表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA中3-羟基己酸比例的方法与流程

表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha中3-羟基己酸比例的方法
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha中3-羟基己酸比例的方法。


背景技术：

2.聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha)是一类由微生物合成的高分子聚合物，具有可再生、可降解的特点且具有多元材料学性能，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。pha广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。pha根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。聚羟基丁酸酯（phb，或p(3hb)）是pha中的一种，是一种由细菌产生的复合生物聚合物，作为一种热塑性塑料，其机械和物理性能可与聚苯乙烯等传统塑料相媲美。然而，由于其高度结晶的性质，p(3hb) 比大多数传统塑料更脆和更硬，以至于作为商品塑料的替代品不具有实际应用价值。因此，需要生产包含 3hb 和更长链单体组合的共聚物，以实现热和物理性能的改进。聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(p(3hb-co-3hhx))是一种混合链长共聚物，较p(3hb)均聚物更柔韧，其中，3hhx（3-羟基己酸）单体部分在很大程度上决定了聚合物的性能。具有较高 3hhx 摩尔分数（简称h比例）的 p(3hb-co-3hhx) 共聚物可以表现出类似于低密度聚乙烯 (ldpe) 等常见商品塑料的特性。因此，提高微生物生产3hb-co-3hhx中3hhx的比例具有重要意义。
3.罗氏真养菌(ralstonia eutropha，又名cupriavidus necator)是研究pha合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于phb生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，罗氏真养菌可以积累phb；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，phb合成会受到影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供能够提高微生物生产pha中3-羟基己酸比例的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因，以及用于pha生产的工程化微生物。
5.具体地，本发明提供以下技术方案：第一方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶编码基因变体，其核苷酸序列如seq id no.1-7任一所示。
6.本发明通过实验证明，上述基因变体均能够显著提高菌株生产pha中3-羟基己酸的比例。
7.第二方面，本发明提供含有上述基因变体的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
8.在本发明的一些实施方式中，含有以上所述的基因变体的表达盒由启动子、以上所述的基因变体以及终止子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中也可不包含终止子，或者含有增强子等其他转录、翻译调控元件。
9.在本发明的一些实施方式中，含有以上所述的基因变体的载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制性载体和非复制型载体。携带上述核酸分子的载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。
10.在本发明的一些实施方式中提供了含有上述基因变体、表达盒或载体的大肠杆菌细胞和罗氏真养菌细胞，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
11.第三方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物生产pha中3-羟基己酸的比例中的应用，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的氨基酸序列如seq id no.9-15任一所示。
12.基于上述提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码以上所述的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的基因序列，编码同一氨基酸序列的基因序列并不唯一，但所有能够编码以上所述的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的基因均在本发明的保护范围内。
13.在本发明的一些实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1-7任一所示。
14.上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
15.第四方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶变体或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在构建生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的微生物中的应用。
16.基于本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体能够提高微生物生产pha中3-羟基己酸的比例的功能，编码这些变体的基因以及含有这些基因的生物材料可以用于构建生产pha的菌株。
17.上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
18.在本发明的一些实施方式中，将seq id no.1-7任一所示的基因导入罗氏真养菌中构建生产pha的菌株。
19.第五方面，本发明提供一种工程化罗氏真养菌，所述工程化罗氏真养菌表达所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的氨基酸序列如seq id no.9-15任一所示。
20.本发明中，表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体可通过以下任一种或多种方法实现：（1）导入包含乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的质粒；（2）在基因组中插入一个或多个拷贝的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因。
21.在本发明的一些实施方式中，通过在基因组中插入一个拷贝的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因来表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体。
22.在本发明的一些实施方式中，基因组中插入乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的位置为phac基因处。
23.在本发明的一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因如seq id no.1-7任一所示。这些编码基因的序列为根据罗氏真养菌的密码子偏好性并结合人工优化和筛选得到的能够在罗氏真养菌中高效、正确表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的序列，使用这些序列有利于促进乙酰乙酰辅酶a还原酶变体更好地在罗氏真养菌中发挥提高pha中3-羟基己酸的比例的作用。
24.在本发明的一些实施方式中，为促进聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的合成，所述工程化罗氏真养菌还包含以下修饰中的一种或多种：（1）表达能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体；（2）(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性增强。
25.其中，能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体可通过对细菌的pha聚合酶的氨基酸序列进行突变以使得其能够聚合c6脂肪酸（3-羟基己酸），可采用现有技术中的能够聚合c6脂肪酸（3-羟基己酸）的pha聚合酶变体，也可通过将现有技术中能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体的突变位点进行组合，获得新的更高效的pha聚合酶变体。
26.在本发明的一些实施方式中，所述能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体相比原始pha聚合酶，含有第149位天冬酰胺突变为丝氨酸的突变和第171位天冬氨酸突变为甘氨酸的突变。
27.在本发明的一些实施方式中，所述pha聚合酶变体的氨基酸序列如seq id no.16所示。
28.上述表达能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体通过以下任一种或多种方式实现：（1）导入包含所述能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体的编码基因的质粒；（2）在基因组中插入一个或多个拷贝的所述能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体的编码基因。
29.在本发明的一些实施方式中，表达能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体，同时失活基因组原始的pha聚合酶编码基因。
30.在本发明的一些实施方式中，将能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体的编码基因插入基因组中。
31.在本发明的一些实施方式中，导入含有能够合成聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的pha聚合酶变体的编码基因的表达质粒。
32.在本发明的一些实施方式中，所述表达质粒为稳定表达质粒，质粒的稳定表达通过在质粒中携带菌株生长必需的代谢物的合成基因，同时将基因组中的该合成基因失活实现。
33.在本发明的一些实施方式中，所述含有seq id no.16所示的pha聚合酶变体的编码基因的质粒还含有proc基因，且所述工程化罗氏真养菌的基因组proc基因失活。
34.上述增强酶的表达可通过以下（1）-（4）中的任意一种或多种方式实现：（1）导入含有所述酶的编码基因的载体；（2）增加基因组中所述酶的编码基因的拷贝数；（3）改变基因组中所述酶的编码基因的转录和/或翻译调控元件（包括启动子等）的序列；（4）改变所述酶的编码基因的核苷酸序列。
35.上述酶活性的增强可通过将所述酶的一个或多个氨基酸进行替换、缺失或插入实现。
no.5、seq id no.6、seq id no.7分别为表达序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7所示的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因的工程化罗氏真养菌。
具体实施方式
66.本发明的应用不限于其在下文说明书所述或所举例说明的方案。本发明能够用于其它实施方案并且可以多种方式实施或进行。此外，本文所用的短语和术语是用于描述的目的，而不应被视为限定。本文所用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在包括下文列举的项目及其等同物以及其它项目。
67.本发明提供的具体实施方案部分或全部基于以下发现：本发明发现了能够显著提高菌株生产pha中3-羟基己酸的比例的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因。这些乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因可以导入具有pha（尤其是p(3hb-co-3hhx)）合成所需的其他基因的菌株中，用于提高这些菌株生产pha中3-羟基己酸的比例，由此得到工程化微生物。这些工程化微生物可用于生产pha（尤其是p(3hb-co-3hhx)），进而提高现有pha发酵生产菌株发酵生产高3-羟基己酸比例的p(3hb-co-3hhx)的能力。在表达本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的基础上，工程化微生物还可进行其他修饰，本发明发现了乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的表达至少可以与pha聚合酶（phac）变体的表达、phaj的强化表达进行联合修饰，以使得高3-羟基己酸比例的p(3hb-co-3hhx)的产量进一步提升。
68.在一些实施方案中，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶变体，其具有seq id no.9-15任一所示的氨基酸序列。这些变体能够显著提高菌株生产pha中3-羟基己酸的比例。
69.在一些实施方案中，本发明提供编码乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的基因，这些基因具有seq id no.1-7任一所示的核苷酸序列。这些基因是在罗氏真养菌中优化表达的。
70.在一些实施方案中，本发明提供表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。
71.在一些实施方案中，本发明提供在基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。
72.在一些实施方案中，本发明提供在罗氏真养菌bps-050菌株的基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌较罗氏真养菌bps-050菌株生产的p(3hb-co-3hhx)中3-羟基己酸的比例显著提高。
73.在一些实施方案中，本发明提供在罗氏真养菌bps-050菌株的基因组中phac基因处插入上述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。
74.在一些实施方案中，本发明提供将罗氏真养菌h16菌株的基因组中的phac基因替换为编码pha聚合酶变体（序列如seq id no.16所示）的基因，并在其基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌生产的p(3hb-co-3hhx)中3-羟基己酸的比例显著提高。
75.在一些实施方案中，本发明提供将罗氏真养菌bps-050基因组 phaj4b基因上游启动子替换为seq id no.17所示启动子，并在其基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌生产的p(3hb-co-3hhx)中3-羟基己酸的比例显著提高。
id no.1-seq id no.7所示。
84.将上述优化后的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因送至合成时，dna序列的上游添加ggtctcatc，下游添加gtgaagagacc，以便于后续操作。
85.步骤3：构建含有目的基因的目标菌株将步骤1构建的质粒pko-c与基因合成公司返回的含有优化后的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的质粒运用goldengate的方式进行组装，得到分别携带不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因的重组质粒pko-c-n（n代表装载的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因）。将各质粒分别转入大肠杆菌s17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌bps-050中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有500μg/ml壮观霉素与100μg/ml安普霉素的lb平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的h1和h2所在的特定位置，由此得到第一次同源重组菌。
86.将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的lb平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有壮观霉素抗性的克隆，并用引物fphach1-f：tggtctggctggcggactgag 和phach2-r：ggcgaactcatcctgcgcctc进行pcr，测序鉴定插入了目的基因的重组菌，得到的重组菌为稳定质粒版本的罗氏真养菌reδprocδphac::n，n为插入的基因。
87.步骤4：构建过表达罗氏真养菌原始phab基因的重组菌参考步骤3中构建重组质粒的方法，利用gibson组装的方式构建含有罗氏真养菌原始phab基因的重组质粒，具体方法如下：以步骤1中得到的质粒为模板进行pcr扩增，得到质粒骨架片段。以罗氏真养菌bps-050基因组为模板扩增得到phab基因片段。将上述两个片段通过gibson assembly方法进行连接，得到重组质粒pko-c-phab。使用的引物如表2所示。
88.表2将pko-c-phab质粒转入大肠杆菌s17-1中，参考上述步骤3中的方法构建重组菌，最终得到将phab基因整合在罗氏真养菌基因组phac基因处的过表达菌株reδphac::phab，简记为phab过表达。
89.实施例2 菌株的发酵性能测试以罗氏真养菌bps-050和过表达菌株reδphac::phab为对照菌，对表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株的发酵性能进行测试。
90.首先，将甘油管保存的实施例1构建的各菌株（1000μl）分别接种于种子培养基ⅰ中(20ml)，进行12小时的种子一级培养；然后，将1％的种子培养液ⅰ接种于种子培养基ⅱ中，进行二级种子培养；然后将10 v/v%的种子培养液ⅱ接种于装有1.1l生产培养基的2l 小型
发酵罐（迪必尔公司）中。运行条件为培养温度30℃、搅拌速度800rpm、通气量1l/min，将ph控制为6 .7～6 .8之间。ph控制中使用了28％的氨水溶液。在培养过程中，持续的使用棕榈油作为碳源，培养时间为54小时。
91.取发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。测定干燥菌体的重量记为干重。向所得的干燥菌体中加入100ml氯仿，于室温搅拌一昼夜，抽提菌体内的聚酯。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容积为约30ml，然后缓慢加入约90 ml的己烷，在缓慢搅拌下放置1小时。将析出的聚酯滤出后，于5ctc真空干燥3小时。测定干燥聚酯的质量，计算菌体内的聚酯含量。
92.结果显示，表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株的pha比例均不低于对照菌，且与对照菌相比，表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株生产的pha中h比例均明显提高，各菌株生产的pha中h比例如图1所示。
93.实施例3 以bps-050为出发菌构建表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的转化体库及其发酵性能测试本实施例以bps-050作为出发菌，将phaj4b基因上游启动子替换为phaj194（seq id no.17），并在其中表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因（seq id no.1-7）。
94.步骤1：通过同源重组的方式替换bps-050的phaj4b基因上游启动子（1）以罗氏真养菌bps-050基因组为模板进行pcr扩增，使用phaj-h1 fp、phaj-h1 rp得到phaj基因启动子的上游同源片段h1；使用phaj-h2 fp、phaj-h2 rp得到phaj基因启动子的上游同源片段h2。
95.（2）基因合成phaj基因的启动子phaj194（seq id no.17）（3）将pcr得到的h1和h2以及phaj194启动子通过gibson assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pk18mob-phaj194。使用的引物如表3所示。
96.表3（4）将重组质粒pk18mob-phaj194转入大肠杆菌s17-1中，再通过接合转化方法转入出发菌中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素lb平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的h1和h2所在的特定位置，由此得到第一次同源重组菌。
97.将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的lb平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phaj fp和phaj rp进行pcr鉴别出相应大小的重组菌，得到的重组菌为罗氏真养菌reδphac::phacac_phaj194，简记为re_phaj194。
98.步骤2：在罗氏真养菌reδphac::phacac_phaj194的基因组中分别插入不同的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因（seq id no.1-7），方法参考实施例1。
99.步骤3：在罗氏真养菌reδphac::phacac_phaj194中过表达罗氏真养菌原始phab基因，得到phab过表达菌株phab过表达-2。
100.步骤4：将步骤2和3中构建的菌株按照实施例1的方法进行发酵培养和pha检测。结果显示，表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株的pha比例均不低于对照菌，且与对照菌相比，表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株生产的pha中h比例均明显提高，各菌株生产的pha中h比例如图2所示。
101.实施例4 以h16为出发菌构建表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的转化体库及其发酵性能测试本实施例以罗氏真养菌h16作为出发菌，将h16的基因组phac基因突变为phac基因变体（编码蛋白序列如seq id no.16所示），使得重组菌获得合成3hhx的能力，在所获重组菌中表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因（seq id no.1-7）。
102.步骤1：替换罗氏真养菌基因组上的phac基因基因合成seq id no.8所示序列，该序列带有phac基因上下游约600bp及phac基因变体。质粒构建利用实施例1的步骤1中构建好的质粒，在基因合成时dna序列的上游添加ggtctcatc，下游添加gtgaagagacc。将合成基因通过goldengate方法与载体片段连接，得到重组质粒pk18mob-δphac::phacac。
103.将重组质粒pk18mob-δphac::phacac转入大肠杆菌s17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的lb平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒 整合到基因组上的h1和h2所在的特定位置，由此得到第一次同源重组菌。
104.将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的lb平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phac-h1 fp和phac-h2 rp进行pcr，测序鉴别出phac基因替换的重组菌，得到的重组菌为罗氏真养菌reδphac::phacac，简记为re_h16。
105.步骤2：在步骤1构建的罗氏真养菌reδphac::phacac的基因组中分别插入不同的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因（seq id no.1-7），方法参考实施例1。
106.步骤3：在步骤1构建的罗氏真养菌reδphac::phacac中过表达罗氏真养菌h16的原始phab基因，得到phab过表达菌株phab过表达-3。
107.步骤4：将步骤2和3中构建的菌株按照实施例1的方法进行发酵培养和pha检测。结果显示，表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株的pha比例均不低于对照菌，且与对照菌相比，表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的各菌株生产的pha中h比例均明显提高，各菌株生产的pha中h比例如图3所示。
108.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。