一种检测斑点热群立克次体的CDA引物组、试剂盒及其应用的制作方法

一种检测斑点热群立克次体的cda引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测斑点热群立克次体的cda引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia)是专性细胞内的革兰氏阴性杆菌，传播媒介是节肢动物，包括蜱、虱子、螨虫和跳蚤。尽管斑点热群立克次体在自然界中普遍存在，但经常被忽视。
3.斑点热群立克次体导致大量新发和再发传染病，分布在世界各地，威胁人类及家畜的生命健康。目前，中国报告的斑点热群立克次体病例为黑龙江立克次体、劳氏立克次体、斯氏立克次体、埃里希立克次体、西伯利亚立克次体和马斯立克次体。斑点热群立克次体的感染经常发生于沙漠和森林旅游者，林业从业者。斑点热群立克次体的传播发生在受感染蜱的喂养过程中，一旦叮咬皮肤，病原体被树突状细胞吞噬，通过淋巴管转运到局部淋巴结并复制，然后病原体进入血液并传播以感染微循环的内皮，内皮感染会导致血管通透性增加。临床表现出皮疹、发烧、头痛和肌肉痛，严重时会导致间质性肺炎、脑膜脑炎、急性肾损伤、多器官衰竭和死亡。考虑到立克次体及其节肢动物宿主的广泛传播，生活和工作在附近的人存在不可忽视的风险。因此，对于野生环境中的动物和媒介蜱携带的斑点热群立克次体的现场检测在临床实践中是必不可少的，应及时诊断和预防人类感染。
4.目前斑点热群立克次体常用的检测方法主要有血清学检测和分子生物学检测。其中基于聚合酶链反应(pcr)的检测是检测斑点热群立克次体的主要方法，包括常规pcr，嵌套pcr和定量pcr。现有的pcr检测方法反应时间过长，操作繁琐。
5.基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(closed dumbbell mediated isothermal amplification of nucleic acids，cda)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本lamp核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，cda反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统pcr和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，cda还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于斑点热群立克次体的快速诊断。此外，cda所用关键成环引物约为30bp，较lamp中成环引物40bp短，这将极大节省成本。


技术实现要素：

6.本发明的目的是，提供一种检测斑点热群立克次体的cda引物组、试剂盒及其应用。
7.本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
8.一种非疾病诊断目的的检测斑点热群立克次体的cda引物组，所述cda引物组为以
下两对引物，
9.引物对r-f2/r-r2，其中，r-f2的核苷酸序列如seq id no.1所示，r-r2的核苷酸序列如seq id no.2所示；
10.引物对r-mf/r-mr，其中，r-mf的核苷酸序列如seq id no.3所示，r-mr的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11.本发明还提供一种检测斑点热群立克次体的试剂盒，所述试剂盒包括上述的cda引物组。
12.作为优选实施方案，所述cda引物组中，引物r-f2与r-r2的浓度均为0.2～0.4μm，引物r-mf与r-mr的浓度均为1～2μm。
13.作为优选实施方案，所述试剂盒还包括bst聚合酶、cda反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
14.作为优选实施方案，所述显色剂选自sybr green i、eva green、羟基萘酚蓝、铬黑t中的一种。
15.作为优选实施方案，所述cda反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和triton x-100。
16.作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
17.2-50mm tris-hcl ph8.8
18.2-20mm kcl
19.2-20mm(nh4)2so420.2～20mm mgso421.0.1～0.5％tritonx-100
22.0.2～1m甜菜碱
23.1～1.6mm dntp
24.5～10u bst dna聚合酶
25.100～150μmol/l显色剂
26.0.2～0.4μm引物r-f2
27.0.2～0.4μm引物r-r2
28.1～2μm引物r-mf
29.1～2μm引物r-mr；
30.反应溶剂为超纯水。
31.本发明还提供所述的试剂盒非疾病诊断目的的检测斑点热群立克次体的方法，包括以下步骤：
32.步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
33.步骤2，上述制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有斑点热群立克次体。
34.本发明还提供所述的cda引物组在非疾病诊断目的的斑点热群立克次体检测中的应用。
35.本发明还提供所述的试剂盒在非疾病诊断目的的斑点热群立克次体检测中的应用。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
37.1、本发明提供的cda引物组是通过对斑点热群立克次体的特异保守区域(genbank:mk304548.1)进行设计并筛选出扩增效果好的引物组，由4条引物组成，包括序列内引物对(r-mf/r-mr)和外引物对(r-f2/r-r2)。r-f2/r-r2分别为上下游外部引物，由f2区组成，并与靶基因的f2c区域互补。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的斑点热群立克次体。具体核苷酸序列如下表1所示：
38.表1引物序列
39.序列号引物名称核苷酸序列seq id no.1r-f2actttaacttaacaggcagcseq id no.2r-r2cgtaccttttgcgttaacseq id no.3r-mftccctacaacaacttcacgaatggcggtseq id no.4r-mrtgcggctaattaaacttgtagcacctgc
40.2、由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，cda扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。
41.3、本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对斑点热群立克次体的快速准确检测，因此，适用于疫情现场的初级卫生防疫和病原筛查。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，可实现对斑点热群立克次体快速准确的检测。
附图说明
42.图1为本发明实施1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
43.图2为本发明实施2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
44.图3为本发明实施3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
45.图4为本发明实施4中应用hnb进行反应基于颜色变化的终点监测图。
46.图5为本发明实施5中应用hnb进行反应基于颜色变化的终点监测图。
具体实施方式
47.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
48.实施例1应用eva green验证对斑点热群立克次体基因组dna片段的扩增反应
49.eva green同sybr green i类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，eva green发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，eva green的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。
50.反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
51.20mm tris-hcl ph8.8
52.10mm kcl
53.10mm(nh4)2so454.14mm mgso455.0.1％triton x-100
56.1m甜菜碱
57.1.25mm dntp
58.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
59.1x eva green(biotum)
60.引物：
61.200nm r-f2(seq id no.l所示)
62.200nm r-r2(seq id no.2所示)
63.1600nm r-mf(seq id no.3所示)
64.1600nm r-mr(seq id no.4所示)
65.靶:斑点热群立克次体基因组dna dsdna(seq id no.5所示)
66.同时设置无靶的对照组。
67.设置slan 96 real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。图1结果表明：本发明提供的引物组可实现对斑点热群立克次体特异保守区域的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
68.实施例2应用eva green验证对斑点热群立克次体提取基因组的扩增反应
69.方法同实施例1。
70.反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
71.20mm tris-hcl ph8.8
72.10mm kcl
73.10mm(nh4)2so474.14mm mgso475.0.1％triton x-100
76.1m甜菜碱
77.1.25mm dntp
78.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
79.1x eva green(biotum)
80.引物：
81.200nm r-f2(seq id no.l所示)
82.200nm r-r2(seq id no.2所示)
83.1600nm lm-mf(seq id no.3所示)
84.1600nm lm-mr(seq id no.4所示)
85.靶:斑点热群立克次体提取基因组dna
86.同时设置无靶的对照组。
87.设置slan 96 real time pcr反应温度恒定为60℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。图2结果表明：本发明提供的引物组可实现对斑点热群立克次体提取基因组的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
88.实施例3应用eva green验证斑点热群立克次体cda引物组对多种细菌提取基因组的扩增反应
89.方法同实施例1。
90.反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
91.20mm tris-hcl ph8.8
92.10mm kcl
93.10mm(nh4)2so494.14mm mgso495.0.1％triton x-100
96.1m甜菜碱
97.1.25mm dntp
98.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
99.1x eva green(biotum)
100.引物：
101.200nm r-f2(seq id no.l所示)
102.200nm r-r2(seq id no.2所示)
103.1600nm r-mf(seq id no.3所示)
104.1600nm r-mr(seq id no.4所示)
105.靶核酸1:斑点热群立克次体dna片段(序列如seq id no.5所示)靶核酸2:斑点热群立克次体提取基因组dna，设置为阳性对照
106.靶核酸3：无形体提取基因组dna，设置为阴性对照
107.靶核酸4：肺炎克雷伯菌提取基因组dna，设置为阴性对照
108.靶核酸5：铜绿假单胞菌提取基因组dna，设置为阴性对照
109.同时设置无靶的对照组。
110.设置slan 96 real time pcr反应温度恒定为60℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图3所示，其中，立克次体dna1和立克次体dna2是来源于不同地点的病原，通过同样的提取方法所得到的立克次体dna基因组。图3结果表明：本发明提供的引物组可区分斑点热群立克次体和无形体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌，进一步说明了本发明提供的cda引物组的特异性。
111.实施例4应用羟基萘酚兰(hnb)进行斑点热群立克次体cda扩增反应终点监测
112.羟基萘酚兰(hnb)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
113.应用羟基萘酚兰(hnb)进行斑点热群立克次体cda扩增的反应溶液的组合如下面所示。
114.反应溶液组合如下，其余加入ddh2o至25μl
115.20mm tris-hcl ph8.8
116.10mm kcl
117.10mm(nh4)2so4118.14mm mgso4119.0.1％triton x-100
120.1m甜菜碱
121.1.25mm dntp
122.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
123.120μm hnb
124.引物：
125.200nm r-f2(seq id no.l所示)
126.200nm r-r2(seq id no.2所示)
127.1600nm r-mf(seq id no.3所示)
128.1600nm r-mr(seq id no.4所示)
129.靶核酸:斑点热群立克次体提取基因组dna。扩增反应设置8个阳性对照和8个阴性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为60℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图4所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：将hnb应用于其中可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
130.实施例5应用羟基萘酚兰(hnb)验证斑点热群立克次体cda引物组对多种细菌提取基因组的扩增反应终点监测
131.羟基萘酚兰(hnb)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
132.应用羟基萘酚兰(hnb)进行斑点热群立克次体cda扩增的反应溶液的组合如下面所示。
133.反应溶液组合如下，其余加入ddh2o至25μl
134.20mm tris-hcl ph8.8
135.10mm kcl
136.10mm(nh4)2so4137.14mm mgso4138.0.1％triton x-100
139.1m甜菜碱
140.1.25mm dntp
141.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
142.120μm hnb
143.引物：
144.200nm r-f2(seq id no.l所示)
145.200nm r-r2(seq id no.2所示)
146.1600nm r-mf(seq id no.3所示)
147.1600nm r-mr(seq id no.4所示)
148.靶核酸1:斑点热群立克次体合成dna(序列如seq id no.5所示)
149.靶核酸2:斑点热群立克次体提取基因组dna，设置为阳性对照
150.靶核酸3：无形体提取基因组dna，设置为阴性对照
151.靶核酸4：肺炎克雷伯菌提取基因组dna，设置为阴性对照
152.靶核酸5：铜绿假单胞菌提取基因组dna，设置为阴性对照
153.扩增反应各设置8个。设置恒温水浴锅反应温度恒定为60℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图5所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：本发明提供的cda引物组可区分斑点热群立克次体和无形体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌，应用hnb的体系可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读，进一步说明了本发明cda引物组的特异性。
154.上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。