靶向降解Btk的化合物及其抗肿瘤用途的制作方法

靶向降解btk的化合物及其抗肿瘤用途
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体地涉及靶向降解btk的化合物及其抗肿瘤用途。


背景技术：

2.btk(bruton's tyrosine kinase)即布鲁顿酪氨酸蛋白激酶，是非受体酪氨 酸激酶tec家族的成员,为细胞分化和增殖所必需基因，且在b细胞淋巴瘤、急性淋 巴细胞白血病(all)和浆细胞瘤中均有表达。btk为b细胞受体(bcr)信号通路的关键组 成部分，是靶向治疗b细胞淋巴瘤等疾病的很好靶点。
3.btk是b细胞发育、激活、信号传导和存活的关键调节物，参与对血管生成、细 胞增殖和凋亡以及细胞运动的调节。除此之外，btk还参与到许多其他造血细胞信号 途径，例如，参与巨噬细胞中toll样受体和细胞因子受体介导的信号通路，参与肥大 细胞中ige受体的信号传导等。
4.近年来研究显示，btk信号通路是目前非霍奇金淋巴瘤(nhl)，特别是慢性淋巴 细胞白血病(cll)、b细胞淋巴瘤及自身免疫疾病(类风湿性关节炎、银屑病等)临床 治疗研究中的新热点(邓容，赵利枝。btk抑制剂的研究进展。药学研究,2014, 33(6):359-372。)。
5.因此，本领域技术人员致力于开发能够有效抑制、降解btk的化合物。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种渗透性好具有良好渗透性的抑制、降解btk的化合物， 及其应用。
7.在本发明的第一方面，提供了一种如下化合物，或其药学上可接受的盐，或其溶剂 合物，或其氘代化合物：
8.[0009][0010]
本发明的第二方面，提供一种药物组合物及其施用方式，所述的组合物含有第 一方面所述的化合物、其异构体、前药、药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载 体。
[0011]
在另一优选例中，所述药物组合物，还包含另外一种或多种抗肿瘤剂。
[0012]
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)的 活性或降低布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)的水平。
[0013]
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)活 性或表达量相关的疾病。
[0014]
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的化合物的用途，用于：
[0015]
(a)制备治疗与布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)活性或表达量相关的疾病的药物；
[0016]
(b)制备布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)靶向抑制剂或降解剂；
[0017]
(c)体外非治疗性地抑制或降解布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)的活性；
[0018]
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
[0019]
(e)治疗与布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)活性或表达量相关的疾病。
[0020]
在另一优选例中，所述的疾病包括肿瘤、自身免疫疾病；优选地，所述肿瘤包 括非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、b细胞淋巴瘤等；所述自身免 疫疾病包括类风湿性关节炎、银屑病等。
具体实施方式
[0021]
本发明人经过广泛而深入的研究，制备并筛选了一系列的化合物，并验证了这 些化合物对布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)抑制和降解活性。虽然这些化合物均表现 出了对btk抑制和降解活性，但是研究中发现不同化合物的活性差异较大，并且针对 各化合物的透膜性检测意外发现，化合物1的渗透性极好，与其它化合物相比取得了 预料不到的优异
技术效果，因而具备良好的成药性。可以用于治疗与布鲁顿酪氨酸蛋 白激酶(btk)活性或表达量相关的疾病如肿瘤。在此基础上完成了本发明。
[0022]
术语
[0023]
本发明中，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本 发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术 语“含有”中。
[0024]
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良 副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
[0025]
本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量， 或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象 的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。 因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规 实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
[0026]
除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构 体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的 所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为r构型或s构型，或r构型和s构型的混合 物。
[0027]
如本文所用，术语“本发明化合物”指本文所示的各化合物。该术语还包括各 化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
[0028]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适 合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化 合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、 硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、 乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以 及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0029]
化合物及其药学上可接受的盐
[0030]
本发明涉及以下化合物或其药学上可接受的盐或其氘代化合物：
[0031]
[0032][0033]
本发明通过大量研究，对抑制并降解btk的化合物结构进行了大量的优化和筛 选，结果表明上述化合物，相较于其它化合物，表现出了及其优异的渗透性，外排比 值较低，具备良好的成药性；而且对依鲁替尼耐药的肿瘤细胞表现出了显著地抑制作 用，具有更强的抗肿瘤活性；取得了预料不到的技术效果。
[0034]
本发明的化合物包可以与无机酸、有机酸或碱形成药学上可接受的盐。所述的 无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸等；所述的有机酸包 括但不限于甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、富马酸、草酸、 乙酸、马来酸、抗坏血酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、乙醇酸、琥珀酸和丙酸等；所述 的碱包括但不限于无机盐和胺类。
[0035]
术语药学上可接受的盐指根据医学判断适用于接触人和哺乳动物的组织而无过 度毒性、刺激、过敏反应等的那些盐。药学上可接受的盐为本领域公知的。
[0036]
本发明还涵盖含有各化合物的前体药物的药物组合物。前体药物包括这样的化 合物，其中前体分子通过碳酸酯键、氨基甲酸酯键、酰胺键、烷基酯键、磷酸酯键、 氨基磷酸酯键共价结合到本发明化合物的游离羧基、羟基、氨基或胺基上。
[0037]
应用
[0038]
本发明的化合物可用于以下的一种或多种用途：
[0039]
(a)制备治疗与布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)活性或表达量相关的疾病的药物；
[0040]
(b)制备布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)靶向抑制剂或降解剂；
[0041]
(c)体外非治疗性地抑制或降解布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)的活性；
[0042]
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
[0043]
(e)治疗与布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)活性或表达量相关的疾病。
[0044]
在另一优选例中，所述的疾病包括肿瘤、自身免疫疾病；优选地，所述肿瘤包 括非
霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、b细胞淋巴瘤等；所述自身免 疫疾病包括类风湿性关节炎、银屑病等。
[0045]
本发明的化合物可用于制备一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(i)有 效量的本发明化合物，或其药学上可接受的盐；和(ii)药学上可接受的载体。
[0046]
在另一优选例中，所述的有效量是指治疗有效量或抑制有效量。
[0047]
本发明化合物还可以用于抑制或降解布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)的方法，所 述的抑制是体外非治疗性的抑制也可以是治疗性的抑制。
[0048]
在另一优选例中，当对抑制对象施用抑制有效量的本发明化合物或其药学上可 接受的盐时，所述的抑制有效量为0.001-500nmol/l，较佳地为0.01-200nmol/l。
[0049]
特别地，本发明还提供了一种治疗与布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)活性或表达 量相关的疾病的方法，所述方法包括：对治疗对象施用治疗有效量的本发明化合物， 或所述含有本发明化合物作为有效成分的药物组合物。
[0050]
药物组合物和施用方法
[0051]
由于本发明化合物具有优异的对布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(btk)的抑制活性，因 此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物， 以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由与 btk活性或表达量相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗包括肿瘤等 的疾病。
[0052]
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受 的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足 以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发 明化合物/剂，更佳地，含有5-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为 一个胶囊或药片。
[0053]“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶 物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此 指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化 合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素 钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸 镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘 油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、 调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0054]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括 (但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
[0055]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固 体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸 二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、 甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷 酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡； (f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯； (h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固 体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型
也可包含 缓冲剂。
[0056]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠 衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物 或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的 实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种 形成微胶囊形式。
[0057]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊 剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其 它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3
-ꢀ
丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油 和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0058]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、 甜味剂、矫味剂和香料。
[0059]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧 乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0060]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、 悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含 水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0061]
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入 剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时 可能需要的推进剂一起混合。
[0062]
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0063]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动 物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言， 日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0064]
本发明的主要优点包括：
[0065]
1.本发明的化合物渗透性较好，表现为非p-糖蛋白转运底物，无外排现象，具 备良好的成药性，取得了预料不到的优异技术效果。
[0066]
2.本发明的化合物在极低浓度下即可降解btk的活性。
[0067]
3.本发明提供了一类治疗与btk酶活性相关疾病的药物组合物。
[0068]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重 量百分比和重量份数。本发明中涉及的生物材料(如细胞株和抗体)，均可通过商业 渠道购买获得。
[0069]
实施例1化合物1的合成
[0070][0071][0072]
1、化合物1-2的合成
[0073]
将化合物1-1(3.0g，10mmol)、n-boc-4-羟基哌啶(2.4g，12mmol)和三 苯基膦(3.9g，15mmol)溶于四氢呋喃(50ml)中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(3.0 g，15mmol)，氮气氛围下室温反应16小时。反应液加入适量乙酸乙酯稀释后用饱和 食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1洗脱)后得到 棕红色泡沫状产物3.0g，收率78％。
[0074]
lc-ms：487.4(m h)

[0075]
2、化合物1-3的合成
[0076]
将化合物1-2(3.0g，6mmol)溶于二氯甲烷(30ml)中，缓慢滴加三氟乙酸 (3ml)，室温反应24小时。将反应液浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇 ＝30：1洗脱)后得到白色泡沫状产物2.2g，收率93％。
[0077]
lc-ms：387.3(m h)

[0078]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.26(s,1h),7.66(d,j＝8.0hz,2h),7.44 (t,j＝7.6hz,2h),7.31-7.04(m,5h),4.98(prs,1h),3.40-3.33(m,2h), 3.13-2.99(m,2h),2.36-2.18(m,2h),2.13-1.96(m,2h).
[0079]
3、化合物1-5的合成
[0080]
将化合物1-4(50.0g，148mmol)和氯化铵(39.3g，742mmol)溶于二氯甲烷 (700ml)中，加入n,n,n,n-四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(68.0g， 180mmol)和三乙胺(100ml，0.75mmol)，此反应常温反应16小时。反应液依次 用稀盐酸以及饱和食盐水溶液
洗涤，有机相浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷： 甲醇＝80:1洗脱)后得到白色固体产物21.4g，收率43％。
[0081]
lc-ms：359.2(m na)

[0082]
4、化合物1-6的合成
[0083]
将化合物1-5(21.4g，64mmol)溶于甲醇(500ml)中，加入10％钯碳(湿重 3.0g)，氢气氛围下室温反应24小时。反应液过滤，浓缩蒸干，得到淡黄色油状产 物11.7g，收率91％。
[0084]
lc-ms：203.1(m h)

[0085]
5、化合物1-8的合成
[0086]
将化合物1-7(10.8g，100mmol)和1,5-二溴戊烷(22.8g，100mmol)溶于 四氢呋喃溶液(500ml)中，分批次加入氢氧化钠(12.0g，300mmol)，回流反应 16小时。再向体系中加入乙二醇(12.4g，200mmol)和氢氧化钠(12.0g，300mmol)， 回流反应16小时。反应液冷却，缓缓倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食 盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脱)后得到 淡黄色油状液体产物5g，收率21％。
[0087]
lc-ms：239.4(m h)

[0088]
6、化合物1-9的合成
[0089]
将化合物1-8(4g，16.8mmol)和对甲苯磺酰氯(3.8g，20.1mmol)溶于 二氯甲烷(150ml)中，加入三乙胺(4.7ml，33.6mmol)，室温反应16小时。反 应液缓缓倒入水中，用二氯甲烷萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅 胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝80:1洗脱)后得到无色油状产物3.0g，收率 46％。
[0090]
lc-ms：393.3(m h)

[0091]
7、化合物1-11的合成
[0092]
将化合物1-10(25.0g，164mmol)溶于甲醇溶液(150ml)中，在冰浴下缓慢 滴加硫酸(5ml)，回流反应3小时。反应液浓缩，缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取， 萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，得到淡红色固体产物20.5g，收率75％。
[0093]
lc-ms：167.1(m h)

[0094]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.15(s,1h),7.77(d,j＝9.2hz,1h),6.72
ꢀ–
6.65(m,2h),3.76(s,3h),2.47(s,3h).
[0095]
8、化合物1-12的合成
[0096]
将化合物1-11(20.0g，120mmol)和咪唑(12.2g,180mmol)溶于二氯甲烷 (200ml)中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(21.6g，144mmol)，室温下反应16小时。 反应液过滤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝50:1洗脱)后得到 无色油状产物19.8g，收率59％。
[0097]
lc-ms：281.2(m h)

[0098]
9、化合物1-13的合成
[0099]
将化合物1-12(19.8g，70mmol)和n-溴代丁二酰亚胺(13.8g,78mmol)溶 于二氯乙烷(200ml)中，加入偶氮二异丁腈(1.1g，7mmol)，90℃反应16小时。 反应液浓缩，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100:1洗脱)后得到无色油状产 物30.1g(纯度40％，含大量原料和二溴化物，难以分离)。
[0100]
lc-ms：381.1(m na)

[0101]
10、化合物1-14的合成
[0102]
将化合物1-13(24.0g，26.8mmol,40％)和1-6(6.8g,33.6mmol)溶于乙 腈(200ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(12ml，68mmol)，回流反应16小时。反 应液浓缩，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1洗脱)后得到棕黄色油状产物 6.0g，收率40％。
[0103]
lc-ms：449.3(m h)

[0104]
11、化合物1-15的合成
[0105]
将化合物1-14(6.0g，13.2mmol)溶于甲醇(100ml)中，加入四丁基氟化 铵(6.8g，26.4mmol)，室温反应16小时。反应液浓缩，硅胶柱色谱纯化(二氯甲 烷：甲醇＝20:1洗脱)后得到棕黄色油状产物3.7g，收率83％。
[0106]
lc-ms：335.3(m h)

[0107]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.13(s,1h),7.58-7.42(m,2h),7.16(s, 1h),6.94(d,j＝2.0hz,1h),6.86(dd,j＝8.4,2.0hz,1h),4.72-4.63 (m,1h),4.55-4.29(m,2h),2.21-2.06(m,3h),2.02-1.89(m,1h),1.33 (s,9h).
[0108]
12、化合物1-16的合成
[0109]
将化合物1-15(800mg，2.4mmol)和碳酸铯(1.5g，4.8mmol)溶于n,n-二 甲基甲酰胺(10ml)中，加入1-9(1.9g，4.8mol)，50℃反应24小时。反应液缓 缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色 谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1洗脱)后得到棕黄色泡沫状产物504mg，收率38％。
[0110]
lc-ms：555.5(m h)

[0111]
13、化合物1-17的合成
[0112]
将化合物1-16(500mg，0.9mmol)溶于甲醇(30ml)中，加入10％钯碳(湿 重50mg)，氢气氛围下室温反应16小时。反应液过滤，浓缩蒸干，得到无色油状产 物381mg，收率91％。
[0113]
lc-ms：465.1(m h)

[0114]
14、化合物1-18的合成
[0115]
将化合物1-17(380mg，0.82mmol)和对甲苯磺酰氯(187mg，0.98mmol) 溶于二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(0.23ml，1.64mmol)和4-二甲氨基吡啶(10 mg，催化量)，室温反应16小时。反应液缓缓倒入水中，用二氯甲烷萃取，萃取液经 饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1洗脱)后 得到棕黄色泡沫状产物263mg，收率52％。
[0116]
lc-ms：619.3(m h)

[0117]
15、化合物1-19的合成
[0118]
将化合物1-18(260mg，0.42mmol)和1-3(162mg，0.42mmol)溶于n,n-二 甲基甲酰胺(3ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(0.14ml，0.84mol)，此反应50℃ 反应48小时。反应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗涤， 浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1洗脱)后得到棕黄色泡沫状产物 192mg，收率55％。
[0119]
lc-ms：833.4(m h)

[0120]
16、化合物1的合成
[0121]
将化合物1-19(192mg，0.23mmol)溶于乙腈(30ml)中，加入苯磺酸(109 mg，0.69mmol)，回流反应24小时。反应液浓缩蒸干，多次硅胶柱色谱纯化(二氯甲 烷：甲醇＝8:
1洗脱)后得到白色泡沫状产物50mg，收率29％。
[0122]
lc-ms：759.5(m h)

.
[0123]1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.97(s,1h),8.23(s,1h),7.71-7.58(m, 3h),7.49-7.39(m,2h),7.21-7.11(m,6h),7.06(dd,j＝8.4,2.4hz,1h), 5.07(dd,j＝13.2,5.2hz,1h),4.65(s,1h),4.40-4.22(m,2h),4.19(dd,j ＝5.6,3.6hz,2h),3.77-3.69(m,2h),3.47(t,j＝6.4hz,2h),3.17(d,j ＝5.2hz,1h),3.08-2.82(m,3h),2.70-2.51(m,2h),2.42-2.28(m,3h), 2.22-2.13(m,2h),2.12-1.92(m,3h),1.92-1.84(m,2h),1.58-1.50 (m,2h),1.49-1.42(m,2h)。
[0124]
实施例2化合物2的合成
[0125][0126]
1、化合物2-2的合成
[0127]
将化合物2-1(30.0g，197mmol)和1,5-二溴戊烷(44.9g，197mmol)溶 于四氢呋喃溶液(700ml)中，分批次加入氢氧化钠(23.6g，591mmol)，回流 反应16小时。反应液冷却，缓缓倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水 溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝80:1洗脱)后得到淡 黄色油状液体产物30.1g，收率51％。
[0128]
lc-ms：323.1(m na)

[0129]
21、化合物2-3的合成
[0130]
将化合物1-15(800mg，2.4mmol)和碳酸铯(1.5g，4.8mmol)溶于n,n-二 甲基甲酰胺(10ml)中，加入化合物2-2(862mg，2.9mol)，50℃反应16小时。反 应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅 胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1洗脱)后得到棕黄色泡沫状产物612mg，收 率46％。
[0131]
lc-ms：555.5(m h)

[0132]
12、化合物2-4的合成
[0133]
将化合物2-3(600mg，1.08mmol)溶于甲醇(30ml)中，加入10％钯碳(湿 重60mg)，氢气氛围下室温反应16小时。反应液过滤，浓缩蒸干，得到无色油状产 物462mg，收率92％。
[0134]
lc-ms：465.1(m h)

[0135]
13、化合物2-5的合成
[0136]
将化合物2-4(460mg，1.0mmol)和对甲苯磺酰氯(228mg，1.2mmol)溶于 二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(0.28ml，2.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(10mg， 催化量)，室温反应16小时。反应液缓缓倒入水中，用二氯甲烷萃取，萃取液经饱和 食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，
硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1洗脱)后得 到棕黄色泡沫状产物303mg，收率49％。
[0137]
lc-ms：619.0(m h)

[0138]
14、化合物2-6的合成
[0139]
将化合物2-5(300mg，0.48mmol)和化合物1-3(188mg，0.48mmol)溶于 n,n-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(0.17ml，0.97mol)，此 反应50℃反应48小时。反应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水 溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1洗脱)后得到棕黄 色泡沫状产物203mg，收率51％。
[0140]
lc-ms：833.5(m h)

[0141]
15、化合物2的合成
[0142]
将化合物2-6(203mg，0.24mmol)溶于乙腈(30ml)中，加入苯磺酸(114mg， 0.72mmol)，回流反应24小时。反应液浓缩蒸干，多次硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷： 甲醇＝8:1洗脱)后得到白色泡沫状产物31mg，收率17％。
[0143]
lc-ms：759.5(m h)

.
[0144]1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.97(s,1h),8.23(s,1h),7.72-7.63(m, 2h),7.59(d,j＝8.4hz,1h),7.49-7.40(m,2h),7.22-7.09(m,6h),7.03 (dd,j＝8.4,2.2hz,1h),5.06(dd,j＝13.2,5.2hz,1h),4.64(s,1h),4.41
ꢀ-
4.19(m,2h),4.12-4.03(m,2h),3.50(t,j＝6.0hz,2h),3.42(t,j＝6.4 hz,2h),3.17(d,j＝5.2hz,1h),3.02(d,j＝6.4hz,2h),2.95-2.84(m, 1h),2.66-2.53(m,2h),2.44-2.28(m,1h),2.24-2.11(m,4h),2.02
-ꢀ
1.93(m,1h),1.91-1.71(m,4h),1.62-1.43(m,4h).
[0145]
实施例3化合物3的合成
[0146][0147]
1、化合物3-1的合成
[0148]
将化合物1-15(800mg，2.4mmol)和碳酸铯(1.5g，4.8mmol)溶于n,n-二 甲基甲酰胺(10ml)中，加入8-溴-1-辛醇(598mg，2.9mol)，50℃反应16小时。 反应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干， 硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1洗脱)后得到棕黄色泡沫状产物508mg， 收率46％。
[0149]
lc-ms：463.2(m h)

[0150]
2、化合物3-2的合成
[0151]
将化合物3-1(500mg，1.1mmol)和对甲苯磺酰氯(247mg，1.3mmol)溶 于二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(0.31ml，2.2mmol)和4-二甲氨基吡啶(10 mg，催化量)，室温反应16小时。反应液缓缓倒入水中，用二氯甲烷萃取，萃取液经 饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1洗脱) 后得到棕黄色泡沫状产物606mg，收率91％。
[0152]
lc-ms：617.4(m h)

[0153]
3、化合物3-3的合成
[0154]
将化合物3-2(300mg，0.48mmol)和化合物1-3(188mg，0.48mmol)溶于 n,n-二甲基甲酰胺(3ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(0.17ml，0.97mol)，此 反应50℃反应48小时。反应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水 溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1洗脱)后得到棕黄 色泡沫状产物403mg，收率50％。
[0155]
lc-ms：831.5(m h)

[0156]
4、化合物3的合成
[0157]
将化合物3-3(400mg，0.48mmol)溶于乙腈(50ml)中，加入苯磺酸(152mg， 0.96mmol)，回流反应24小时。反应液浓缩蒸干，多次硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷： 甲醇＝8:1洗脱)后得到白色泡沫状产物43mg，收率12％。
[0158]
lc-ms：757.5(m h)

.
[0159]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.98(s,1h),8.24(s,1h),7.73-7.57(m, 4h),7.47-7.40(m,2h),7.23-7.10(m,7h),7.04(dd,j＝8.4,2.4hz,1h), 5.07(dd,j＝13.2,5.2hz,1h),4.67(s,1h),4.41-4.21(m,2h),4.15-4.01 (m,3h),3.17(d,j＝5.2hz,2h),3.10-2.84(m,3h),2.69-2.52(m,2h), 2.48-2.26(m,4h),2.26-2.04(m,4h),2.03-1.83(m,4h),1.79-1.70 (m,2h),1.50-1.40(m,4h).
[0160]
实施例4化合物4的合成
[0161][0162]
1、化合物4-2的合成
[0163]
将化合物4-1(3.0g，10mmol)，n-boc-4-羟基哌啶(2.4g，12mmol)以及 三苯基膦(3.9g，15mmol)溶于四氢呋喃(50ml)中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯 (3.0g，15mmol)，氮气氛围下室温反应16小时。反应液加入适量乙酸乙酯稀释后 用饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1洗脱) 后得到棕红色泡沫状产物3.0g，收率78％。
[0164]
lc-ms：487.4(m h)

[0165]
2、化合物4-3的合成
[0166]
将化合物4-2(3.0g，6mmol)溶于二氯甲烷(30ml)中，缓慢滴加三氟乙酸 (3ml)，室温反应24小时。将反应液浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇 ＝30：1洗脱)后得到白色泡沫状产物2.2g，收率93％。
[0167]
lc-ms：387.3(m h)

[0168]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.26(s,1h),7.66(d,j＝8.0hz,2h),7.44 (t,j＝7.6hz,2h),7.31-7.04(m,5h),4.98(prs,1h),3.40
–
3.33(m, 2h),3.13-2.99(m,2h),2.36-2.18(m,2h),2.13-1.96(m,2h).
[0169]
3、化合物4-5的合成
[0170]
将化合物4-4(50.0g，148mmol)和氯化铵(39.3g，742mmol)溶于二氯甲烷 (700ml)中，加入n,n,n,n-四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(68.0g， 180mmol)和三乙胺(100ml，0.75mmol)，此反应常温反应16小时。反应液先后 用稀盐酸以及饱和食盐水溶液洗涤，有机相浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷： 甲醇＝80:1洗脱)后得到白色固体产物21.4g，收率43％。
[0171]
lc-ms：359.2(m na)

[0172]
4、化合物4-6的合成
[0173]
将化合物4-5(21.4g，64mmol)溶于甲醇(500ml)中，加入10％钯碳(湿重 3.0g)，氢气氛围下室温反应24小时。反应液过滤，浓缩蒸干，得到淡黄色油状产 物11.7g，收率91％。
[0174]
lc-ms：203.1(m h)

[0175]
5、化合物4-8的合成
[0176]
将化合物4-7(25.0g，164mmol)溶于甲醇溶液(150ml)中，在冰浴下缓慢 滴加硫酸(5ml)，回流反应3小时。反应液浓缩，缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取， 萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干，得到淡红色固体产物20.5g，收率75％。
[0177]
lc-ms：167.1(m h)

[0178]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.15(s,1h),7.77(d,j＝9.2hz,1h),6.72
-ꢀ
6.65(m,2h),3.76(s,3h),2.47(s,3h).
[0179]
6、化合物4-9的合成
[0180]
将化合物4-8(20.0g，120mmol)和咪唑(12.2g,180mmol)溶于二氯甲烷(200 ml)中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(21.6g，144mmol)，室温下反应16小时。反应 液过滤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝50:1洗脱)后得到无色 油状产物19.8g，收率59％。
[0181]
lc-ms：281.2(m h)

[0182]
7、化合物4-10的合成
[0183]
将化合物4-9(19.8g，70mmol)和n-溴代丁二酰亚胺(13.8g,78mmol)溶于 二氯乙烷(200ml)中，加入偶氮二异丁腈(1.1g，7mmol)，90℃反应16小时。 反应液浓缩，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100:1洗脱)后得到无色油状 产物30.1g(纯度40％，含大量原料和二溴化物，难以分离)。
[0184]
lc-ms：381.1(m na)

[0185]
8、化合物4-11的合成
[0186]
将化合物4-10(24.0g，26.8mmol,40％)和1-6(6.8g,33.6mmol)溶于乙 腈(200ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(12ml，68mmol)，回流反应16小时。反 应液浓缩，硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1洗脱)后得到棕黄色油状产 物6.0g，收率40％。
[0187]
lc-ms：449.3(m h)

[0188]
9、化合物4-12的合成
[0189]
将化合物4-11(6.0g，13.2mmol)溶于甲醇(100ml)中，加入四丁基氟化 铵(6.8g，26.4mmol)，室温反应16小时。反应液浓缩，硅胶柱色谱纯化(二氯甲 烷：甲醇＝20:1洗脱)后得到棕黄色油状产物3.7g，收率83％。
[0190]
lc-ms：335.3(m h)

[0191]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.13(s,1h),7.58-7.42(m,2h),7.16(s, 1h),6.94(d,j＝2.0hz,1h),6.86(dd,j＝8.4,2.0hz,1h),4.72-4.63 (m,1h),4.55-4.29(m,2h),2.21-2.06(m,3h),2.02-1.89(m,1h),1.33 (s,9h).
[0192]
10、化合物4-13的合成
[0193]
将化合物4-12(1.2g，3.6mmol)和碳酸铯(2.4g，7.2mmol)溶于n,n-二 甲基甲酰胺(15ml)中，加入1,2-双(2-碘代乙氧基)乙烷(2.6g，7.2mol)，常 温反应2小时。反应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗 涤，浓缩蒸干，硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1洗脱)后得到棕黄色泡沫状 产物520mg，收率25％。
[0194]
lc-ms：577.2(m h)

[0195]
11、化合物4-14的合成
[0196]
将化合物4-13(500mg，0.87mmol)和4-3(335mg，0.87mmol)溶于n,n-二 甲基甲酰胺(3ml)中，加入三乙胺(0.6ml，4.34mol)，此反应50℃反应48小时。 反应液缓缓倒入水中，用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水溶液洗涤，浓缩蒸干， 硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1洗脱)后得到棕黄色泡沫状产物305mg，收 率42％。
[0197]
lc-ms：835.3(m h)

[0198]
12、化合物4的合成
[0199]
将化合物4-14(300mg，0.36mmol)溶于乙腈(30ml)中，加入苯磺酸(114mg， 0.72mmol)，回流反应24小时。反应液浓缩蒸干，多次硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷： 甲醇＝8:1洗脱)后得到白色泡沫状产物52mg，收率19％。
[0200]
lc-ms：761.3(m h)

.
[0201]1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.97(s,1h),8.23(s,1h),7.68-7.64(m,2h), 7.61(d,j＝8.4hz,1h),7.46-7.40(m,2h),7.24-7.10(m,7h),7.06(dd,j ＝8.4,2.4hz,1h),5.06(dd,j＝13.2,5.2hz,1h),4.64(s,1h),4.40-4.16 (m,4h),3.85-3.74(m,2h),3.65-3.49(m,7h),3.02(s,2h),2.96-2.83 (m,1h),2.63-2.53(m,2h),2.42-2.29(m,1h),2.19(s,
4h),2.01-1.92 (m,1h),1.87(s,2h)
[0202]
实施例5化合物在透膜性及外排试验
[0203]
实验步骤：
[0204]
1)取处于对数生长期的caco-2细胞，消化离心后，用mem完全培养基将细胞浓度 调整为4
×
105个/ml。
[0205]
2)分别在transwell板的顶侧(ap侧)加入0.5ml的细胞悬液，基底侧(bl侧) 加入1.5ml的mem细胞完全培养基。
[0206]
3)放于细胞恒温培养箱中培养，每两天换一次培养液，培养一周后每日换液。
[0207]
4)约21天后，形成的连续单层膜的电阻值大于100ω
·
cm2，3-5天内进行转运实 验。
[0208]
5)将待测化合物溶液加入ap侧作为供给液(donor)，同时在基底侧(bl侧)加 入1.5ml接收液(receiver)。将培养板置于37℃的培养箱中转运90分钟后，将ap 侧与bl侧分离，终止反应。
[0209]
6)donor或receiver样品用0.4％二甲基亚砜的hbss稀释，然后与乙腈混合。lc条 件如下：流动相a:h2o-0.025％fa-1mm nh4oac，b:meoh-0.025％fa-1mm nh4oac。 色谱柱：acquity uplc beh_c18(2.1
×
50mm,1.7μm)。流速0.60ml/min。梯度： 0.2min 2％b，0.6min 98％b，1.3min 98％b，1.31min 2％b，1.8min停止。
[0210]
7)计算公式：
[0211]
papp＝(va/(面积
×
时间))
×
([药物]receiver/([药物]donor)
×
稀释倍 数
[0212]
式中，va是接收室中的体积，面积是膜的表面积，时间是总的传输时间，以秒 为单位。
[0213][0214]
药物分子从caco-2单细胞层的顶侧(ap侧)跨过单细胞层或经由细胞间隙到达 基底侧(bl侧)为a到b，反之是b到a，外排比值：papp(b-a)/papp(a-b)。实验结果 表明本发明的化合物1渗透性较好，非p-糖蛋白转运底物，无外排现象，具备良好的 成药性。
[0215]
实施例6 western blot检测化合物降解btk蛋白实验
[0216]
jeko-1细胞株用含20％胎牛血清的rpmi-1640培养基，于37℃、5％co2、饱和湿度 孵育箱内培养。待细胞生长至对数生长期，以每孔5
×
106个细胞接种于6孔培养板中， 设定dmso对照组、化合物测试组。
[0217]
药物处理24h后，收集细胞，加入预冷的细胞裂解液，冰上裂解45min，待细胞 裂解完全后，离心，取上清，冰浴保存。采用bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂 兼容型)测定蛋白浓度，制备蛋白样品。经sds-page凝胶电泳分离蛋白后，湿法转至 pvdf膜上，5％bsa溶液室温封闭1h。按实验要求加入稀释后的兔抗人btk及gapdh，4 ℃孵育过夜。tbst洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg二抗稀释液，室 温孵育1h。tbst洗膜后，加入ecl
发光液于凝胶成像仪中进行显影成像。
[0218]
使用image j软件对各条带进行灰度分析，以gapdh作为内参对照，计算化合物 降解btk蛋白的降解率。
[0219]
结果表明，本发明化合物具有很强的降解btk活性。
[0220]
实施例7化合物对tmd8细胞增殖抑制实验
[0221]
细胞培养：将tmd8细胞株(人淋巴瘤细胞)培养于含有10％胎牛血清和1％青霉素
ꢀ-
链霉素的rpmi-1640完全培养基中，于37℃、5％co2及饱和湿度条件下的培养箱培养。
[0222]
细胞铺板：取处于对数生长期的tmd8细胞，离心后，加入适量完全培养基获得 单细胞混悬液，采用血球计数板进行细胞计数，配制成1.5
×
105个/ml细胞悬液，以 每孔100μl细胞悬液接种于96孔培养板中，置于co2细胞培养箱培养24h。
[0223]
细胞给药：取实施例中的待测化合物，配制成2.5μm母液，每孔加入25μl实施 例化合物，摇匀，置于co2细胞培养箱中，继续培养72h。
[0224]
cck-8检测：给药72h后，每孔加入10％cck-8溶液，置于co2细胞培养箱中，孵育 1-4h。采用酶标仪于450nm下测定各孔吸光度。
[0225]
细胞增殖抑制率计算：
[0226]
细胞增殖抑制率(％)＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0227]
as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物溶液)
[0228]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液，不含药物)
[0229]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液，不含细胞、药物)
[0230]
结果表明，本发明化合物对tmd8细胞具有很强的增殖抑制活性。
[0231]
实施例8化合物在小鼠tmd-8肿瘤模型中的抗肿瘤作用
[0232]
tmd-8细胞培养于rpmi-1640培养基，含10％胎牛血清fbs。细胞放置于5％co2培养 箱37℃培养。
[0233]
细胞接种法建立肿瘤scid小鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计 数后重悬于rpmi-1640培养基中，1:1加入matrigel，调整细胞悬液浓度至4
×
107个细 胞/ml。用1ml注射器在scid小鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，4
×
106个细胞/0.1ml/鼠。
[0234]
待动物肿瘤平均体积约140mm3时，淘汰体积过大、过小或肿瘤形状不规则的动 物，选取瘤体积为101.34～209.86mm3的荷瘤鼠，随机区组法将动物分组，分别为模 型组、对照化合物组、化合物组，每组7只小鼠，分组当日记为day0，并按照动物体 重开始给药。
[0235]
给药14天后，测量肿瘤体积，并计算肿瘤抑制率，计算公式如下：
[0236]
肿瘤抑制率＝(1-给药组瘤体积/模型组瘤体积)*100％
[0237]
结果表明，本发明化合物具有很强的体内抗肿瘤作用。
[0238]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书 所限定的范围。