生产工艺。该生产工艺具有操作简单，工艺可控性好，可规模化生产的特点。
附图说明
20.图1为bmp2-t的质粒谱图。
21.图2为bmp2-t发酵曲线和发酵产物分析sds-page分析图。
22.图3为bmp2-t复性工艺开发和优化图。
23.图4为bmp2-t复性样品的q.ff纯化和sds-page分析图。
24.图5为bmp2-t样品的q.ff纯化产物的肝素纯化色谱图和sds-page分析图。
25.图6为bmp2-t样品的反相纯化色谱图和sds-page分析图。
26.图7为bmp2-t最终纯化样品的sds-page分析图和质谱分析图。
27.图8为bmp2的质粒谱图。
28.图9为bmp2发酵曲线和发酵产物分析sds-page分析图。
29.图10为bmp2变性样品的sp.bb纯化和sds-page分析图。
30.图11为bmp2复性样品的sp.bb纯化和sds-page分析图。
31.图12为bmp2 sp.bb纯化样品的肝素纯化以及最终成品的电泳和质谱分析图。
32.图13为ds-bmp2-t的质粒谱图。
33.图14为ds-bmp2-t复性样品的q.ff、q.hp纯化和sds-page图。
34.图15为ds-bmp2-t纯化样品的激活以及激活后样品纯化的sds-page图。
35.图16为bmp2-t和ds-bmp2-t最终成品的体内活性。
具体实施方式
36.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
37.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pet-11a,pet-30a载体等均为novagen公司产品。
38.实施例1 bmp2-t的制备
39.(1)bmp2-t编码基因合成、载体构建和表达菌株构建
40.1.1将编码bmp2蛋白(unipro no.p12643的第283-396位)基因的第290-396位，并且引入r291k突变修饰，在不改变氨基酸序列的前提下，将其密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，以适合在大肠杆菌中表达，并在优化好的序列前加入起始密码子atg，最终获得优化后的bmp2-t的编码基因序列如序列表seq id no：1所示。
41.1.2将序列表seq id no：1所示编码链核苷酸通过碱基互补配对原则人工合成后的双链dna分子插入载体pet11a( )的ndei/bamhi酶切位点之间，得到重组质粒(图1)。重组质粒中，插入的双链dna分子与质粒本身的部分dna融合，表达序列表seq id no：2所示的蛋白。
42.1.3将重组质粒利用化学转化的方式导入大肠杆菌bl21(de3)并通过amp抗体平板涂布、单克隆筛选的方式挑选表达量高的菌株，最终得到高表达量的bmp2-t表达菌株。
43.1.4将重组bmp2-t重组菌接种于500ml lb培养基制备小体积工作种子，待od600为1.8时停止培养等待入罐进行高密度发酵。高密度发酵基础培养基：26.7g甘油，40.0g酵母粉，1.8g磷酸二氢钾，1.8g柠檬酸，5ml盐溶液，1ml微量金属盐溶液，1ml消泡剂204，加入蒸馏水补充体积至1l，ph值为7.2。盐溶液由水和溶质组成，溶质及其浓度为：250g/l mgcl2·
6h2o、100g/l cacl2·
2h2o、100g/l kcl和2m柠檬酸(citric acid)。微量金属盐溶液：6.8g zncl2、54.0g fecl3·
6h2o、16.2g mncl2·
4h2o、2.2g cuso4·
5h2o、4.8g cocl2·
6h2o、0.024g(nh4)6mo7o
24
·
4h2o、0.2g ki、119ml 37％(体积百分比浓度)的浓盐酸，加蒸馏水补充体积至1l。补料由水和溶质组成，溶质及其浓度为：275g/l甘油和225g/l酵母粉。
44.1.5将上述工作种子及灭菌后的培养基通过蠕动泵泵入到已灭菌的发酵罐中，同时调整发酵系统参数：培养温度：37.0℃；溶氧补料联动控制：不启动；培养ph：7.0(ph调节剂：浓氨溶液，10％h2so4)；接种种子液后的起始溶氧：》90％；接种种子液后的起始转速：500rpm；接种种子液后的起始通气量：15l/min。待发酵体系溶氧下降至零并开始回升以后，开始溶氧补料联动，起始联动溶氧控制为25％，待发酵体系的od600nm值为15时加入iptg并使其浓度为1.0mm，然后按如下参数进行第二阶段发酵(诱导表达)，诱导温度：37.0℃；溶氧补料联动控制：15％；诱导发酵阶段ph：7.0；诱导发酵时间：5小时。诱导发酵结束后，检测发酵体系的od600nm值，然后4℃、4000rpm离心20min，收集整个发酵体系得到的菌体。在更具体实验例中，基于20l的发酵罐获得的发酵曲线如图2所示。
45.1.6将收集菌体，用pbs缓冲液重悬菌体，(w/v＝1:10)，利用高速分散器5000rpm/min重悬10min；然后在冷却水降温的条件下用高压匀浆机高压匀浆破碎菌体，匀浆3次(工作压力为800bar)，4000rpm离心30min收集包含体。
46.1.7用包含体溶解液(1
×
pbs 2m urea)溶解沉淀，溶解比例为1：10(w/v)，然后利用高速分散器搅拌以重悬包含体，将充分分散的包含体溶液至于磁力搅拌器上搅拌溶解1h后4℃、4000rpm离心25min收集包含体。
47.1.8将收集的包含体重新重悬与1
×
pbs中，重悬比例1：10(w/v)，然后利用高速分散器搅拌以重悬包含体，将充分分散的包含体溶液至于磁力搅拌器上搅拌1.9bmp2-t包含
体的复性工艺优化以及纯化工艺优化。
48.1.9.1采用矩阵设计bmp2-t的复性工艺优化，采用4个平行的变性条件，每个变性条件进行4个平行的复性优化，共16个复性对比工艺，所述变性条件如下：
49.变性a：按照1：20的比例溶解包含体，变性缓冲液为：(50mm tris,8m urea,1mm edta,20mm dtt,ph8.5)
50.变性b：按照1：20的比例溶解包含体，变性缓冲液为：(50mm tris,6m guahcl,1mm edta,20mm dtt,ph8.5)。
51.变性c：按照1：20的比例溶解包含体，变性缓冲液为：(50mm tris,6m guahcl,1mm edta,50mm cysteine,ph8.5)。
52.变性d：按照1：20的比例溶解包含体，变性缓冲液为：(50mm tris,8m urea,1mm edta,50mm cysteine,ph8.5)。
53.上述变性条件，变性样品在室温下搅拌4h，然后在15000rpm/4℃下离心30min收集上清液用于复性研究。
54.1.9.2所述复性条件如下：
55.复性条件1：100mm tris,0.5m arg-hcl,0.5m urea,1m nacl,2mm edta,3mm cysteine,1mm cystine,ph8.5；比例：1:40。
56.复性条件2：100mm tris,0.5m arg-hcl,2m urea,2mm edta,3mm cysteine,1mm cystine,ph8.5；比例：1:40。
57.复性条件3：100mm tris,0.5m sucralose(甜蜜素),2m urea,2mm edta,3mm cysteine,1mm cystine,ph8.5；比例：1:40。
58.复性条件4：100mm tris,0.25m sucralose(甜蜜素),2m urea,2mm edta,3mm cysteine,1mm cystine,ph8.5；比例：1:40。
59.上述复性样品，稀释后，先在4℃复性2天，然后室温复性2天。
60.1.9.3复性完成后，将复性样品用凝胶过滤层析替换缓冲液至15mm三羟甲基氨基甲烷，0.5m尿素，ph8.5，25mm环己胺基乙磺酸，5％二甲基甲酰胺，层析填料为葡聚糖凝胶填料g25。基于sds-page分析比较确认最佳复性条件(图3)，上述最佳复性条件如下：变性条件：变性缓冲液为50mm三羟甲基氨基甲烷，8m尿素，1mm乙二胺四乙酸，20mm二硫苏糖醇，ph8.5，变性比例为包含体:变性缓冲液＝1g:20ml，变性时间为:4小时；复性条件：100mm三羟甲基氨基甲烷，0.25m甜蜜素，2m尿素，2mm乙二胺四乙酸，ph8.5，1mm胱氨酸，3mm半胱氨酸；变性缓冲液:复性缓冲液＝1:20，4℃复性2天后室温复性至少2天。
61.1.10基于上述复性条件，5g包含体在50mm三羟甲基氨基甲烷，8m尿素，1mm乙二胺四乙酸，20mm二硫苏糖醇，ph为8.5的条件进行变性，变性体积100ml，并进行复性，复性体积2l。将上述复性样品首先采用阴离子交换层析法捕获蛋白，层析填料用q sepharose ff，平衡液为buffer a：15mm三羟甲基氨基甲烷，0.5m尿素，25mm环己胺基乙磺酸，5％二甲基甲酰胺，ph8.5；洗脱液为buffer b：15mm三羟甲基氨基甲烷，0.5m尿素，25mm环己胺基乙磺酸，5％二甲基甲酰胺，1m氯化钠，ph8.5。先用平衡液平衡层析柱，用buffer a将复性液稀释电导为10ms/cm，然后上样，上样完毕后继续用平衡液buffer a冲洗至紫外达到基线，然后用平衡液与洗脱液的混合液进行盐浓度逐渐增大的梯度洗脱，混合比例为10％、20％、30％、50％buffer b，分别收集相对应的主峰蛋白。在更具体实施例中，基于2l的复性液，共收集
470mg的纯化蛋白，蛋白浓度0.5mg/ml(色谱图和电泳图见图4)。
62.1.11捕获样品的二次纯化采用heparin亲和纯化，平衡液和洗脱液同阴离子交换层析(buffer a和buffer b)。先用平缓缓冲液平衡层析柱，将样品用buffer a稀释一倍，然后上样，上样完毕后继续用平衡液冲至紫外达到基线，然后用洗脱液buffer b在10个柱体积内进行盐浓度逐步增加的线性洗脱进行洗脱,收集主峰。在更具体实施例中，基于235ml(117.5mg)的捕获蛋白，共收集44.1mg的纯化蛋白，蛋白浓度1.47mg/ml(色谱图和电泳图见图5)。
63.1.12最终的成品纯化通过反相层析获得高纯度蛋白，层析填料为poros50r2，平衡液为：0.1％tfa，5％acn；洗脱液为：0.1％tfa，95％acn。首先用平衡液平衡层析柱，然后上样，上样完毕后继续用平衡液冲洗至紫外达到基线，然后用平衡液与洗脱液的混合液在10个柱体积内进行有机溶剂浓度线性增加的洗脱方法进行洗脱，收集主峰。在更具体例子中，基于15ml(22mg)的亲和纯化蛋白，共收集16.2mg的纯化蛋白，蛋白浓度0.81mg/ml(色谱图和电泳图见图6)。
64.1.13反相纯化样品用于制剂以及可能的冻干使用。具体可为：1)将反相层析收集的样品，经凝胶层析(g25脱盐)的方式去除有机溶剂至80mm甘氨酸ph4.0缓冲液溶解并进行制剂；2)将反相层析收集的样品，经冻干方式去除有机溶剂，冻干样品用80mm甘氨酸ph 4.0缓冲液溶解并进行制剂；3)反相层析收集的样品经超滤浓缩替换至80mm甘氨酸ph 4.0缓冲液并进一步经超滤浓缩完成制剂。冻干制剂的操作如下：将纯度符合要求的样品合并后进行冻干，冻干至含水量和有机溶剂残留符合要求后，密封后冷冻保存。上述制剂缓冲液配方均可为：5.0mg/ml蔗糖，25mg/ml的甘氨酸，3.7mg/ml的谷氨酸，0.1mg/ml的氯化钠，0.1mg/ml的聚山梨酯，ph4.5。最终制剂产品以液体形式冻存(-20℃)或者冻干为固体形式并低温保存(4℃)。最终成品的电泳和质谱分析结果见图7，最终成品进行液质联用检测分子量，检测结果表明最终成品分子量24246.6da，与该蛋白的二聚体的理论分子量24248.1da非常接近。上述数据充分证明基于该工艺获得的最终bmp2-t蛋白以二聚体的形式存在。在本实施例中，bmp2-t蛋白表达和纯化总体回收率如表1所示。
65.表1 bmp2-t蛋白表达和纯化回收率计算
66.[0067][0068]
实施例2 bmp2的制备
[0069]
2.1 bmp2编码基因合成、载体构建和表达菌株构建
[0070]
将编码bmp2蛋白(unipro no.p12643的第283-396位)基因的第283-396位，在不改变氨基酸序列的前提下，将其密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子，以适合在大肠杆菌中表达，并在优化好的序列前加入起始密码子atg，获得优化后的bmp2的编码基因序列如序列表seq id no：3所示。
[0071]
将序列表seq id no：3所示编码链核苷酸通过碱基互补配对原则人工合成后的双链dna分子插入载体pet-28a( )的ncoi/xhoi酶切位点之间，得到重组质粒(图8)。重组质粒中，插入的双链dna分子与质粒本身的部分dna融合，表达序列表seq id no：4所示的蛋白。
[0072]
将重组质粒利用化学转化的方式导入大肠杆菌bl21(de3)并通过kana抗性平板涂布、单克隆筛选的方式挑选表达量高的菌株，最终得到高表达量的bmp2表达菌株。
[0073]
2.2菌株的发酵与包含体收集
[0074]
菌体发酵和包含体收集方法同bmp2-t操作方法,20l发酵罐的发酵曲线如图9所示。
[0075]
2.3 bmp2包含体纯化、变复性及纯化
[0076]
通过二次稀释复性法获得有活性的bmp2蛋白，首先将将包含体用变性缓冲液进行溶解，变性液组成为：100mm三羟甲基氨基甲烷，8m尿素，1mm乙二胺四乙酸，20mm二硫苏糖醇，ph8.0，变性比例为包含体:变性缓冲液＝1g:20ml,变性时间为:过夜，然后15000转离心20分钟取上清用于后续变性条件下的蛋白纯化。层析填料为sp sepharose big beads，平衡缓冲液为buffer c：20mm三羟甲基氨基甲烷，8m尿素，ph6.0；洗脱缓冲液buffer d：20mm三羟甲基氨基甲烷，8m尿素，1m氯化钠，ph6.0。先用平衡液平衡层析柱，将样品按照变性蛋白液:平衡缓冲液＝1:2进行样品稀释，然后上样，上样完毕后继续用平衡液buffer c冲洗至紫外达到基线，然后用平衡液与洗脱液的混合液进行盐浓度逐渐增大的梯度洗脱，氯化钠浓度在2个柱体积内从0m增加至1m，收集蛋白主峰(变性样品的纯化色谱图和电泳图见图9)。将目的蛋白峰合并后，用凝胶过滤层析方法替换缓冲液到50mm三羟甲基氨基甲烷，6m盐酸胍，ph8.0，并加二硫苏糖醇至终浓度20mm，变性过夜。
[0077]
2.4变性好的样品通过第一步稀释复性，复性液可为：50mm三羟甲基氨基甲烷，1m氯化钠，0.75m环己氨基乙磺酸,1mm乙二胺四乙酸，ph8.5,1mm氧化型谷胱甘肽,2mm还原型谷胱甘肽。变性液:复性液＝1:50，室温复性3天。第一步复性结束后，按照1:4的比例将复性液稀释至用20mm tris，4m尿素，ph8.0缓冲液，室温复性3天。
[0078]
2.5复性结束后，将复性样品进行阳离子(sp.bb)层析纯化，平衡缓冲液(20mm pb，
4m urea，ph6.0)，洗脱缓冲液(20mm pb，4m urea，1m nacl,ph6.0)，上样完毕后用平衡缓冲液冲至电导与紫外稳定后，采用线性洗脱方法，在15个柱体积内将盐浓度由0m逐渐增加至1m，收集目的蛋白峰。在更具体例子中，基于4.3g包含体，获得100ml复性样品，共收集43ml的纯化蛋白，蛋白浓度0.43mg/ml。(变性样品的纯化色谱图和电泳图见图10)。
[0079]
2.6纯化样品进一步采用肝素亲和纯化，层析填料为肝素琼脂糖凝胶，以20mmpb、4m尿素、ph8.0组成的平衡液平衡层析柱后，样品进行上样，上样完毕后，用平衡缓冲液冲至电导与紫外稳定后，采用梯度洗脱方法进行洗脱(依次为0％、30％、50％洗脱液)，分别收集相对应的主峰(纯化色谱图见图11)。在更具体例子中，基于15mg捕获蛋白，共收集30ml的纯化蛋白，蛋白浓度0.5mg/ml。
[0080]
2.7最终的成品纯化通过反相层析获得高纯度蛋白，层析填料为poros50r2，平衡液为：0.1％tfa，5％acn；洗脱液为：0.1％tfa，95％acn。首先用平衡液平衡层析柱，然后上样，上样完毕后继续用平衡液冲洗至紫外达到基线，然后用平衡液与洗脱液的混合液在10个柱体积内进行有机溶剂浓度线性增加的洗脱方法进行洗脱，收集主峰。基于10.36mg捕获蛋白，共收集7ml的纯化蛋白，蛋白浓度1.48mg/ml。
[0081]
2.8最终的成品的液体制剂以及可能的冻干制剂方法同上述bmp2-t实施例。通过凝胶层析(g25脱盐)的方式替换缓冲液至制剂缓冲液：5.0mg/ml蔗糖，25mg/ml的甘氨酸，3.7mg/ml的谷氨酸，0.1mg/ml的氯化钠，0.1mg/ml的聚山梨酯，ph 4.5，最终蛋白浓度1.5mg/ml。最终制剂产品以液体形式冻存(-20℃)或者冻干为固体形式并低温保存(4℃)。最终成品的电泳结果见图11。最终成品进行液质联用检测分子量，检测结果表明最终成品分子量26057.0da，与该蛋白的理论分子量26058.16da非常接近。基于该数据，充分证明，基于上述工艺获得的最终bmp2蛋白以二聚体的形式存在。(电泳图和质谱结果见图12)。
[0082]
实施例3 ds-bmp2-t的制备
[0083]
3.1 ds-bmp2-t编码基因合成、载体构建和表达菌株构建
[0084]
将编码bmp2蛋白(unipro no.p12643的第283-396位)基因的第290-396位，并且引入r291k突变修饰。为了提高bmp2突变体的与骨基质中的胶原蛋白的结合力，在核心蛋白序列基础上，在蛋白的n端引入骨质结合多肽(序列为dssdssdssdssdssdss)，在骨质结合多肽和bmp2-t序列的连接区域引入连接序列(序列为gsgs)，为了提到蛋白的表达，通过在n端融合表达trx标签(thioredoxin protein)的形式，最终获得了该蛋白的高表达。最终表达蛋白序列如seq id no：6所示。在不改变氨基酸序列的前提下，将其密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，以适合在大肠杆菌中表达，最终获得优化后的ds-bmp2-t的编码基因序列如序列表seq id no：5所示。将序列表seq id no：5所示编码链核苷酸通过碱基互补配对原则人工合成后的双链dna分子插入载体pet-32a( )的kpni/xhoi酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒中，插入的双链dna分子与质粒本身的部分dna融合，形成融合基因。将重组质粒(图13)利用化学转化的方式导入大肠杆菌bl21(de3)并通过kana抗体平板涂布、单克隆筛选的方式挑选表达量高的菌株，最终得到高表达量的ds-bmp2-t重组表达菌株。
[0085]
3.2菌体发酵和菌体破碎方法同bmp2-t实施例1。
[0086]
3.3 ds-bmp2-t包含体的变复性
[0087]
首先向破菌上清中加入固体尿素至终浓度8m，二硫苏糖醇20mm，室温变性时间4小时，然后15000转离心20分钟，取上清得变性液。
[0088]
采用稀释法进行复性，复性液组成为：100mm三羟甲基氨基甲烷，0.75m盐酸精氨酸，0.5m尿素，1m氯化钠，2mm乙二胺四乙酸，ph8.5，3mm半胱氨酸，1mm胱氨酸。按照变性液:复性液＝1:20的比例将变性液稀释至复性缓冲液中并4℃复性2天，室温复性2天。
[0089]
3.3 ds-bmp2-t的纯化
[0090]
复性结束后，用10kda超滤膜包将复性液浓缩并替换缓冲液至q ff平衡液：(15mm tris,0.5m urea,25mm ches,5％dmf,ph8.5)；先用平衡层析柱，然后上样，上样完毕后继续用平衡液冲洗至紫外达到基线，然后用平衡液与洗脱液(15mm tris,0.5m urea,25mm ches,5％dmf,1m nacl,ph8.5)的混合液进行线性洗脱，具体为在10个柱体积内将盐浓度由0m增加至0.5m，然后在4个柱体积内将盐浓度由0.5m增加至1m，分别收集蛋白主峰。在更具体实施例中，基于400ml菌体破碎上清，获得8000ml复性样品，共收集225mg的纯化蛋白，蛋白浓度7.5mg/ml(色谱图和电泳图见图14)。
[0091]
3.4 ds-bmp2-t的ek激活、纯化和制剂
[0092]
为了提高蛋白的折叠和酶切的效率，可以将纯化蛋白通过凝胶层析的方法替换缓冲液并收集纯化产物用于酶切，凝胶层析填料可为sephadex g25，缓冲液为：(15mm tris,0.5m urea,25mm ches,5％dmf,ph8.5)。基于37.5mg纯化蛋白，共收集33mg的纯化蛋白。对g25收集的ds-bmp2-t前体直接进行ek酶切，经过优化的酶切条件为：蛋白浓度为1mg/ml，酶切比例(质量比1:500)，25℃酶切过夜。
[0093]
然后对酶切样品进行阴离子交换层析，层析填料为q sepharose high performance，平衡液为：(15mm tris,0.5m urea,25mm ches,5％dmf,ph8.5)；洗脱液为：(15mm tris,0.5m urea,25mm ches,5％dmf,1m nacl,ph8.5)；先用平衡液平衡层析柱，然后将酶切样品进行上样，上样完毕后继续用平衡液冲洗至紫外达到基线，然后用平衡液与洗脱液的混合液进行线性洗脱，具体为在6个柱体积内将盐浓度由0m增加至0.5m，分别收集蛋白主峰。经过酶切和纯化，共收集10.5ml的纯化蛋白，蛋白浓度0.61mg/ml(图15)。最终的成品的反相纯化、液体制剂以及可能的冻干制剂方式参照bmp2-t。
[0094]
实施例4 bmp2以及其类似物的体外活性研究
[0095]
通过检测bmp2及其类似物分子诱导表达的碱性磷酸酶含量来间接反应不同的给药量对细胞的软骨形成诱导能力的差别。
[0096]
实验材料：mc3t3-e1细胞，dmem 10％fbs 1％双抗，bmp2对照品(0.5mg/ml，杭州九源基因)，bmp2-t(冻干粉1.5mg)，细胞裂解液(碧云天)，bca试剂盒(碧云天)，alp检测试剂盒(碧云天)
[0097]
5.1接种mc3t3-e1细胞于24孔板，5
×
104个/孔，置于37℃/5％co2培养箱中培养24小时；
[0098]
5.2弃去原培养基，并用pbs轻柔漂洗细胞2-3次，阳性对照，bmp2-t，bmp2，ds-bmp2-t给药浓度为10μg/ml，阴性对照组加入完全培养基，置于37℃/5％co2培养箱中继续培养3天；
[0099]
5.3弃去原培养基，更换新药物，步骤同上，继续培养3天；
[0100]
5.4弃去培养基，psb漂洗后加入细胞裂解液150μl，静置3-5min，收集细胞裂解液12000rpm离心5min，收集上清液。
[0101]
5.5根据bca试剂盒测定总蛋白量，alp检测试剂盒测定alp的活力。
[0102]
alp活力计算公式如下：alp/bca＝dea/mg protein
[0103]
5.6通过上述实验方式，以商品化bmp2为对照，最终获得的bmp2，bmp2-t，ds-bmp2-t的样品活性，分别为对照品活力的101.6％、125.1％*和130.4％*(*代表与商品化bmp2对照组相比差异显著，p＜0.05)。
[0104]
实施例5 bmp2以及其类似物的体内活性数据汇总
[0105]
bmp2以及其类似物在balb/c-nu/nu裸鼠中(雄性，20g左右)检测成骨活性。
[0106]
6.1称取煅烧骨粉4份，每份1g，辐照灭菌备用。
[0107]
6.2取ds-bmp2-t、bmp2-t和商品化bmp2各500μg，稀释至1ml，过滤除菌后分别与煅烧骨粉混合，4℃孵育过夜，随后冻干，4℃保存备用。未复合因子的空白煅烧骨粉作为对照组(control)。
[0108]
6.3手术过程：0.3％戊巴比妥钠麻醉裸鼠，后肢三头肌处碘伏消毒，沿胫骨方向做一切口，切开皮肤和筋膜，分离肌间隙，将10mg材料植入肌间隙中。缝合肌肉和皮肤。碘伏消毒后放回笼中，单笼饲养，正常饮食和饮水。
[0109]
6.4给药后28d取材：裸鼠安乐死后，剪开术区皮肤，取下材料及周围肌肉并用福尔马林固定24h。固定后材料用10％edta脱钙14d。
[0110]
6.5脱钙后材料经过脱水、包埋最终进行石蜡切片。
[0111]
6.6石蜡切片进行he染色，镜检拍照，计算新骨面积。
[0112]
在本具体实施例中，经过上述体内实验并进行he染色结果表明，对照组无新骨生成(0％)，商品化bmp2对照组，bmp2组，bmp2-t组和dsbmp2-t组的新生骨面积(bv/tv)分别为71％，72％，82％和85％(图16)。
[0113]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。