一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂

一种alport综合征患者col4a5致病突变基因及其检测试剂
技术领域
1.本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种alport综合征患者col4a5致病突变基因及其检测试剂。


背景技术：

2.alport综合征(alport syndrome,as)是一种常见的遗传性肾炎综合征，主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常。该病是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分-iv胶原基因突变而产生的肾小球基底膜疾病。iv型胶原6条
ɑ
链聚合成3条三股螺旋分子结构称为单体，单体聚合形成二聚体或四聚体，再相互绞连形成胶原网状结构。电镜下可观察到alport综合征特征性的病理改变，肾小球基底膜(glomerular basement membrane，gbm)广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变。gbm致密层不规则的外观是超微结构最突出的异常，其范围既可累及所有的毛细血管襻或毛细血管襻内所有的区域，也可累及部分毛细血管襻或毛细血管襻内的部分区域。因此，临床常用肾活检术从病理上加以诊断，但这是一种有创检查，患者可能因此而出现并发症。不能为上述患者提供准确的治疗指导。
3.近年来，as的致病基因已经被鉴定出来，使得肾病综合征的基因诊断成为可能。这些致病基因包括col4a5、col4a6、col4a3和col4a4，其筛查可以帮助临床医师完成as的“基因诊断”。这不仅可避免临床盲目用药及由此带来的药物不良反应和经济负担，对某些患者还可能进行早期干预或治疗，延迟甚至避免终末期肾脏病(end stage renal disease，esrd)的发生。
4.既往的研究显示：基因突变多位于全外显子区域，表现为某种氨基酸编码的突变。目前，对as患者的致病基因的检测，多采用全外显子测序技术。如中国专利申请cn104450726a公开的col4a5基因突变体及其应用。
5.然而，最近报道在基因内含子区域同样也可以存在某些突变而导致mrna剪接改变。这些突变需要在mrna水平对编码基因产生的效应进行证明。因此，鉴定内含子区域的致病突变，并研发省时、精准的对实验条件要求较低的诊断试剂对as患者进行快速检测，对as临床基因诊断具有必要性。
6.目前，对于as患者基因内含子区域突变导致mrna剪接改变而致病的报道相对较少。


技术实现要素：

7.有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可导致mrna剪接异常的as致病基因突变，并基于此研发了突变检测试剂。该突变检测试剂可以快速、准确判断检测对象是否具有此致病突变。
8.本发明提供一种alport综合征患者col4a5致病突变基因，所述突变位于col4a5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439-7(ivs7)a》g；
此突变可引起col4a5基因的mrna剪接异常，导致改变编码蛋白质结构的移码突变。
9.进一步，所述mrna剪接异常是指mrna rt-pcr产物第439-7位多余6个碱基taatag。
10.本发明还提供上述col4a5致病突变基因的病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括基因组dna点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组dna提取试剂盒；2)dna-pcr扩增试剂盒：采用引物p1和p2扩增患者基因组dna，获得目的条带；3)dna-pcr产物sanger测序试剂盒：以引物p2对dna-pcr产物sanger测序；当检测得到col4a5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即col4a5,c.439-7(ivs7)a》g，确诊为alport综合征患者。
11.其中，p1:agcattctgtaattggcgtgtt(seq id no.1)；
12.p2:attgaagttgccagctttcct(seq id no.2)。
13.进一步，所述用于患者基因组dna提取的样本为：外周血、尿液或指甲。
14.本发明还提供上述col4a5致病突变基因的另一病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括mrna突变分析试剂，所述试剂包括1)患者样本rna提取试剂盒；2))rt-pcr扩增试剂盒：以引物p3和p4扩增患者rna，获得目的条带；3)rt-pcr产物sanger测序试剂盒：以引物p3对rt-pcr产物sanger测序；当检测得到mrna rt-pcr产物第439-7位多余6个碱基taatag时，确诊为alport综合征患者。
15.其中，p3:atgcaatggaaccaagggag(seq id no.3)；
16.p4:catcaaacctggtggtcctg(seq id no.4)。
17.进一步，所述用于患者rna提取的样本为：尿液或血液。
18.本发明还提供上述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组dna的引物对组p1和p2，其核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
19.上述病因学诊断试剂中用于基因组dna-pcr产物sanger测序的引物，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
20.本发明还提供上述病因学诊断试剂中用于扩增患者rna的引物对组p3和p4，其核苷酸序列如seq id no.3-4所示。
21.上述病因学诊断试剂中用于rt-pcr产物sanger测序的引物，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
22.本发明还提供上述病因学诊断试剂的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对组中的4条单链dna分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：pcr反应缓冲液、dna聚合酶和4种dntp。
23.该突变不存在于clinvar数据库、dbsnp等数据库，为新发现的致病突变，可引起x-连锁显性遗传的as临床表现。
24.与现有技术相比，本发明的优势在于：
25.1.本发明公开的col4a5致病突变基因是临床as患者的致病突变之一，该突变导致mrna剪接异常，进而导致蛋白翻译提前终止，编码蛋白功能异常。
26.2.本发明的检测试剂可有效、快速地检测col4a5的上述致病突变。
27.3.本发明的检测试剂价格低廉，可减轻患者经济负担。
附图说明
28.图1：剪接突变示意图
29.图中，正常情况下，初始转录产生的mrna加工会除去内含子。当内含子中的突变产生一个新的剪接位点时，导致一小段内含子序列不能被完全切除，导致编码框改变，基因所编码的蛋白功能异常。
30.图2：血液细胞基因组dna提取
31.图中，采用本发明血液基因组dna提取试剂盒分离获得外周血细胞dna。
32.(m:dna marker；1～2：患者dna样品；3-4：对照dna样品。)
33.图3：本发明col4a5致病突变基因的突变区域扩增
34.图中，采用引物p1和p2扩增患者基因组dna，获得目的条带。
35.(m:dna marker；1～2：患者dna样品；3-4：对照dna样品。)
36.图4：genomic dna-pcr产物sanger测序
37.图中，将pcr产物直接电泳、切胶纯化后进行测序。
38.结果显示，患者1基因组dna中存在一个点突变c.439-7(ivs7)a》g(竖线标记处)。
39.图5：rt-pcr扩增col4a5
40.图中，以引物p3和p4扩增患者尿液细胞rna样品，获得目的条带。
41.(m:rna marker；1～2：患者dna样品；3-4：对照dna样品。)
42.图6：rt-pcr产物sanger测序
43.图中，将rt-pcr产物直接电泳、切胶纯化后进行测序。结果显示，患者mrna rt-pcr产物多余了6个碱基。
具体实施方式
44.实施例1本发明alport综合征患者col4a5致病突变基因患者症状及致病突变基因的发现
45.来自新桥医院肾内科患者，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是as患者。经全序列测序，比对，发现本发明alport综合征患者col4a5致病突变基因。
46.col4a5基因原始序列如seq id no.5所示。此序列包含本发明突变基因位点在内的部分基因组dna序列。
47.实施例2本发明col4a 5致病突变基因区域扩增引物的设计与合成
48.从ncbi数据库中获得col4a5基因组序列，应用primer软件设计设计检测引物，所用引物序列如下。引物从北京六合华大基因有限公司合成，采用page纯化。
49.col4a 5基因突变区域扩增引物
50.p1:agcattctgtaattggcgtgtt(seq id no.1)
51.p2:attgaagttgccagctttcct(seq id no.2)
52.sanger测序引物:p2
53.col4a5 mrna剪接异常的rt-pct检测引物
54.p3:atgcaatggaaccaagggag(seq id no.3)
55.p4:catcaaacctggtggtcctg(seq id no.4)
56.sanger测序引物:p3。
57.实施例3：本发明col4a 5致病突变基因的检测试剂，以及致病突变基因的检测和验证
58.一、获取临床样本并设置实验组和对照组
59.1)实验组
60.患者1，样本来自新桥医院肾内科，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是as患者。
61.患者2，样本来自新桥医院肾内科，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是as患者。
62.3)对照组
63.选取2例正常人为对照组，样品编号：3、4。
64.二、实验方案与步骤
65.1.筛查检测：
66.本发明诊断试剂i包括1)测试者样本基因组dna提取试剂盒；2)pcr扩增试剂盒:采用引物p1和p2扩增测试者基因组dna，获得目的条带；3)测序试剂盒：genomic dna-pcr产物sanger测序。
67.当检测得到col4a5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即col4a5,c.439-7(ivs7)a》g，确诊断为alport综合征患者。
68.1.1本实施例中基因组dna提取样品为外周血样本。
69.采用本发明基因组dna提取试剂盒(离心柱法)提取外周血样品基因组dna。
70.1.1.1取抗凝的外周血200μl。
71.1.1.2加入20μl proteinase k溶液，混匀。
72.1.1.3加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min。
73.1.1.4加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec。
74.1.1.5将上一步所得溶液加入吸附柱中，12000rpm/30sec，弃废液。
75.1.1.6向吸附柱中加入500μl gd，12000rpm/30sec，弃废液。
76.1.1.7向吸附柱中加入600μl pw，12000rpm/30sec，弃废液，重复一次。
77.1.1.8 12000rpm/2min。
78.1.1.9吸附柱移到新的1.5ml离心管中，室温5min，晾干。
79.1.1.10加入30μl tb，室温3min溶解，12000rpm/2min，得到dna样品。(如图2所示)
80.1.2采用本发明pcr扩增试剂盒：引物p1和p2扩增测试者基因组dna，获得目的条带。如图3所示。
81.1.2.1基因组dna样品的pcr反应体系组成
82.1.2.1.1引物稀释：合成的引物加水溶解至10μm，备用。
83.1.2.1.2反应体系组成:
84.85.混匀后进行下一步。
86.1.2.2基因组dna样品的pcr检测
87.1.2.2.1 pcr反应条件
[0088][0089]
1.2.2.2 pcr产物电泳检测
[0090]
pcr反应结束后，取5μl产物，于2％琼脂糖凝胶中进行电泳，观察产物的有无及分子量大小。
[0091]
1.3采用本发明测序试剂盒：基因组dna样品的pcr产物的序列测定：
[0092]
将上述产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后切除相应的dna条带回收纯化产物。采用sanger法直接测定序列，获得相应的峰图。
[0093]
1.4结果显示：
[0094]
患者甲：基因组dna中存在一个点突变c.439-7(ivs7)a》g，如图4所示。
[0095]
患者乙：基因组dna正常。
[0096]
对照组1：基因组dna正常。
[0097]
对照组2：基因组dna正常。
[0098]
2.确诊验证：
[0099]
本发明诊断试剂ⅱ包括mrna突变分析试剂，所述试剂包括1)患者样本rna提取试剂盒；2)rt-pcr扩增试剂盒：以引物p3和p4扩增患者rna，获得目的条带；3)测序试剂盒：rt-pcr产物sanger测序。
[0100]
当检测得到mrna rt-pcr产物第439位多余6个碱基taatag时，确诊为本发明突变基因引起的alport综合征患者。
[0101]
2.1本实施例中患者rna提取样本为尿液样本
[0102]
采用本发明rnaeasy动物rna抽提试剂盒(离心柱法)提取尿液样本rna。
[0103]
2.1.1收集新鲜尿液200ml；
[0104]
2.1.2离心，收获细胞沉淀；
[0105]
2.1.3加入裂解液300μl，轻轻吹打8-10次，至固悬物溶解；
[0106]
2.1.4加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次；
[0107]
2.1.5将混合物转移至纯化柱内，12,000g离心30秒，弃液体；
[0108]
2.1.6加入600μl洗涤液i，12,000g离心30秒，弃液体；
[0109]
2.1.7加入600μl洗涤液ii，12,000g离心30秒，弃液体；重复步骤2.1.7一次；
[0110]
2.1.8最高速(约14,000-16,000g)离心1分钟，去除残留的液体；
[0111]
2.1.9加入30-50μl洗脱液，室温放置2-3分钟，最高速离心30秒，得到rna。
[0112]
2.2 rna样品的检测
[0113]
2.2.1 rt反应
[0114]
采用本发明rt-pcr扩增试剂盒(mce公司产品)，rt master mix for qpcr(gdna digester plus)进行反应。
[0115]
2.2.1.1反应体系组成
[0116][0117]
2.2.1.2用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。
[0118]
2.2.1.3直接加入2
×
super rt mix，用移液器轻轻吹打混匀。
[0119]
2.2.1.4按如下操作，完成rt反应。
[0120]
25℃ 5分钟
[0121]
42℃ 60分钟
[0122]
85℃ 2分钟
[0123]
产物备用。
[0124]
2.2.2 pcr扩增错误拼接位点部分序列
[0125]
反应体系组成:
[0126][0127][0128]
混匀后进行下一步。
[0129]
pcr反应条件
[0130][0131]
rt-pcr反应结束后，取5μl产物，于2％琼脂糖凝胶中进行电泳，观察产物的有无及分子量大小。(如图5所示)
[0132]
2.2.3采用本发明rt-pcr产物sanger测序试剂盒：sanger测序分析rt-pcr产物并与基因组dna pcr产物比较。
[0133]
将上述rt-pcr产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后切除相应的dna条带回收纯化产物。采用sanger法直接测定序列，获得相应的峰图。(如图6所示)
[0134]
2.3结果显示：
[0135]
患者甲：mrna第439位多余了6个碱基，与基因组dna中的点突变c.439-7(ivs7)a》g相对应，确诊为因本发明突变基因引起的alport综合征患者。
[0136]
患者乙：mrna正常。其他突变引起的alport综合征患者。
[0137]
对照组1：mrna正常。
[0138]
对照组2：mrna正常。
[0139]
对照组3：mrna正常。
[0140]
突变机理如图1所示。
[0141]
实施例4：
[0142]
实施例3的1部分作为检测试剂独立使用。
[0143]
实施例5：
[0144]
实施例3的2部分作为另一检测试剂独立使用。
[0145]
实施例6：
[0146]
与实施例2基本相同，所不同之处在于：
[0147]
本实施例中患者基因组dna提取样品为指甲。
[0148]
1.1指甲dna提取
[0149]
1.1.1指甲剪碎后，装入2ml离心管内。
[0150]
1.1.2.加入1ml 75％乙醇，离心甩一下，去上清。
[0151]
1.1.3.加入1ml水，离心甩一下，去上清。
[0152]
1.1.4.加入1ml水，离心甩一下，去上清。
[0153]
1.1.5.加入200μlga，20μl蛋白酶k，20μl 1m dtt，混匀。
[0154]
1.1.6. 56℃孵育3小时。
[0155]
1.1.7.离心甩一下，将上清移到新管，加入200μlgb。
[0156]
1.1.8. 56℃孵育10min，每3min漩涡混匀一下。
[0157]
1.1.9.加200μl无水乙醇，漩涡混匀，将溶液分加入到一个吸附柱中，12000rpm/30sec，弃废液。
[0158]
1.1.10.向吸附柱中加入500μl gd，12000rpm/30sec，弃废液。
[0159]
1.1.11.向吸附柱中加入600μl pw，12000rpm/30sec，弃废液，重复一次。
[0160]
1.1.12. 12000rpm/2min。
[0161]
1.1.13.吸附柱移到新的1.5ml离心管中，室温5min，晾干。
[0162]
1.1.14.加入30μl tb，室温3min溶解，12000rpm/2min，得到dna样品。
[0163]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。