抗AMH的抗体、检测AMH的试剂和试剂盒的制作方法

抗amh的抗体、检测amh的试剂和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗amh的抗体、检测amh的试剂和试剂盒。


背景技术：

2.抗穆勒氏管激素(anti-mullerian hormone，amh)是转化生长因子β超家族中的一员，由professor alfred jost于1974年首先发现。它是由两个70kd的蛋白亚基通过二硫键组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140kd，其主要作用是影响卵泡的成长和分化。人类编码amh的基因位于19p13.3号染色体，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。研究表明，amh的n端区域对保持蛋白完整活性起关键作用，在代谢运输过程中，amh的特定位点(451位氨基酸)可以被切开，形成前体片段(pro-amh，26-451aar)以及成熟片段(mature amh，452-560aar)，而切开的两个片段能够再通过非共价键的形式连接在一起。
3.amh在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性胎儿的塞尔托利氏细胞中，转录因子sox-9(transcription factor sox-9，sox9)可激活amh与抗穆勒激素受体ii型(anti-mullerian hormone receptor type ii，amhr2)相结合并导致雄性胚胎中的穆勒氏管退化，从而阻止输卵管、子宫和阴道上部的形成，使男性生殖管道正常发育。而在女性胚胎中穆勒氏管将分化为子宫管和输卵管。amh也是女性的窦前卵泡和小窦卵泡颗粒细胞的产物，从青春期开始，血清中amh水平随时间慢慢降低，并在更年期降低到elisa法检测不到的水平。amh的正常值界于2-6.8ng/ml之间，数值越高，代表卵子存量越丰沛，适合受孕的黄金期较长，数值越低则卵巢功能越差。35岁过后amh值会开始急剧下降，当低于0.7ng/ml时，表示卵子库存量已严重不足，几乎难以受孕。若数值大于6.8时，可考虑有多囊性卵巢症候群的体质。使用排卵针剂、药物时，卵巢也容易反应过度而排出过多的卵子，造成卵巢过度刺激症候群。因此可通过检测amh水平来判断卵子存量及卵巢功能，并可以作为体外受精联合胚胎移植术(ivf)的卵巢反应性、多囊性卵巢综合征(pcos)、卵巢过度刺激综合症(ohss)的诊断依据。
4.目前国内外临床上检测amh的常用方法有酶联免疫吸附法(elisa)、电化学发光法和化学发光法。其中elisa方法耗时长、灵敏度低、背景值高、易造成假阳性和假阴性结果，并且需要专业人员进行操作。电化学发光法和化学发光法如罗氏的elecsys amh检测仪目前逐渐替换elisa法，但价格昂贵，不适合单人份和小批量检测用，加上需要专门的仪器使用人员，维修和检测成本均较高，不适合大范围推广使用。上述方法都需要借助抗amh的单克隆抗体，而目前amh单克隆抗体产品较少，性能存在差异，特异性和灵敏度也存在缺陷。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种抗amh的抗体、检测amh的试剂和试剂盒。本发明提供的抗体能够特异性结合amh，对amh具有较好的亲和力，采用该抗体检测amh，具有较高的灵
敏度和特异性。
7.本发明是这样实现的：
8.一方面，本发明提供一种抗amh的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：
9.cdr-vh1：g-f-x1-f-s-x2-f-g-m-s；其中：x1是s或t；x2是i、v或l；
10.cdr-vh2：t-x1-s-n-g-g-x2-y-t-y-y-p-x3-s-x4-k-g；其中：x1是l或i；x2是t或s；x3是e或d；x4是i、v或l；
11.cdr-vh3：x1-r-h-p-r-x2-n-g-x3-d-g-a-m；其中：x1是a或t；x2是i、v或l；x3是y、f或s；
12.cdr-vl1：a-s-x1-s-x2-d-n-y-d-x3-s-f-m；其中：x1是q或e；x2是i、v或l；x3是i或l；
13.cdr-vl2：a-a-s-n-x1-x2-s；其中：x1是k、q或r；x2是g或a；
14.cdr-vl3：q-q-s-x1-e-x2-p-w；其中：x1是k和r；x2是l、v或i。
15.本发明提供的针对amh的抗体或其功能性片段，具有上述互补决定区结构；上述抗体或其功能性片段能够特异性结合amh，对amh具有较好的亲和力，采用该抗体检测amh，具有较高的灵敏度和特异性。本发明为amh提供了更多以及性能更佳的抗体选择。
16.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是i；cdr-vh3中，x1是t；cdr-vl1中，x3是i；cdr-vl2中，x2是g；cdr-vl3中，x1是k。
17.本发明的实施例发现，当上述互补决定区中的上述突变位点为上述氨基酸残基时，该抗体对amh表现出更好的亲和力。
18.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是s。
19.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是t。
20.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是i。
21.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是v。
22.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是l。
23.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x2是t。
24.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x2是s。
25.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是e。
26.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是d。
27.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是i。
28.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是v。
29.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是l。
30.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是i。
31.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是v。
32.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是l。
33.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x3是y。
34.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x3是f。
35.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x3是s。
36.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x1是q。
37.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x1是e。
38.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是i。
39.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是v。
40.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是l。
41.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是k。
42.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是q。
43.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是r。
44.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是l。
45.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是v。
46.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是i。
47.在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合1-55中的任意一种：
48.[0049][0050]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段与amh以kd≤2.6
×
10-8
mol/l的亲和力结合。
[0051]
在可选的实施方式中，kd≤2
×
10-8
mol/l、kd≤1
×
10-8
mol/l、kd≤9
×
10-9
mol/l、kd≤8
×
10-9
mol/l、kd≤7
×
10-9
mol/l、kd≤6
×
10-9
mol/l、kd≤5
×
10-9
mol/l、kd≤4
×
10-9
mol/l、kd≤3
×
10-9
mol/l、kd≤2
×
10-9
mol/l或kd≤1
×
10-9
mol/l。
[0052]
在可选的实施方式中，kd≤9
×
10-9
mol/l。
[0053]
在可选的实施方式中，1.52
×
10-9
mol/l≤kd≤8.94
×
10-9
mol/l。
[0054]
kd的检测参考本发明实施例中的方法进行。
[0055]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是l；cdr-vh3中，x1是a；cdr-vl1中，x3是l；cdr-vl2中，x2是a；cdr-vl3中，x1是r。
[0056]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合56-62中的任意一种：
[0057][0058]
在可选的实施方式中，所述抗体包括序列依次如seq id no:1-4所示的轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l，和/或，序列依次如seq id no:5-8所示的重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h。
[0059]
通常情况下，重链可变区(vh)和轻链的可变区(vl)可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0060]
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(seq id no:1、2、3、4、5、6、7或8)可以具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
[0061]
在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。
[0062]
在可选的实施方式中，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区。
[0063]
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
[0064]
在可选的实施方式中，所述恒定区来源于小鼠。
[0065]
在可选的实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如seq id no:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如seq id no:10所示。
[0066]
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的vhh、f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。
[0067]
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
[0068]
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
[0069]
另一方面，本发明提供一种检测amh的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段。
[0070]
在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
[0071]
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
[0072]
在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
[0073]
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
[0074]
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。
[0075]
在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
[0076]
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于
212
bi、
131
i、
111
in、
90
y、
186
re、
211
at、
125
i、
188
re、
153
sm、
213
bi、
32
p、
94
mtc、
99
mtc、
203
pb、
67
ga、
68
ga、
43
sc、
47
sc、
110
min、
97
ru、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
68
cu、
86
y、
88
y、
121
sn、
161
tb、
166
ho、
105
rh、
177
lu、
172
lu和
18
f。
[0077]
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
[0078]
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
[0079]
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
[0080]
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
[0081]
另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
[0082]
另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
[0083]
另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。
[0084]
另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
[0085]
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
附图说明
[0086]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0087]
图1为实施例1的抗amh的抗体的还原性sds-page的结果。
具体实施方式
[0088]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0089]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等
同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
[0090]
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
[0091]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0092]
实施例1
[0093]
本实施例中限制性内切酶、prime star dna聚合酶购自takara公司。magextractor-rna提取试剂盒购自toyobo公司。bd smart
tm race cdna amplification kit试剂盒购自takara公司。pmd-18t载体购自takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由invitrogen公司完成。
[0094]
1重组质粒的构建
[0095]
(1)抗体基因制备
[0096]
从分泌抗amh抗体的杂交瘤细胞株中提取mrna，通过rt-pcr方法获得dna产物，该产物用rtaq dna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavy chain及light chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。
[0097]
(2)抗体可变区基因的序列分析
[0098]
将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中light chain扩增出的基因片段中，vl基因序列为336bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavy chain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为366bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
[0099]
(3)重组抗体表达质粒的构建
[0100]
pcdna
tm
3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入hindiii、bamhi、ecori等多克隆酶切位点，并命名为pcdna3.4a表达载体，后续简称3.4a表达载体；根据上述pmd-18t中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的vl和vh基因特异性引物，两端分别带有hindiii、ecori酶切位点和保护碱基，通过pcr扩增方法扩出0.74kb的
light chain基因片段和1.46kb的heavy chain基因片段。
[0101]
heavy chain和light chain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavy chain基因和light chain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavy chain和light chain的重组表达质粒。
[0102]
2稳定细胞株筛选
[0103]
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染cho细胞，确定表达质粒活性
[0104]
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
[0105]
包被液稀释amh抗原到1μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa 80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠igg-hrp，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液a液(50μl/孔，含柠檬酸 醋酸钠 乙酰苯胺 过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含柠檬酸 edta
·
2na tmb 浓hcl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含edta
·
2na 浓h2so4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应od仍大于1.0，未加细胞上清孔反应od小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对amh抗原有活性。
[0106]
(2)重组抗体表达质粒线性化
[0107]
准备下述试剂：buffer 50μl、dna 100μg/管、puvⅰ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3m醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
[0108]
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
[0109]
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/l msx 96孔加压培养约25天。
[0110]
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5
×
106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3
×
106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转tpp保种传代。
[0111]
3重组抗体生产
[0112]
(1)细胞扩培
[0113]
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
[0114]
(2)摇瓶生产及纯化
[0115]
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，hyclonetm cell boosttm feed 7a每天流加初始培养体积的3％，
feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/l。第13天收样。用proteina亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性sds-page，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如下图1所示，在还原性sds-page后显示两条带，1条mr为50kd(重链，seq id no:14)，另一条mr为28kd(轻链，seq id no:13)。
[0116]
实施例2
[0117]
抗体的性能检测
[0118]
(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测
[0119]
分析实施例1的抗体(wt)序列，其重链可变区如seq id no:12所示，其中，其中，重链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下：
[0120]
cdr-vh1：g-f-t(x1)-f-s-v(x2)-f-g-m-s；
[0121]
cdr-vh2：t-l(x1)-s-n-g-g-s(x2)-y-t-y-y-p-d(x3)-s-l(x4)-k-g；
[0122]
cdr-vh3：a(x1)-r-h-p-r-v(x2)-n-g-y(x3)-d-g-a-m；
[0123]
其轻链可变区如seq id no:11所示，其中，轻链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下：
[0124]
cdr1-vl：a-s-e(x1)-s-i(x2)-d-n-y-d-l(x3)-s-f-m；
[0125]
cdr-vl2：a-a-s-n-k(x1)-a(x2)-s；
[0126]
cdr-vl3：q-q-s-r(x1)-e-i(x2)-p-w。
[0127]
在实施例1的抗amh抗体(wt)基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，x1、x2、x3、x4均为突变位点。见下表1。
[0128]
表1与抗体活性有关的突变位点
[0129][0130]
对表1中的抗体结合活性检测：
[0131]
包被液(主要成分nahco3)稀释amh抗原到1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa 80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的amh单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠igg-hrp，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(pbs)清洗5次，拍干；加入显色液a液(50μl/孔，含2.1g/l柠檬酸、12.25g/l柠檬酸、0.07g/l乙酰苯胺和0.5g/l过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含1.05g/l柠檬酸、0.186g/ledta
·
2na、0.45g/l tmb和0.2ml/l浓hcl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/edta
·
2na和10.2ml/l浓h2so4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果见下表2。
[0132]
表2 wt抗体及其突变体的活性数据
[0133]
抗体浓度(ng/ml)25012562.531.2515.6250wt1.9521.6211.1820.6500.3600.046突变12.4112.3822.2211.8111.0160.082突变22.452.3832.1671.5030.8560.05突变32.3122.3232.1071.6160.9260.063突变42.3962.0461.8820.9550.8600.146突变50.6530.105
----
突变60.4260.063
----
[0134]
表2数据显示，相较于突变5和突变6来说，wt、突变1至突变4的活性更好，其中，突变1的活性最佳。
[0135]
(2)抗体及其突变体的亲和力检测
[0136]
(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。
[0137]
表3与抗体亲和力有关的突变位点
[0138]
[0139][0140]
亲和力分析
[0141]
利用amc传感器，将纯化出来的抗体用pbst稀释到10ug/ml，amh抗原用pbst进行梯度稀释：45ug/ml、22.5ug/ml、11.3ug/ml、5.60ug/ml、2.80ug/ml、1.40ug/ml、0.70ug/ml。
[0142]
运行流程：缓冲液1(pbst)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(pbst)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mm ph 1.69gly溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。kd表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。结果见下表4。
[0143]
表4亲和力检测数据
[0144]
[0145][0146]
表4数据可以看出，突变1及其系列突变体都具有较好的亲和力，说明在突变1的基础上，按表3的突变方式进行突变得到的抗体均具有较好的亲和力。
[0147]
(b)在wt的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。
[0148]
表5以wt为骨架进行的突变
[0149][0150]
表6 wt抗体及其突变体的亲和力检测结果
[0151] kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)wt2.57e-081.01e 042.60e-04wt 11.56e-082.43e 043.78e-04wt 22.08e-081.82e 043.79e-04wt 31.70e-082.63e 044.48e-04wt 41.51e-082.65e 044.01e-04wt51.30e-082.69e 043.50e-04wt61.78e-082.19e 043.89e-04
[0152]
表6数据显示，wt及其系列突变体都具有不错的亲和力，说明在wt的基础上，按表5的突变方式突变得到的抗体均具有不错的亲和力。
[0153]
(3)裸抗稳定性考核
[0154]
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表7突变1抗体为考核21天的酶免活性检测od结果。
[0155]
表7
[0156]
样品浓度(ng/ml)1001004℃，21天样品1.9850.5280.05-80℃，21天样品1.930.5380.04537℃，21天样品1.9310.5930.051
[0157]
(4)应用性能检测
[0158]
用表3的抗体与另一株amh抗体配对使用，采用双抗体夹心法，在化学发光平台检测特异性达100％，灵敏度达99％-99.8％之间。
[0159]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。