一种可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法

1.本发明属于微生态营养与生理领域，具体地说，涉及一种可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法。


背景技术：

2.动物肠道中栖息着数量庞大复杂多样的微生物菌群，大量研究表明肠道微生物与宿主营养物质代谢、肠道健康及生理状况有密切联系。目前通常采用扩增子测序或宏基因组测序方法来研究动物胃肠道微生物组成及其功能，但这些方法在很大程度上依赖于生物信息学手段，且参考数据库的完善程度决定了分析结果的正确性和精确性，无法从生理、代谢、信号转导等方面深入研究某种细菌的具体作用。
3.基于此，cn201780077207.0公开了一种培养系统，其用于将第1细胞组和由第2细胞组形成的细胞层或组织进行共培养，所述第1细胞组由1种或多种细胞构成，所述第2细胞组由与第1细胞组不同的1种或多种细胞构成，所述培养系统的特征在于具有：将由厌氧性细菌等1种或多种细胞构成的第1细胞组与由第2细胞组形成的细胞层或组织在厌氧条件下进行共培养的第1培养槽，所述第2细胞组由上皮细胞等1种或多种细胞构成；储存需氧状态的培养液的第2培养槽；以连接所述第1培养槽和所述第2培养槽的方式配置的1个或多个物质交换结构；以及，以覆盖所述物质交换结构的第1培养槽侧的表面的方式设置的所述细胞层或组织。
4.在该文件的说明书的第6段记载：肠道细菌为绝对厌氧性的情况较多，且其半数以上是难以培养的，因此多数尚未进行菌的鉴定、特性的确认。因此，与造成肠道细菌的种类、比率变动的外部因素、内部因素的关系也尚未得到准确地把握。
5.该方案的贡献在于，提出了一种较为适宜的共培养设备。
6.everard等人，pnas 110(2013)9066-71；reunanen等人，appl environ microbiol 2015年3月20日公开发表文章认为肠黏膜屏障已经进化了复杂的“肠黏膜免疫系统”用于区分共生菌(即有益菌)与病原菌和其他有害试剂。肠黏膜免疫系统是肠黏膜屏障不可缺少的一部分，包括淋巴组织和特化免疫细胞(即淋巴细胞和浆细胞)，其遍及肠黏膜屏障而广泛分布。天然占据健康对象的黏膜的微生物之一是黏蛋白退化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)，其已经显示出提高肠屏障功能，从而影响与受损的肠屏障功能相关的疾病。
7.此外，cn201910865365.3公开了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的低氧培养方法，该方法主要营造了一种低氧的气体环境，混合气体各成分的体积比为：70～94％n2、1～5％o2、5～25％co2；培养时间为24～36h。
8.该方案的实施例以及对比例证实了，在低氧环境的培养速度高于无氧环境。
9.基于此，本发明所要解决的技术问题是：如何提高嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养速度。


技术实现要素：

10.有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法，该方法可显著提高嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养速度。
11.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法，将传代培养后的猪肠上皮细胞和厌氧菌akkermansia muciniphila在厌氧环境下共培养。
12.在上述的可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法中，所述厌氧菌为商品菌akkermansia muciniphila dsm 22959；所述猪上皮细胞为ipec-j2猪肠上皮细胞。
13.在上述的可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法中，按照感染复数moi＝10的比例接种厌氧菌akkermansia muciniphila至猪肠上皮细胞。
14.在上述的可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法中，培养温度为37℃。
15.在上述的可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法中，培养时间为18-48h；
16.作为对上述方法的进一步优化，本发明的方法包括以下步骤：
17.步骤1、采用分光光度法测定菌液的光密度值；
18.步骤2、采用平板计数法测定菌液浓度；
19.步骤3、通过二者的关联分析快速确定细菌个数；
20.步骤4、将准确计数的微生物接种至提前培养的肠上皮细胞系。
21.可选地，所述步骤1中的采用分光光度法测定菌液的光密度值，具体为：
22.步骤1.1、厌氧水制备：量取1l蒸馏水倒入锥形瓶中，加入1ml质量分数为0.1％刃天青溶液，此时液体呈蓝色；加热煮沸后，迅速用流水冷却，冷却时可用一次性pe手套和橡皮筋将锥形瓶瓶口密封好；然后通co2或n
2 0.5～1h，加入l-半胱氨酸或l-半胱氨酸盐酸盐1g，此时液体呈粉红或黄色；最后再次通气10min，密封小火加热或密封静置10-12h观察到培养基变无色或淡黄色；将配制好的厌氧水，分装至密闭性良好的玻璃瓶中保存；
23.步骤1.2、厌氧培养基的制备：称取38.5g bhi培养基至1l厌氧水中，厌氧水持续通入co2或n2保持其厌氧状态；用玻璃棒快速搅拌，使bhi培养基完全溶解；取厌氧滚管通入co2或n2以排出空气，后用5ml移液枪移取9ml bhi培养基至厌氧管中，保持通气30s，迅速塞上丁基橡胶塞，打好铝盖，制备得到厌氧bhi液体培养基；在制备好的bhi液体培养基中加入0.75～1.5％琼脂制成bhi固体培养基培养基，分装至厌氧瓶中；将分装好的无氧培养基121℃高压灭菌20min，制备得到厌氧bhi固体培养基；
24.步骤1.3、可培养厌氧菌株的复活培养：将保存在冻存管或厌氧管中的菌种从-80℃冰箱中取出，插入冰中解冻，然后按20％的比例接种至上述制备好的厌氧bhi液体培养基，37℃、180r/m震荡培养18-24h；
25.步骤1.4、细菌生长曲线测定：吸取10ml上述复苏菌液接种至90ml装有厌氧bhi液体培养基的厌氧瓶中，37℃、180r/m震荡培养；以未接种的厌氧bhi液体培养基为空白对照，从0h起，每隔2h测定od
600nm
值，取样至48h，每次取样均做3个平行；以od
600nm
值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制得到一条平滑的s型生长曲线。
26.可选地，所述bhi培养基的组成为：1l固体bhi培养基成分为10g胰蛋白胨、17.5g牛心浸粉、5g氯化钠、2g葡萄糖，2.5g磷酸氢二钠，ph值7.4
±
0.2，25℃，加蒸馏水定容至1l、121℃、20min灭菌。
27.可选地，所述步骤2中的采用平板计数法测定菌液浓度，具体为：
28.步骤2.1、平板培养基制备：将步骤1.2中灭菌后的装有厌氧bhi液体培养基的厌氧瓶冷却至45-50℃，用酒精喷洒或擦拭后，与带盖平皿一起放入厌氧工作站，打开站内紫外灯灭菌30min；将平皿盖子稍稍打开，倒入培养基，盖好盖子，轻轻晃动，不要能沾到盖子上，静置1h，使培养基完全凝固且散干水分，判断方式为平板平整、无凸起、无“挂壁”；
29.步骤2.2、菌液光密度测定：在厌氧工作站中，取生长平台期的菌液，用步骤1.2中制备好的无氧bhi液体培养基作为稀释液，按2倍稀释得到1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的菌液，每次取样后，用涡旋仪震荡20s以充分混匀，后用高压灭菌过的移液枪快速加样，加完原液后再加相应体积的bhi培养基；用分光光度计测定上述6个不同稀释梯度菌液的od
600nm
值，每个稀释梯度做3个平行；
30.步骤2.3、稀释涂布法测菌液浓度：在厌氧工作站中，取原液以及1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释梯度的菌液，进行10倍梯度稀释；用于接种的稀释梯度一般为10-6
～10-8
，每个稀释梯度做3个平行；用涡旋仪充分震荡后，迅速取100μl菌液，接种到步骤2.1中制备好的bhi平板上并用涂布棒涂布均匀；接种完后，放置10-30min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，放入厌氧罐和厌氧产气袋或厌氧工作站，37℃培养24-48h后对菌落进行计数；若没有厌氧罐，用pp密封盒或将平板放置在真空袋中，用食品真空机抽去多余气体，构成厌氧环境；
31.步骤2.4、菌落计数：菌落计数：选取菌落数在30～300的平板，利用拍照后使用windows自带画图软件和鼠标计数器软件winometer v1.5。
32.可选地，所述步骤3中的确定菌液浓度与光密度值的关系，具体为：
33.以od
600nm
值为横坐标(x)，菌液浓度为纵坐标(y)，用excel或origin8绘制xy散点图，通过线性拟合得出二者的回归曲线，观察二者是否存在线性关系，r2≥0.8为强相关性。
34.可选地，所述步骤4中的将准确计数的微生物接种至提前培养的肠上皮细胞系，具体为：
35.步骤4.1、猪肠上皮细胞的传代培养：于37℃复苏猪空肠细胞系，利用dmem/f12完全培养基在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养48h，正常传代3次以后方可进行正式实验；
36.步骤4.2、在获得活化的ipec-j2细胞后，首先用胰酶将培养瓶中的ipec-j2消化，然后按照1
×
105个细胞/孔的剂量将细胞接种在12孔板中，利用不含抗生素的dmem/f12完全培养基37℃培养24h用于后续的细菌共培养实验；
37.步骤4.3、提前取出-80℃冻存的可培养厌氧菌株进行扩大培养，18h后测定其od值，利用步骤3建立的标准曲线计算细菌数量；
38.步骤4.4、将含有可培养厌氧菌株的培养液于3000-5000rpm离心5分钟，去除上清，用不含抗生素的dmem/f12培养基重悬备用；
39.步骤4.5、按照moi＝10的剂量将可培养厌氧菌株接种至步骤4.2中的ipec-j2细胞，置于37℃培养。
40.可选地，所述的dmem/f12完全培养基的组成为：在dmem/f12基础培养基的基础上加入10％fbs，5ng/ml egf，10um hepes，1％双抗。
41.与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
42.本发明的共培养方法可显著提高嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养速度，其在厌氧环境下可在24h进入平台期。
附图说明
43.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
44.图1是本发明akkermansia muciniphila的增值曲线与标准曲线；其中，a图为akkermansia muciniphila的生长曲线；b图为不同稀释梯度下akkermansia muciniphila的od值；c图为akkermansia muciniphila od值与菌落数的线性拟合关系；
45.图2是本发明akkermansia muciniphila与猪空肠上皮细胞(ipec-j2)共培养形态(x 200)；其中，左图为正常ipec-j2细胞形态；右图为akkermansia muciniphila与ipec-j2细胞共培养24h后的形态；
46.图3是本发明akkermansia muciniphila对ipec-j2细胞紧密连接相关基因表达量的影响；其中，con为对照组细胞；a-24h表示与akkermansia muciniphila共培养24h后的ipec-j2细胞。*表示差异显著(p《0.05)；**表示差异极显著(p《0.01)。
47.图4是本发明的对比例1的与eggerthella lenta atcc 25559共培养前(con)和共培养24h后(e-24h)细胞的倒置显微镜图谱；
48.图5是本发明的对比例1的与eggerthella lenta atcc 25559共培养前(con)和共培养24h后(e-24h)细胞的紧密连接蛋白基因表达情况。
具体实施方式
49.以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
50.实施例1
51.一种可培养厌氧菌株与猪肠上皮细胞共培养方法，包括以下步骤：
52.步骤1、采用分光光度法测定菌液的光密度(od)值：
53.步骤1.1、厌氧水制备：量取1l蒸馏水倒入锥形瓶中，加入1ml质量分数为0.1％刃天青溶液，此时液体呈蓝色；加热煮沸后，迅速用流水冷却，冷却时可用一次性pe手套和橡皮筋将锥形瓶瓶口密封好；然后通co2或n
2 0.5～1h，加入l-半胱氨酸或l-半胱氨酸盐酸盐1g，此时液体呈粉红或黄色；最后再次通气10min，密封小火加热(不煮沸)或密封静置10-12h可观察到培养基变无色或淡黄色；将配制好的厌氧水，分装至密闭性良好的玻璃瓶中保存。
54.其中，刃天青溶液的制备方法为：称取0.1g刃天青粉末，加蒸馏水定容至100m l4℃储存；刃天青是一种氧化还原指示剂，在缺氧环境下由粉红变为无色，能直观显示细菌培养过程是否达到厌氧标准；l-半胱氨酸或l-半胱氨酸盐酸盐。l-半胱氨酸具有还原性，抗氧化性，能除去水中的氧气分子，降低培养基中的氧化还原电位，为厌氧细菌提供无氧环境。
55.步骤1.2、厌氧培养基的制备：称取38.5g bhi培养基至1l厌氧水中，厌氧水持续通入co2或n2保持其厌氧状态；用玻璃棒快速搅拌，使bhi培养基完全溶解；取厌氧滚管通入co2或n2以排出空气，后用5ml移液枪移取9ml bhi培养基至厌氧管中，保持通气30s，迅速塞上丁基橡胶塞，打好铝盖，制备得到厌氧bhi液体培养基；在制备好的bhi液体培养基中加入0.75～1.5％琼脂制成bhi固体培养基培养基，分装至厌氧瓶中；将分装好的无氧培养基121℃高压灭菌20min，制备得到厌氧bhi固体培养基；
56.其中，bhi培养基的组成为：1l固体bhi培养基成分为10g胰蛋白胨、17.5g牛心浸粉、5g氯化钠、2g葡萄糖，2.5g磷酸氢二钠(na2hpo4)，ph值7.4
±
0.2，25℃，加蒸馏水定容至1l、121℃、20min灭菌。
57.步骤1.3、akkermansia muciniphila的复活培养：将保存在冻存管或厌氧管中的菌种从-80℃冰箱中取出，插入冰中解冻，然后按20％的比例接种至上述制备好的厌氧bhi液体培养基，37℃、180r/m震荡培养18-24h。
58.本发明所用的akkermansia muciniphila选自商品菌akkermansia muciniphila dsm 22959。
59.步骤1.4、细菌生长曲线测定：吸取10ml上述复苏菌液接种至90ml装有厌氧bhi液体培养基的厌氧瓶中，37℃、180r/m震荡培养；以未接种的厌氧bhi液体培养基为空白对照，从0h起，每隔2h测定od
600nm
值，取样至48h，每次取样均做3个平行；以od
600nm
值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制得到一条平滑的s型生长曲线，如图1a所示；
60.步骤2、采用平板计数法测定菌液浓度：
61.步骤2.1、平板培养基制备：将步骤1.2中灭菌后的装有厌氧bhi固体培养基培养基的厌氧瓶冷却至45-50℃，用酒精喷洒或擦拭后，与带盖平皿一起放入厌氧工作站，打开站内紫外灯灭菌30min；将平皿盖子稍稍打开，倒入培养基，盖好盖子，轻轻晃动，不要能沾到盖子上，静置1h，使培养基完全凝固且散干水分，判断方式为平板平整、无凸起、无“挂壁”。平板培养基的凝固方法有两种，其一是将平板逐个摊开凝固；其二是将几个平板叠在一起凝固。前者凝固速度较快，在室温较高时采用；后者凝固速度较慢，可在室温较低时采用，其优点是形成凝固水少，尤其适用于平板划线等。
62.步骤2.2、菌液光密度测定：在厌氧工作站中，取生长平台期的菌液，用步骤1.2中制备好的无氧bhi液体培养基作为稀释液，按2倍稀释得到1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的菌液，每次取样后，用涡旋仪震荡20s以充分混匀，后用高压灭菌过的移液枪快速加样，加完原液后再加相应体积的bhi培养基；用分光光度计测定上述6个不同稀释梯度菌液的od
600nm
值，每个稀释梯度做3个平行，如图1b所示。
63.步骤2.3、稀释涂布法测菌液浓度：在厌氧工作站中，取原液以及1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释梯度的菌液，进行10倍梯度稀释；用于接种的稀释梯度一般为10-6
～10-8
，每个稀释梯度做3个平行。用涡旋仪充分震荡后，迅速取100μl菌液，接种到步骤2.1中制备好的bhi平板上并用涂布棒涂布均匀；接种完后，放置10-30min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，放入厌氧罐和厌氧产气袋或厌氧工作站，37℃培养24-48h后对菌落进行计数；若没有厌氧罐，用pp密封盒或将平板放置在真空袋中，用食品真空机抽去多余气体，构成厌氧环境。
64.步骤2.4、菌落计数：选取菌落数在30～300的平板，利用拍照后使用windows自带画图软件和鼠标计数器软件winometer v1.5(张哲,杨峰,李新圃,等.(2016)基于photoshop和计数软件精准计数平板上菌落的新方法.微生物学通报,7:1646-1648.)手动计数，并计算每毫升菌液中的菌落数。
65.其中，平板涂布的方式并不会对菌落数造成太大影响，但平板培养基的放置时间会对菌落数产生影响，放置时间超过12h可能导致菌落数偏差较大。
66.步骤3、确定菌液浓度与光密度值的关系：以od
600nm
值为横坐标(x)，菌液浓度为纵坐标(y)，用excel或origin 8绘制xy散点图，通过线性拟合得出二者的回归曲线，观察二者
是否存在线性关系；如图1c所示；得到一条akkermansia muciniphila od值与菌落数的线性方程，作为为后续细胞实验确定细菌添加量的依据。
67.步骤4、将准确计数的微生物接种至提前培养的肠上皮细胞系：
68.步骤4.1、猪肠上皮细胞的传代培养：于37℃复苏猪空肠细胞系(ipec-j2)，利用dmem/f12完全培养基在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养48h，正常传代3次以后方可进行正式实验。
69.其中，dmem/f12完全培养基的组成为：在dmem/f12基础培养基的基础上加入10％fbs,5ng/ml egf,10um hepes,1％双抗。
70.步骤4.2、在获得可用的ipec-j2细胞后，首先用胰酶将培养瓶中的ipec-j2消化，然后按照1
×
105个细胞/孔的剂量将细胞接种在12孔板中，利用不含抗生素(双抗)的dmem/f12完全培养基37℃培养24h用于后续的细菌共培养实验。
71.步骤4.3、提前取出-80℃冻存的akkermansia muciniphila进行扩大培养，18h后测定其od值，利用步骤3建立的标准曲线计算细菌数量。
72.步骤4.4、将含有akkermansia muciniphila的培养液于3000-5000rpm离心5分钟，去除上清，用不含抗生素的dmem/f12培养基重悬备用。
73.步骤4.5、按照moi＝10的剂量将akkermansia muciniphila接种至步骤4.2中的ipec-j2细胞，置于37℃培养，取样和培养时间视具体情况而定。
74.步骤5、利用倒置显微镜进行形态学观察，判断akkermansia muciniphila与ipec-j2的共培养情况，检测细菌与细胞是否正常生长，如图2所示，akkermansia muciniphila与ipec-j2细胞共培养24h后，细胞间的连接更加紧密，细胞间的空泡更少。
75.步骤6、利用qpcr技术检测ipec-j2与akkermansia muciniphila共培养后紧密连接蛋白zo-1，occludin，claudin-1的基因表达，检测akkermansia muciniphila是否对肠道上皮细胞的紧密连接有影响。
76.如图3所示，通过倒置显微镜镜检发现，ipec-j2细胞与akkermansia muciniphila共培养24h后，细胞间的连接更加紧密，细胞间的空泡更少；同时，采用real-time pcr方法检测紧密连接蛋白的基因表达量发现，akkermansia muciniphila显著提高ipec-j2细胞中紧密连接zo-1的mrna表达水平(p《0.05)。因此，我们建立的共培养方法证实akkermansia muciniphila可增强猪空肠上皮细胞的物理屏障功能，从而降低细胞通透性，有利于猪的肠道健康。
77.在上述的方法中，对于厌氧菌而言，所有操作过程须高度重视厌氧和无菌，紫外灯须提前0.5～1h打开；对于在实验操作过程中需放入厌氧工作站的物品，提前用75％酒精喷洒表面后再迅速放入站内，可增强灭菌效果。
78.通过对本发明的步骤4.5中孔板内细菌生长速度的测定，其进入平台期的时间为24h左右。
79.该项测试的意义在于：1.采用akkermansia muciniphila和ipec-j2细胞共培养对于akkermansia muciniphila菌的增殖来说是有显著的帮助的；
80.2.本方案采用的是厌氧环境，相比于cn201910865365.3的低氧环境来说，其培养环境更容易控制；相比于cn201910865365.3的厌氧环境来说，本发明的方案的akkermansia muciniphila菌的培养进入平台期的速度也更快。
81.3.本方案为akkermansia muciniphila菌基于ipec-j2猪肠上皮细胞共培养提出了潜在的前景和可能性。
82.对比例1
83.作为对比验证，本对比例采用厌氧细菌标准菌株eggerthella lenta atcc 25559应用于实施例1的4.3-4.5中以替换akkermansia muciniphila。
84.经过实验可发现，该菌与ipec-j2细胞的共培养结果表明：与起始时间点相比，ipec-j2细胞与eggerthella lenta atcc 25559共培养24h后，细胞间的连接无明显改善，细胞间空泡数量没有明显变化(图4)；同时real-time pcr结果(图5)显示，eggerthella lenta atcc 25559显著降低ipec-j2细胞中紧密连接蛋白zo-1的mrna表达水平(p《0.05)，且有降低occludin蛋白mrna表达水平的趋势(0.05《p《0.01)。
85.上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。