一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白及其应用的制作方法

一种大黄鱼tgf-β
1重组蛋白及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大黄鱼tgf-β1重组蛋白及其应用。


背景技术：

2.转化生长因子β（transforming growth factor-β，tgf-β）蛋白家族是tgf-β超家族成员，该家族蛋白是一类具有多效性的细胞因子。可参与调节淋巴细胞活化、增殖和分化，以及先天免疫细胞的发育和功能，促进血管生成和伤口愈合等。tgf-β家族主要由三个成员：tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3。其中tgf-β1主要由淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等产生，通过自分泌和旁分泌调节淋巴细胞的存活、增殖和分化。同时参与抑制天然杀伤细胞（natural killer cells, nk）的成熟；抑制树突状细胞（dendritic cells，dcs）的成熟和抗原呈递能力，同时，dcs可通过整合素促进tgf-β1活化，诱导外周调节性t细胞（peripheral regulatory t cells，ptreg）的生成，抑制致病性th17细胞（t helper 17 cells）的分化；可以增强肥大细胞（mast cells）趋化性以及粘附特性从而促进伤口愈合和组织修复；促进m2巨噬细胞（macrophages m2）活化以及粒细胞（granulocytes）的趋化性和存活。tgf-β1通过上述功能来控制炎症反应的发生和消退。目前多种鱼类的tgf-β1已经被克隆并鉴定，但是其应用型研究仍比较欠缺。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种大黄鱼tgf-β1重组蛋白及其应用。
4.为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：本发明首先提供了一种大黄鱼tgf-β1重组蛋白，所述大黄鱼tgf-β1重组蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no. 4所示。
5.本发明还提供了一种上述的大黄鱼tgf-β1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：将seq id no.3所示的核苷酸序列克隆到含有融合蛋白标签nusa的大肠杆菌表达载体pet-43.1a中，将得到的重组质粒转化至大肠杆菌（e. coli）rosetta（de3）中得到基因工程菌，命名为rosetta/pet-43.1a-tgf-β1；将rosetta/pet-43.1a-tgf-β1接种至lb培养液中，于37℃条件下培养，待菌液od
600
值至0.6时，加入终浓度为0.5 mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg），于37℃条件下诱导表达5 h，离心收集菌体，加入细菌裂解液重悬，破碎菌体后离心，然后纯化得到目标产物大黄鱼tgf-β1重组蛋白；其中，lb培养液配方为：1wt%蛋白胨 0.5wt%酵母抽提物 1wt%氯化钠 1 l ddh2o，细菌裂解液配方为：50 mm ph8.0 tris缓冲液 500 mm nacl 5%甘油 10 mm dtt (0.1-0.2) mm pmsf。
6.本发明还提供了上述一种tgf-β1重组蛋白在制备用于消除大黄鱼炎症的蛋白制剂中的应用。
7.本发明的显著优点在于：1、本发明所提供的大黄鱼tgf-β1重组蛋白具有良好的消除大黄鱼炎症反应效果。
8.2、本发明利用工程菌表达大黄鱼tgf-β1重组蛋白，制备工艺简单，投入成本低廉，
具有可观的经济效益。
附图说明
9.图1为大黄鱼tgf-β1重组蛋白的鉴定图。（a）诱导表达产物的sds page分析。m：标准蛋白分子量marker；1：未经iptg诱导的rossetta/pet-43.1(a)全菌总蛋白；2：iptg诱导后的rossetta/pet-43.1(a)全菌总蛋白；3：未经iptg诱导的rossetta /pet-43.1(a)-tgf-β1全菌总蛋白；4：iptg诱导后的rossetta/pet-43.1(a)-tgf-β1全菌总蛋白；5：纯化后的大黄鱼tgf-β1重组蛋白。（b）诱导表达产物的western-blotting 分析。m：标准蛋白分子量marker；1：纯化后的大黄鱼tgf-β1重组蛋白。
10.图2为大黄鱼tgf-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞炎症反应的抑制作用。（a）大黄鱼tgf-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞总活性氧和一氧化氮水平的影响。（b）大黄鱼tgf-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞中部分炎症相关基因表达的影响。
具体实施方式
11.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
12.以下实施例中所用到的材料如下：rna提取试剂盒（ls1040）和cdna第一链合成试剂盒（ls2052）购自promega公司，胶回收试剂盒购自omega公司 ，限制性内切酶购自thermo fisher公司 ，无缝拼接基因克隆试剂盒peasy-uni seamless cloning and assembly kit购自北京全式金生物技术有限公司，活性氧检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
13.大肠杆菌表达载体pet-43.1a（含融合蛋白标签nusa）购自novagen公司，e.coli rosetta (de3)购自北京全式金生物技术有限公司，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
14.lb琼脂平板培养基配方为：1wt%蛋白胨 0.5wt%酵母抽提物 1wt%氯化钠 1.5wt%琼脂粉1 l ddh2o。
15.lb培养液配方为：1wt%蛋白胨 0.5wt%酵母抽提物 1wt%氯化钠 1 l ddh2o。
16.细菌裂解液配方为：50 mm ph8.0 tris缓冲液 500 mm nacl 5%甘油 10 mm dtt (0.1-0.2) mm pmsf。
17.ni柱平衡液配方为：50 mm ph8.0 tris缓冲液 500 mm nacl 10 mm imidazole 5wt%甘油。
18.杂蛋白洗涤液配方为：50 mm ph8.0 tris缓冲液 500 mm nacl 30 mm imidazole 5wt%甘油。
19.蛋白洗脱液配方为：50 mm ph8.0 tris缓冲液 500 mm nacl 500 mm imidazole 5wt%甘油。
20.pbs缓冲液配方为：nacl 8 g，kcl 0.24 g，na2hpo
4 1.15 g，kh2po
4 0.2 g，加入ddh2o定容1 l。
21.实施例1 构建高效表达大黄鱼tgf-β1重组蛋白的大肠杆菌工程菌1 目的基因的获取
43.1a-tgf-β1。
24.实施例2大黄鱼tgf-β1重组蛋白的表达与纯化1 大黄鱼tgf-β1重组蛋白的表达分析挑取实施例1获得的基因工程菌rosetta/pet-43.1a-tgf-β1单菌落接种到lb培养液中，37℃，220 rpm震荡培养。待od
600
至0.6时，向菌液中加入终浓度为0.5 mm的iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）于37℃条件下诱导表达5 h，离心收集菌体，加入细菌裂解液重悬，用超声破碎仪破碎，收集上清。使用sds-page分析培养上清中大黄鱼tgf-β1重组蛋白的表达及纯化情况。结果显示，在大肠杆菌rosetta/pet-43.1a-tgf-β1工程菌体破碎后的上清中观察到分子量约为75 kda目的条带，并纯化得到高纯度的tgf-β1重组蛋白（图1a）。
25.2 大黄鱼tgf-β1重组蛋白纯化将上述经0.5 mm iptg在37℃条件下诱导5 h后的大肠杆菌rosetta/pet-43.1a-tgf-β1工程菌的菌液以6000g的条件在4℃下离心10 min以得到诱导后的工程菌菌体。按照菌体质量：缓冲液体积=1 g：5 ml的比例加入至细菌裂解液中，充分震荡重悬菌体，以看不到菌体沉淀为准。采用高压匀浆破碎的方法破碎细菌：高压破碎仪设定650 bar，4℃条件下破碎细菌，直至混合液变为澄清。将破碎后的混合液在8000g的条件下在4℃下离心10 min，直至细菌碎片完全沉积，收集上清溶液。向ni亲和层析柱中加入ni柱平衡液，平衡10 min，期间用移液枪吹打使平衡液充分接触ni介质，然后使ni柱平衡液自然流出，随后将上述获得的菌体破碎上清液加入平衡后的ni柱，使上清液中的目的蛋白与ni介质结合 2 h，然后使破碎上清液流出。再用20 ml杂蛋白洗涤液浸泡洗10 min以去除杂蛋白，重复清洗10次，至流出液无蛋白，用蛋白洗脱液进行洗脱目的蛋白。将纯化后的大黄鱼tgf-β1重组蛋白经pbs缓冲液于4℃透析3次，在12000g的条件下离心30 min，去除沉淀，即获得高纯度的大黄鱼tgf-β1重组蛋白（图1b）。
26.实施例3大黄鱼tgf-β1重组蛋白抑制巨噬细胞炎症反应功能1 大黄鱼头肾巨噬细胞的提取具体方法见参考文献（mao k, chen w, mu y, et al. fish & shellfish immunology, 2018, 80: 180-190.）。
27.2 大黄鱼tgf-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞总活性氧和一氧化氮水平的影响将新鲜提取的大黄鱼头肾巨噬细胞接种至6孔细胞培养板中，每孔2 ml（细胞密度为1
ꢀ×ꢀ
10
6 cells/ml）。实验分为4组，每组3个平行。pbs组，每孔加20 μl的pbs缓冲液；lps组，每孔加入20 μl 4 mg/ml的lps溶液（以pbs缓冲液为溶剂）；lps nusa组，每孔加入20 μl 4 mg/ml的lps溶液（以pbs缓冲液为溶剂）和2 μl 100 μg/ml的nusa蛋白溶液（以pbs缓冲液为溶剂）；lps tgf-β1组，每孔加入20 μl 4 mg/ml的lps溶液（以pbs缓冲液为溶剂）和 2 μl 100 μg/ml的大黄鱼tgf-β1重组蛋白溶液（以pbs缓冲液为溶剂）。在28℃条件下共同孵育24 h，使用活性氧检测试剂盒和一氧化氮检测试剂盒分别测定大黄鱼头肾巨噬细胞细胞内总活性氧和一氧化氮水平。结果显示，lps可显著诱导大黄鱼巨噬细胞产生活性氧（图2a）和一氧化氮（图2b）；lps处理组和lps nusa处理组巨噬细胞中的活性氧和一氧化氮水平无显著差异；与lps nusa处理组相比，lps tgf-β1处理组的大黄鱼头肾巨噬细胞中的总活性氧和一氧化氮的浓度均显著降低，分别为对照组的42%和44%。
28.3 大黄鱼tgf-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞中部分炎症相关基因表达的影响将新鲜提取的大黄鱼头肾巨噬细胞接种至细胞培养板中，每孔2 ml（细胞密度为1
ꢀ×ꢀ
10
6 cells/ml）。实验分为2组，每组3个平行。lps nusa组，每孔加入20 μl 4 mg/ml的lps溶液（以pbs缓冲液为溶剂）和 2 μl 100 μg/ml的nusa蛋白溶液（以pbs缓冲液为溶剂）；lps tgf-β1组，每孔加入20 μl 4 mg/ml的lps溶液（以pbs缓冲液为溶剂）和 2 μl 100 μg/ml的大黄鱼tgf-β1重组蛋白溶液（以pbs缓冲液为溶剂）。于处理后6、12和24 h收集细胞。参考rna提取试剂盒说明书提取细胞总rna， 检测提取rna的完整性及浓度，以提取的rna为模板合成cdna第一链，操作方法参考cdna 第一链合成试剂盒说明书。本研究所用tnf-α基因和inos基因的序列信息均由ncbi数据库查询获得，设计荧光定量引物：tnf-α-f（seq id no.6）：5
’‑
gggaaaacgcctcacacct-3’，tnf-α-r（seq id no.7）：5
’‑
ggcgttgtaccaaccctgt-3’；inos-f（seq id no.8）：5
’‑
caggtcttacagtaatccgtcg-3’，inos-r（seq id no.9）：5
’‑
aaaaccgccttgagatgttg-3’；内参基因为β-actin，计引荧光定量引物：β-actin-f（seq id no.10）：5
’‑
gacctgacagactacctcatg-3’,β-actin-r（seq id no.11）：5
’‑
agttgaaggtggtctcgtgga-3’。
29.使用sybr green i嵌合荧光法进行实时荧光定量pcr分析。荧光定量pcr总反应体系为20 μl，包括sybr green ii 10 μl，基因特异性荧光定量引物（浓度为10 μm）tnf-α-f/r或者inos-f/r各0.2 μl，cdna模板1 μl, 无核酸酶水8.6 μl。反应条件为：94℃预变性5 min；接着94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复40个循环。采用 2
−
δδct
法计算基因的相对表达量。结果显示：与lps nusa组相比，lps tgf-β1处理组的大黄鱼头肾巨噬细胞中inos基因的表达水平显著被抑制（图2c）；处理6 h时，与lps nusa组相比，lps tgf-β1处理组的大黄鱼头肾巨噬细胞中tnf-α基因的表达水平显著被抑制（图2d）。
30.以上结果表明，大黄鱼tgf-β1重组蛋白可通过抑制活性氧和一氧化氮的产生，抑制炎症相关基因的表达来抑制大黄鱼炎症反应。
31.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。